مقالة منهجية

تحديد كمية بشرية فيروس نوروفيروس مثل الجسيمات ملزمة لبكتيريا كومينسال باستخدام تدفق قياس الخلايا

DOI:

10.3791/61048

⸱

أبريل 29, 2020

 , 
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد كمية ملزمة من الممرض eukaryotic فيروس النورو البشري للبكتيريا. بعد إجراء قياس أولي لارتباط بكتيريا الفيروسات ، يتم استخدام قياس الخلايا للتدفق للكشف عن البكتيريا المرتبطة بالفيروسات داخل السكان.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا commensal راسخة بشكل جيد للتأثير على عدوى الفيروسات eukaryotic. الربط المباشر بين العامل الممرض والميكروبيوم المضيف هو المسؤول عن تغيير العدوى للعديد من هذه الفيروسات. وبالتالي ، فإن توصيف طبيعة ربط البكتيريا الفيروسية هو خطوة أساسية ضرورية لتوضيح الآلية (الآليات) التي تغير بها البكتيريا العدوى الفيروسية. لفيروس النورو البشري، تعزز البكتيريا commensal عدوى الخلايا B. يرتبط الفيروس مباشرة بهذه البكتيريا ، مما يشير إلى أن هذا التفاعل المباشر يشارك في آلية تعزيز العدوى. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات لقياس التفاعلات بين البكتيريا والفيروسات بما في ذلك عد التألؤ للفيروسات ذات العلامات الإشعاعية ورد فعل سلسلة البوليمرات (PCR). كلا الأسلوبين تتطلب استخدام الفيروس الحي، والتي قد تحتاج إلى توليد في المختبر. وفي الوقت الراهن، لا يوجد أي من النظم الراسخة في مجال الثقافة المختبرية المتاحة لفيروس النورو البشري قوية بما يكفي للسماح بتوليد مخزونات فيروسية شديدة التركيز. وبدلاً من الفيروس الحي، استُخدمت جسيمات شبيهة بالفيروسات لتوصيف التفاعلات بين الفيروس النوروي والبكتيريا. هنا يتم وصف طريقة قياس الخلايا التدفق مع يستخدم الأجسام المضادة فيروس محددة لتحديد VLP ملزمة للبكتيريا السلبية غرام وإيجابية غرام. إدراج كل من البكتيريا فقط وضوابط isotype سمح لتحسين الفحص للحد من الخلفية الأجسام المضادة ملزمة والقياس الكمي الدقيق للتعلق VLP إلى البكتيريا التي تم اختبارها. ارتفاع VLP: نسب البكتيريا تؤدي إلى VLPs ملزمة لنسب كبيرة من السكان البكتيرية. ومع ذلك، عندما يتم تقليل كميات VLP، في المئة من البكتيريا ملزمة يقلل أيضا. في نهاية المطاف، يمكن استخدام هذه الطريقة في التجارب المستقبلية توضيح الشروط المحددة والمكونات الهيكلية التي تنظم نوروفيروس: التفاعلات البكتيرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفيروسات النوروالبشرية (HuNoVs) هي السبب الرئيسي لمرض الجهاز الهضمي في جميع أنحاء العالم، ومسؤولة عن 685 مليون عدوى وأكثر من 200،000 حالة وفاة كل عام1. كما هو الحال مع الفيروسات المعوية الأخرى ، وقد ثبت وجود البكتيريا commensal لتعزيز العدوى من هذا العامل الممرض وكذلك فيروسها البديل ، نوروفيروس المورين2،3. وهناك أيضا تقارير متضاربة أن البكتيريا قد تمنع العدوى من قبل نوروفيروس الإنسان4,5,5,6. بالنسبة للعديد من الفيروسات ، يبدو أن التفاعل المباشر بين الفيروس والبكتيريا يكمن وراء الآليات التي تؤثر على العدوى الفيروسية2،7،8،9،10، وقد ثبت من خلال المجهر الإلكتروني أن نوروفيروسات الإنسان ترتبط مباشرة بأسطح البكتيريا11،12. لذلك ، أصبح توصيف هذه التفاعلات أمرًا حاسمًا لتحديد الآليات التي تؤثر بها البكتيريا على العدوى الفيروسية. وقد بدأ هذا الوصف كلاسيكيا مع تحديد الربط الفيروسي لمجموعة من الأنواع البكتيرية التي هي مكونات الميكروبيوم المضيف7،12،13. هذه الملحقات لا تكشف فقط عن كمية الفيروس المرتبطة بالبكتيريا، ولكن أيضا تساعد في تحديد تأثير هذا التفاعل على اللياقة البدنية الفيروسية والبقاء على قيد الحياة.

ولتحديد التعلق الفيروسي كمياً، تشمل الأساليب المستخدمة تقليدياً المقالات القائمة على الـ PCR التي تحدد الجينوم الفيروسي12 أو توليد الفيروس المسمى إشعاعياً واستخدام عد التلألؤ لتحديد الجسيمات الفيروسية7،,8،,9،,13. ويتطلب استخدام هذه الأساليب عموماً الحصول على مخزونات الفيروسات العالية التيتر وتقنيات الزراعة المختبرية التي يمكن من خلالها توليدها. في حين أن العديد من النظم الثقافية لفيروس النورو البشري موجودة الآن2,14,15, لا شيء يدعم النسخ المتماثل القوي المطلوب لتوليد هذه المخزونات عالية التركيز الذي يقيد أو يلغي استخدام PCR والعد التلألؤ لتحديد التفاعلات البشرية النوروفيروس / البكتيرية.

للتحايل على هذه المشكلة، يمكن استخدام الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLPs) كبديل للفيروس الحي للتحقيق في التفاعلات بين فيروس النورو البشري والبكتيريا16،17. VLPs هي جسيمات غير معدية تشبه إلى حد كبير الفيروس الذي تستمد منه. في حالة نوروفيروس الإنسان، يتم إنشاء هذه الجسيمات من التعبير عن بروتين VP1 (وأحيانا VP2)، والتي تتجمع ذاتيا لخلق الكبقية الفيروسية سليمة تفتقر إلى المواد الوراثية (أي الجيش الملكي النيبالي للفيروسات النورو). وقد تم وصف هذه VLPs بشكل جيد، هي هيكليا ومضادة مماثلة للفيروسات البرية من النوع الذي يتم اشتقاقها18،19،20،21،22،23. لذلك ، تعمل VLPs كبديل مثالي للتحقيق في التفاعلات السطحية بين فيروس النورو البشري والبكتيريا الكوميدية. وبالنظر إلى أن هذه المواد تفتقر إلى المواد الوراثية، لا يمكن استخدام المقالات القائمة على الأنبير المبايض لتحديد كمية الربط الفيروسي. تم وصف طريقة قياس الخلايا المتدفقة المستندة إلى الأجسام المضادة سابقًا وقادرة على اكتشاف مستويات منخفضة من VLP ملزمة للبكتيريا بطريقة شبه كمية16. تم تحسين هذه الطريقة للسماح للتقدير الكمي الدقيق لفيروس النورو VLP البشري ملزمة لكل من البكتيريا commensal السلبية والغرام إيجابية16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: شروط النمو البكتيرية المبينة في البروتوكول هي شروط الثقافة القياسية لكلواكات Enterobacter وLactobacillus gasseri. لأداء الفيروس: البكتيريا التعلق بالقياس مع الأنواع البكتيرية الأخرى، وينبغي أن تكون البكتيريا المختارة المستزرعة في ظل ظروف قياسية مناسبة للبكتيريا.

1. إعداد المتوسط النمو البكتيري

  1. Enterobacter cloacae وسائل الإعلام النمو
    1. إعداد متوسطة السائل عن طريق إذابة 10 غرام من التربون، 5 غرام من استخراج الخميرة و 10 غرام من كلوريد الصوديوم (NaCl) في 1 لتر من المياه de-Ionized (DI) (انظر جدول المواد). مزيج جميع وسائل الإعلام بدقة وتعقيم عن طريق الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة.
    2. إعداد المتوسطة الصلبة عن طريق إذابة 10 غرام من التربون، 5 غرام من استخراج الخميرة، 10 غرام من NaCl، و 15 غرام من أجار في 1 لتر من مياه DI. مزيج جميع وسائل الإعلام بدقة وتعقيم عن طريق الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة.
  2. Lactobacillus gasseri وسائل الإعلام النمو
    1. إعداد المتوسطة السائلة عن طريق حل 55 غرام من دي مان، روجوسا وشارب (MRS؛ انظر جدول المواد)مسحوق في 1 لتر من الماء DI. استخدام المتوسطة في غضون شهر واحد من التحضير. للتعقيم، قم بتسخين الحرارة لمدة 15 دقيقة حتى يغلي متبوعاً بالأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة.
    2. إعداد المتوسطة الصلبة عن طريق حل 55 غرام من مسحوق MRS و 15 غرام من أجار في 1 L من الماء DI. للتعقيم، قم بتسخين الحرارة لمدة 15 دقيقة حتى يغلي متبوعاً بالأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة.

2. إنشاء منحنى قياسي ربط الكثافة البصرية (OD) وتركيز البكتيريا

  1. Inoculate 5 مل من الوسط السائل المناسب مع مستعمرة واحدة معزولة من لوحة أجار(E. cloacae)أو مباشرة من مخزون الجلسرين المجمدة(L. gasseri).
  2. تنمو البكتيريا بين عشية وضحاها، في ظل الظروف الجوية المناسبة(Enterobacter cloacae:37 درجة مئوية مع اهتزاز الهوائية في 200 دورة في الدقيقة؛ L. gasseri: 37 درجة مئوية حمام مائي مع عدم وجود اهتزاز في وعاء محكم الإغلاق).
  3. نقل 2 × 1.3 مل aliquots من الثقافة بين عشية وضحاها إلى اثنين من أنابيب الطرد المركزي منفصلة 1.5 مل وبكتيريا الطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 5 دقيقة.
  4. إزالة عينات supernatant وغسل مع 1 مل من الفوسفات المعقم 1x المالحة المخزنة مؤقتا (PBS). كرر هذه الخطوة غسل لما مجموعه 2 يغسل.
  5. طرد العينات مرة أخرى في 10،000 × ز لمدة 5 دقيقة، وإزالة supernatant وإعادة تعليق في 1.3 مل من 1x PBS المعقمة.
  6. بدءا من 0.5 مل من الثقافة غسلها، تمييع البكتيريا بشكل متسلسل في 1x PBS من10-1 إلى10-4.
  7. باستخدام مقياس الطيف، قياس الكثافة البصرية للثقافة غسلها، غير مخفف ة وكل من التخفيفات الأربعة في 600 نانومتر (OD600).
  8. تنفيذ 10 أضعاف التخفيف اتّصال المسلسل في 1x PBS لكل تخفيف من الخطوة 2.6. نشر لوحة 100 ميكرولتر من آخر 3 تخفيفات لكل سلسلة على وسط صلب مناسب لتحديد عدد وحدات تشكيل المستعمرة لكل ملليلتر (CFU /mL) من كل عينة. لوحة كل تخفيف في ثلاثية.
  9. السماح لللوحات لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقيقة. عكس لوحات واحتضان في ظل الظروف الجوية المناسبة(E. cloacae:الهوائية في 37 درجة مئوية، لوحات احتضان بين عشية وضحاها؛ L. gasseri: اللاهوائية في 37 درجة مئوية، لوحات احتضان لمدة 48 ساعة في وعاء محكم مع أكياس الهواء anerobic (انظر جدول المواد)).
    ملاحظة: استخدم كيس هواء لاهوائي واحد لكل جرة 2.5 لتر أو 3 أكياس لكل جرة 7.0 لتر (انظر جدول المواد).
  10. استخدام عدد لوحات لتحديد CFU / مل لكل عينة من 5 عينات (أي غير مخففة ، 10-1، 10-2، 10-3، 10-4). إنشاء منحنى قياسي مقارنة OD600 مقابل CFU / mL. سيتم استخدام معادلة هذا الخط في مسطرة مرفق VLP-bacteria لتحديد CFU/mL استنادًا إلى OD600.

3. VLP-بكتيريا المرفق Assay

تنبيه: فيروس النورو البشري هو خطر على مستوى السلامة البيولوجية (BSL)-2 وينبغي تنفيذ جميع الأعمال التي تنطوي على VLPs في خزانة السلامة البيولوجية. إعداد الثقافات البكتيرية ، قبل فحص المرفق ، يجب أن يتم باستخدام ظروف السلامة المناسبة للكائن الحي.

  1. إعداد الكاشف
    1. 1x الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (PBS)
      1. إعداد 1 L من 10x PBS عن طريق حل حزمة كاملة في 1 L من مياه DI.
      2. حل الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة.
      3. إعداد حل 1x عن طريق تخفيف الحل المذكور أعلاه 1:10 في مياه DI.
      4. قم بتعقيم المحلول عن طريق تمريره من خلال فلتر 0.22 ميكرومتر وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
    2. 5% BSA
      1. إضافة 5 غرام من مسحوق مصل البقري (BSA) إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني لتوليد 5٪ (ث / v) الحل.
      2. مزيج الحل عن طريق الدوامة أو على لوحة اثارة باستخدام شريط اثارة معدنية حتى تذويب كتل.
      3. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون.
      4. تخزين الحل في 4 درجة مئوية.
    3. تدفق العازلة وصمة عار القياس الخلوي (FCSB)
      1. تصفية FCSB التي تم شراؤها (انظر جدول المواد)من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
      2. تخزين الحل المتبقي في 4 درجة مئوية.
    4. 5% حظر المخزن المؤقت (BB)
      ملاحظة: إعداد جديدة في كل مرة.
      1. أضف 0.5 غرام من BSA إلى 10 مل من FCSB المعقم.
      2. دوامة لخلط العينة تماما وترك على الجليد حتى الاستخدام.
  2. اقتران الأجسام المضادة
    1. اقتران الإنسان نوروفيروس GII الأجسام المضادة (انظر جدول المواد)مع r-phycoerythrin (PE) باستخدام مجموعة تسمية الأجسام المضادة R-PE وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    2. تخزين الأجسام المضادة الزوجية في الظلام في 4 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل في تحليل فحص المرفق VLP-بكتيريا.
      ملاحظة: يجب أن يتم ترفيع الأجسام المضادة الأولية قبل استخدامها في فحص مرفق VLP-bacteria لتحديد التركيز المناسب اللازم لتحليل قياس الخلايا المتدفق. يجب إجراء المعايرة المضادة في كل مرة يتم فيها إجراء رد فعل الاقتران ولكل بكتيريا مستخدمة في مقاهي المرفق.
  3. معايرة الأجسام المضادة
    1. تمييع الأجسام المضادة للفيروس النوروي المترافقة GII 100 ضعف ، مع تخفيف يبدأ من 1:100 وتخفيف نهاية 1:600 (ستة تخفيفات في المجموع).
    2. إجراء معاينة مرفق الفيروس كما هو موضح أدناه مع الاستثناء التالي: في الخطوة 3.5.7 إعادة تعليق بيليه البكتيري ة في 350 ميكرولتر من 5٪ BB.
    3. تقسيم العينة إلى سبعة 50 ميكرولتر aliquots.
    4. أضف 50 ميكرولتر من كل تخفيف للأجسام المضادة إلى أنبوب واحد.
    5. أضف 50 ميكرولتر من 5٪ BB إلى الأنبوب السابع كعنصر تحكم غير ملطخ.
    6. إجراء قياس خلايا التدفق على جميع العينات كما هو موضح أدناه.
    7. قارن عينات الأجسام المضادة المخففة بعناصر التحكم غير الملطخة وببعضها البعض. وينبغي اختيار أدنى تركيز للجسم المضاد الذي لا يؤدي إلى انخفاض أو فقدان الإشارة الإيجابية للاستخدام في المقالات اللاحقة.
  4. إعداد البكتيريا
    1. تنمو البكتيريا في 40 مل من الوسط السائل المناسب في ظل الظروف الجوية المناسبة حتى البكتيريا في مرحلة ثابتة.
      1. تنمو E. الثقافات cloacae هوائيا بين عشية وضحاها في لوريا مرق في 37 درجة مئوية، تهتز في 200 دورة في الدقيقة للوصول إلى مرحلة ثابتة.
      2. تنمو L. ثقافات gasseri في مرق MRS في أنابيب غطاء المسمار الأسود دون اهتزاز في حمام مائي تعيين إلى 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة للوصول إلى مرحلة ثابتة.
    2. نقل الثقافات المرحلة الثابتة لتنظيف 50 مل أنابيب مخروطية وعينات أجهزة الطرد المركزي في 2288 × ز لمدة 10 دقيقة لبيليه البكتيريا.
    3. إزالة supernatant وإعادة تعليق في 13 مل من 1x PBS العقيمة. كرر هذه الخطوة غسل لما مجموعه اثنين من يغسل.
    4. طرد العينات مرة أخرى، وإزالة عينات supernatant وإعادة تعليق في 20 مل من 1x PBS.
      ملاحظة: إذا كانت بيليه الخلية صغيرة، يمكن تقليل حجم إعادة التعليق.
    5. قياس OD600 من الثقافة.
    6. باستخدام المنحنى القياسي الذي تم إعداده مسبقًا ، حدد CFU لكل مل من الثقافة المغسولة.
    7. تمييع البكتيريا حسب الحاجة مع 1x PBS لضبط تركيز الثقافة إلى 1 × 108 CFU / مل.
    8. نقل 1 مل من 1 × 108 CFU / mL الثقافة البكتيرية إلى العدد المطلوب من 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي.
    9. طرد مركزي الأنابيب في 10،000 × ز لمدة 5 دقيقة.
    10. إعادة تعليق بيليه البكتيرية في 1 مل من المعقم 5٪ BSA.
    11. احتضان الأنابيب لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع دوران مستمر.
  5. مرفق الفيروسات
    1. العمل داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية BSL-2، إضافة 10 ميكروغرام من VLPs HuNoV (انظر جدول المواد)إلى كل أنبوب يحتوي على البكتيريا التي أعيد تعليقها في برنامج تلفزيوني وتخلط تماما عن طريق الأنابيب.
      ملاحظة: يختلف تركيز VLP مع كل إعداد VLP. لذلك ، فإن الحجم المضاف إلى البكتيريا يختلف بين دفعات التحضير ويجب تعديله وفقًا لذلك بحيث يتم إضافة 10 ميكروغرام إلى كل أنبوب في التجربة. بالنسبة لعناصر التحكم في البكتيريا فقط (على سبيل المثال، عينات بدون VLP)، أضف حجم PBS يساوي حجم VLP المضاف إلى العينات التجريبية.
    2. أنابيب الاحتضان لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية مع دوران مستمر.
      ملاحظة: يتم استخدام مسدس أنبوب (انظر جدول المواد)تعيين إلى 40 دورة في الدقيقة أثناء الحضانة.
    3. بعد الحضانة، طرد مركزي العينات في 10،000 × ز لمدة 5 دقيقة.
    4. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه البكتيرية في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    5. كرر خطوات الغسيل 3.5.3 و 3.5.4.
    6. طرد العينات في 10،000 × ز لمدة 5 دقيقة.
    7. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه البكتيرية في 150 ميكرولتر من 5٪ BB.
  6. تلطيخ الأجسام المضادة
    1. إعداد جديدة 5٪ BB.
      ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الأعمال باستخدام الأجسام المضادة الموسومة بفلورية في الظلام وينبغي الاحتفاظ بالأجسام المضادة وBB و FCSB على الجليد.
    2. تمييع الإنسان نوروفيروس GII الأجسام المضادة 1:125 لعينات E. cloacae و 1:150 لعينات ل. gasseri في BB 5٪، وإعداد 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة لكل عينة.
    3. تم تخفيف الجسم المضاد ذي النمط الإيزوتاي بالطريقة نفسها تم تخفيف الأجسام المضادة للفيروس النوروي البشري GII لكل بكتيريا في BB 5٪، وإعداد 50 ميكرولتر من التحكم في النمط الإيزوتاي المخفف لكل عينة.
    4. تقسيم كل عينة معاينة المرفق من الخطوة 3.3.7 إلى ثلاثة aliquots 50 ميكرولتر عن طريق نقلها إلى أنابيب الطرد المركزي نظيفة 1.5 مل.
    5. إلى المجموعة الأولى من العينات، أضف 50 ميكرولتر من BB. ستكون هذه المجموعة عناصر التحكم غير الملطخة (Uns).
    6. إلى المجموعة الثانية، أضف 50 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة GII. هذا يؤدي إلى تركيز الأجسام المضادة النهائي من 1:250 لE. cloacae و 1:300 ل. gasseri. ستكون هذه المجموعة عينة عينات ملطخة (AB).
    7. إلى المجموعة الثالثة، أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة ذات النمط الإيزوتايالمخفف. ستكون هذه المجموعة عناصر تحكم isotype (IC). مزيج جيدا عن طريق الأنابيب. احتضان العينات على الجليد وفي الظلام لمدة 30 دقيقة.
    8. الطرد المركزي جميع العينات في 10،000 × ز لمدة 5 دقيقة.
    9. تخلص من supernatant وإعادة تعليق العينات في 100 ميكرولتر من FCSB.
    10. الطرد المركزي جميع العينات في 10،000 × ز لمدة 5 دقيقة. التخلص من supernatant وإعادة تعليق العينات في 100 ميكرولتر من FCSB.
    11. الطرد المركزي جميع العينات في 10،000 × ز لمدة 5 دقيقة.
    12. تخلص من supernatant وإعادة تعليق العينات في 150 ميكرولتر من FCSB.
    13. نقل كل عينة إلى أنبوب FCSB يحتوي على 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FCSB لحجم إجمالي قدره 550 ميكرولتر.
    14. احتفظ بالعينات عند درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى يتم تحليلها بواسطة قياس خلايا التدفق.
      ملاحظة: يتم إجراء قياس الخلايا التدفق في غضون 4 ح من تلطيخ الأجسام المضادة.

4. تدفق قياس الخلايا

ملاحظة: تستند إعدادات الجهد الموضحة أدناه إلى مقياس التدفق الخلوي والبرامج المدرجة في جدول المواد ومن المرجح أن تختلف مع مقاييس التدفق الخلوي المختلفة. يجب تحسين الإعدادات لكل بكتيريا. تأكد من أن المحاور لكافة الرسوم البيانية في مرحلة ثنائية الأسي.

  1. إعداد مساحة العمل
    ملاحظة: يختلف إعداد المؤامرات المستخدمة لإنشاء مساحة العمل عن تلك المستخدمة في الجاتينغ وتحليل البيانات. الغرض من إعداد مساحة العمل هو تصور عدد الخلايا ، وضمان عدم وجود تكتل مفرط للخلايا البكتيرية التي قد تؤثر على تحليل المصب والتمييز بين الخلايا الملطخة وغير الملطخة أثناء جمع البيانات.
    1. من أجل ضمان البكتيريا ليست تتجمع معا، وإعداد سلسلة من المؤامرات كثافة.
      1. إنشاء منطقة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) مقابل منطقة مبعثر الجانب (SSC-A) لتصور إجمالي السكان.
      2. قم بإعداد المؤامرات لتقييم الخلايا المفردة مقابل كتل الخلايا عن طريق إنشاء بيانين بيانيين يقارنان كلاً من العرض الأمامي (FSC-W) وعرض مبعثر الجانب (SSC-W) إلى الأمام (FSC-H) وارتفاع مبعثر الجانب (SSC-H)، على التوالي.
      3. إنشاء مؤامرة تعرض فقط المحتوى الإيجابي PE (PE-A مقابل SSC-A).
    2. تعيين الجهد الأساسي إلى 500 لE. cloacae و 340 ل. gasseri. وسيتم تعديل هذه الزيادة في وقت لاحق.
    3. تعيين إجمالي الأحداث التي تم حسابها إلى 10,000 حدث.
  2. تشغيل العينات
    1. إنشاء ثلاث قطع منفصلة الرسم البياني التي تظهر عدد تآمرضد SSC-A، FSC-A أو PE-A.
    2. ضع عينة غير ملطخة على مقياس التدفق الخلوي واكتسب أحداث العينة، مع التأكد من أن الحد الأقصى للذروة في الرسم البياني لـ SSC-A هو في حدود 102 إلى 103 والذروة القصوى على الرسم البياني لـ FSC-A بين 104 إلى 105 على المحور س. إذا لم يكن كذلك، قمم لا تقع ضمن نطاقات محددة، وضبط الفولتية FSC وSSC وفقا لذلك.
    3. ضع عينة ملطخة (AB) على مقياس التدفق الخلوي وضبط الجهد PE لجعل الذروة القصوى بعد 103 على المحور س.
    4. استنادًا إلى هذه القياسات، قم بتعيين بوابة PE الإيجابية وتعيين البوابة على الرسم البياني للكثافة PE-A مقابل SSC-A.
    5. تشغيل كافة العينات تحت الإعدادات المحددة بسرعة منخفضة أو متوسطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وترد استراتيجيات الجاتينغ المستخدمة لتحديد كمية فيروس النوروفيروس VLP البشري ملزمة للبكتيريا commensal في الشكل 1. توفر نقطة الكثافة التمثيلية نظرة عامة على كيفية بوابات العينات لإزالة الحطام الخلوي وكتل الخلايا بحيث تم تحديد مرفق VLP على مجموعات مفردة(الشكل 1A). توضح المخططات البيانية التمثيلية مستويات منخفضة من إشارة الأجسام المضادة المضادة للنوروفيروس المضادة في البكتيريا فقط عينات تفتقر إلى VLP نوروفيروس وإشا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على تحديد كمية ربط الفيروسات المعوية للبكتيريا هي خطوة أولى حاسمة لتوضيح الآليات التي تغير بها هذه البكتيريا العدوى الفيروسية. وقد تم تحسين الطرق المذكورة هنا لقياس التفاعلات فيروس النورو VLP البشري مع كل من E. cloacae (البكتيريا السلبية غرام) وL. gasseri (بكتيريا إيجابية غرام)، ولكن يمكن تكييفها للاستخدام مع أي فيروس الثدييات والبكتيريا ذات الأهمية. في حين أن VLPs هي بديل مثالي للفيروس الحي للاستخدام في المقايسات المرفقة ويمكن قياس هذه الجسيمات بسهولة باستخدام قي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر سوتونوكا بهار وشانيل موسبي-هاوندروب على مراجعتهما النقدية للمخطوطة المكتوبة، وكذلك ألفونسو كاريلو للمساعدة في توليد منحنيات قياسية بكتيرية. ويتم تمويل هذا العمل جزئياً من منحة مقدمة من المعهد الوطني للصحة (R21AI140012) ومنحة أولية من جامعة فلوريدا، معهد الأغذية والعلوم الزراعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

5 الخلوي يستخدم 554657 المخزن المؤقت مسحوق الجسم المضاد الحراري مجموعة الاقتران

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مل من البوليسترين أنابيب مستديرة القاع مع غطاء مصفاة الخلية352235بعد تلطيخ الأجسام المضادة ، يتم نقل العينة إلى أنابيب لتحليل قياس التدفق الخلوي.
AgarSigmaA7002تستخدم لإعداد الوسائط
AnaeroPackThermo ScientificR681001حزمة الغاز اللاهوائي المستخدمة في استزراع Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva software
BD LSR Fortessa مقياس التدفق
مصل الأبقار ألبومينفيشر الكواشف الحيويةBP1605تستخدم لقياس التدفق الخلوي
لقياس التدفق الخلوي (FCSB)BD Biosciencesلقياس التدفق
الخلوي للفأر IgG2b التحكم في النمط النظيري للفأر (eBMG2b) ، PE ، eBioscienceThermo Fisher Scientific12473281التحكم في النمط المشاوي. يتم شراء هذا الجسم المضاد في شكل مترافق من الشركة المصنعة.
MRSBD Biosciences288130يستخدم لإعداد الوسائط وزراعة Lactobacillus gasseri.
قفيصة نوروفيروس G2 الجسم المضاد أحادي النسيلة (L34D)للفيروفيرسMA5-18241نوروفيروس GII. هذا الجسم المضاد متاح فقط في الشكل غير المترافق ، وبالتالي يجب أن يكون مترافقا بالفلورسنت قبل استخدامه في فحوصات قياس التدفق الخلوي المحددة. في هذا البروتوكول ، كان PE هو الفلور المختار ، ومع ذلك ، يمكن اختيار جزيئات الفلورسنت الأخرى التي تناسب مقياس التدفق الخلوي الذي يستخدمه الباحث.
نوروفيروس GII.4 VLPالبنية الحيوية الإبداعيةCBS-V700فيروس نوروفيروس البشري مثل الجسيمات ، تم إنشاء VLPs باستخدام نظام الفيروس العصبي وأعيد تعليقه في محلول ملحي مخزن بالفوسفات مع 10٪ جلسرين. أجرى المؤلفون تحليلا مستقلا لتتبع البصر النانوي لتحديد تركيز جسيمات VLPs. يبلغ التركيز حوالي 1011< / sup> VLPs لكل مليلتر. بناء على تركيز البروتين في VLPs ، تتم إضافة ما يقرب من 200 جسيم لكل بكتيريا في فحوصات مرفق VLP.
PBS 10Xفيشر الكواشف الحيويةBP665تمييع إلى 1X قبل الاستخدام.
طقم وضع العلامات على الأجسام المضادة SiteClick R-PEThermo Fisher ScientificS10467المستخدمة في اختبار الأجسام المضادة غير المترافقة.
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS271المستخدمة لإعداد الوسائط
TryptoneOxoidLP0042تستخدم لإعداد
الوسائط أنبوب مسدسThermoFisherScientific 88881001المستخدمة في فحص تثبيت الفيروسات: البكتيريا. اضبط على السرعة القصوى (40 دورة في الدقيقة).
مستخلص الخميرةBD Biosciences212750يستخدم لإعداد الوسائط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hall, A. J., Glass, R. I., Parashar, U. D. New insights into the global burden of noroviruses and opportunities for prevention. Expert Review of Vaccines. 15 (8), 949-951 (2016).
  2. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  3. Baldridge, M. T., et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection. Science. 347 (6219), 266-269 (2015).
  4. Lei, S., et al. Enterobacter cloacae inhibits human norovirus infectivity in gnotobiotic pigs. Scientific reports. 6, 25017(2016).
  5. Lei, S., et al. High Protective Efficacy of Probiotics and Rice Bran against Human Norovirus Infection and Diarrhea in Gnotobiotic Pigs. Frontiers in Microbiology. 7, 1699(2016).
  6. Rodríguez-Díaz, J., et al. Relevance of secretor status genotype and microbiota composition in susceptibility to rotavirus and norovirus infections in humans. Scientific Reports. 7, 45559(2017).
  7. Erickson, A. K., et al. Bacteria Facilitate Enteric Virus Co-infection of Mammalian Cells and Promote Genetic Recombination. Cell Host Microbe. 23 (1), 77-88 (2018).
  8. Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. Science. 334 (6053), 249-252 (2011).
  9. Robinson, C. M., Jesudhasan, P. R., Pfeiffer, J. K. Bacterial lipopolysaccharide binding enhances virion stability and promotes environmental fitness of an enteric virus. Cell Host Microbe. 15 (1), 36-46 (2014).
  10. Berger, A. K., Yi, H., Kearns, D. B., Mainou, B. A. Bacteria and bacterial envelope components enhance mammalian reovirus thermostability. PLOS Pathogens. 13 (12), 1006768(2017).
  11. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. Journal of Virology. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  12. Almand, E. A., Moore, M. D., Outlaw, J., Jaykus, L. A. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. PLOS One. 12 (3), (2017).
  13. Robinson, C. M., Woods Acevedo, M. A., McCune, B. T., Pfeiffer, J. K. Related enteric viruses have different requirements for host microbiota in mice. Journal of Virology. , (2019).
  14. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
  15. Van Dycke, J., et al. A robust human norovirus replication model in zebrafish larvae. PLOS Pathogens. 15 (9), 1008009(2019).
  16. Li, D., Breiman, A., le Pendu, J., Uyttendaele, M. Binding to histo-blood group antigen-expressing bacteria protects human norovirus from acute heat stress. Frontiers in Microbiology. 6, 659(2015).
  17. Almand, E. A., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Characterization of human norovirus binding to gut-associated bacterial ligands. BMC Research Notes. 12 (1), 607(2019).
  18. Debbink, K., et al. Within-host evolution results in antigenically distinct GII.4 noroviruses. Journal of Virology. 88 (13), 7244-7255 (2014).
  19. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. Binding of Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigens is blocked by antisera from infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. Journal of Virology. 76 (23), 12335-12343 (2002).
  20. Harrington, P. R., Vinje, J., Moe, C. L., Baric, R. S. Norovirus capture with histo-blood group antigens reveals novel virus-ligand interactions. Journal of Virology. 78 (6), 3035-3045 (2004).
  21. Mallory, M. L., Lindesmith, L. C., Graham, R. L., Baric, R. S. GII.4 Human Norovirus: Surveying the Antigenic Landscape. Viruses. 11 (2), (2019).
  22. Prasad, B. V., et al. X-ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 286 (5438), New York, N.Y. 287-290 (1999).
  23. Baric, R. S., et al. Expression and self-assembly of norwalk virus capsid protein from venezuelan equine encephalitis virus replicons. Journal of Virology. 76 (6), 3023-3030 (2002).
  24. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral p-particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLOS One. 9 (2), 89586(2014).
  25. Tan, M., et al. Terminal modifications of norovirus P domain resulted in a new type of subviral particles, the small P particles. Virology. 410 (2), 345-352 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة