مقالة منهجية

منصة مختبر على رقاقة لتحفيز العظام Mechanotransduction وتحليل النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام

7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61076

⸱

مايو 21, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولات لتحليل إعادة عرض العظام داخل منصة المختبر على رقاقة. يمكن إقران جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد مع النظام الأساسي للحث على إحداث ميكانيكية العظام عن طريق تشويه المصفوفة الخلوية. ويمكن أيضا أن تستخدم منصة لتحديد العظام إعادة عرض النتائج الوظيفية من العظام والعظام (resorption / تشكيل).

الملخص

إعادة عرض العظام هي عملية منظمة بإحكام مطلوبة لنمو الهيكل العظمي والإصلاح بالإضافة إلى التكيف مع التغيرات في البيئة الميكانيكية. خلال هذه العملية, الخلايا العظمية الميشانوالحساسة تنظيم الاستجابات المتعارضة بين العظام تقويضي والعظام الابتنائية. لفهم أفضل لمسارات الإشارات المعقدة للغاية التي تنظم هذه العملية ، طور مختبرنا منصة أساسية للمختبر على رقاقة (LOC) لتحليل النتائج الوظيفية (تشكيل وارتشاف) لإعادة عرض العظام داخل نظام صغير الحجم. كما إعادة عرض العظام هي عملية طويلة التي تحدث على ترتيب أسابيع إلى أشهر، وضعنا بروتوكولات زراعة الخلايا على المدى الطويل داخل النظام. وتزرع الخلايا العظمية والعظام على ركائز النشاط الوظيفي داخل LOC والحفاظ عليها لمدة تصل إلى سبعة أسابيع. بعد ذلك ، تم تفكيك الرقائق للسماح بالقياس الكمي لتكوين العظام وارتشافها. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتصميم جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد يُزوج منصة LOC ويمكن استخدامه للحث على إحداث النخاع العظمي عن طريق تشويه المصفوفة الخلوية. لقد قمنا بتحسين بروتوكولات زراعة الخلايا لخلايا العظام، والعظام، والعظام داخل منصة LOC وعالجنا مخاوف العقم والسمية الخلوية. هنا، نقدم بروتوكولات لتصنيع وتعقيم LOC، وخلايا البذر على ركائز وظيفية، وحفز الحمل الميكانيكي، وتفكيك LOC لتحديد نتائج نقطة النهاية. ونحن نعتقد أن هذه التقنيات تضع الأساس لتطوير الجهاز الحقيقي على رقاقة لإعادة عرض العظام.

المقدمة

العظام هو نسيج ديناميكي للغاية يتطلب تنسيقًا معقدًا بين أنواع الخلايا الرئيسية الثلاثة: الخلايا العظمية والعظام والعظام. التفاعلات متعددة الخلايا بين هذه الخلايا هي المسؤولة عن فقدان العظام التي تحدث أثناء الشلل والجمود على المدى الطويل وتشكيل العظام التي تحدث استجابة للنمو وممارسة الرياضة. الخلايا العظمية، نوع الخلية العظمية الأكثر وفرة، حساسة للغاية للمحفزات الميكانيكية المطبقة على العظام. التحفيز الميكانيكي يغير النشاط الأيضي للعظام ويؤدي إلى زيادة في جزيئات الإشارات الرئيسية1،2. من خلال هذه العملية، والمعروفة باسم mechanotransduction، يمكن تنسيق الخلايا العظمية مباشرة أنشطة العظام (خلايا تشكيل العظام) والعظام (خلايا العظام resorbing). الحفاظ على التوازن العظام يتطلب تنظيما محكما بين تكوين العظام ومعدلات امتصاص العظام; ومع ذلك ، يمكن أن تؤدي الاضطرابات في هذه العملية إلى حالات المرض مثل هشاشة العظام أو هشاشة العظام.

تعقيد التفاعلات بين هذه الأنواع الثلاثة من الخلايا يفسح المجال للتحقيق باستخدام تقنيات microfluidic والمختبر على رقاقة (LOC). وتحقيقا لهذه الغاية، وقد أنشأت مختبرنا مؤخرا دليلا على مفهوم منصة LOC لتحليل ارتشاف العظام وتشكيل (النتائج الوظيفية) في عملية إعادة عرض العظام. يمكن استخدام المنصة لدراسة التفاعلات الخلوية ، وبيئات التحميل المتغيرة ، وفحص المخدرات التحقيقية. في السنوات الأخيرة، تم تطوير أجهزة ميكروولينيك مختلفة للتحقيق في مسارات الإشارات الجزيئية التي تنظم إعادة عرض العظام. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الأنظمة تحدد إعادة عرض من خلال علامات غير مباشرة تدل على النشاط الوظيفي3،4،5،6،7. ميزة نظامنا هو أنه يمكن استخدامه للقياس الكمي المباشر للنتائج الوظيفية. إعادة عرض العظام هي عملية طويلة الأجل. على هذا النحو ، يتطلب التحديد الكمي المباشر لارتشاف العظام وتشكيلها نظامًا للزراعة يمكن الحفاظ عليه لمدة لا تقل عن عدة أسابيع إلى أشهر8،9،10،11. وهكذا، عند تطوير منصة LOC، أنشأنا بروتوكولات التبهي على المدى الطويل اللازمة لتشكيل وresorption والحفاظ على الخلايا داخل النظام لمدة تصل إلى سبعة أسابيع11. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بدمج ركائز الاستزراع المناسب لكلا النوعين من الخلايا في المنصة. تم استزراع العظام مباشرة على العظام ، وكانت الخلايا العظمية ، والتي تعرف أنها منالبلاستيك ، مُستزرعة على أقراص البوليسترين. وعلاوة على ذلك، تناولنا القضايا المتعلقة بالعقم، والسمية الخلايا على المدى الطويل والتفكيك رقاقة لإعادة عرض تحليل11،12.

ويمكن أيضا أن تستخدم منصة LOC للحث على mechanotransduction العظام من خلال تشوه مصفوفة. تم تطوير جهاز تحميل ميكانيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد ليقترن بـ LOC ويطبق جهازًا ثابتًا خارج المستوى لتمتد الخلايا13. لاستيعاب هذا الحمل الميكانيكي ، تم زيادة عمق البئر داخل LOC. هذا الحجم الصغير، بسيطة جهاز تحميل الميكانيكية يمكن أن تنتج بسهولة من قبل مختبرات ذات خبرة هندسية محدودة، ونحن قد شارك سابقا رسومات من المكونات المطبوعة 3D13. في العمل الحالي ، نبين بعض التقنيات الجديدة اللازمة للاستخدام الناجح للLOC . ونحن نعتقد أن شرح هذه التقنيات تستفيد من شكل البصرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد قناع رقاقة

ملاحظة: الخطوات 1.1 - 1.3 تحتاج فقط إلى تنفيذها مرة واحدة عند الاستلام الأولي لقناع الشريحة. أنها تضمن القناع لا ينحني أثناء الاستخدام. تم وصف تصميم الأقنعة الدقيقة في السابق11،14. تم تصميم الأقنعة في المنزل وملفقة تجاريا باستخدام الاستريوغرافيا عالية الدقة(الشكل 1A).

  1. تغطية السطح العلوي للقناع مع الأغطية البلاستيكية لحماية هذا السطح من لاصقة. تأمين قناع رقاقة إلى ورقة الاكريليك بنفس الحجم باستخدام لاصق رذاذ. المشبك القطع معا بين عشية وضحاها للسماح لللاصقة لعلاج تماما. بعد أن يجف لاصق، إزالة الأغطية البلاستيكية من الجزء العلوي من القناع.
  2. إرفاق الجزء السفلي من ورقة الاكريليك إلى مربع التسوية المطبوعة 3D(الشكل التكميلي 1، الملفات التكميلية 1-4)باستخدام الشريط على الوجهين. اضغط بحزم لضمان وجود رابطة ضيقة.
  3. ختم أي فتحات صغيرة بالقرب من الجدار للانفصال من مربع التسوية مع تسرب للماء. السماح للتسرب لعلاج لمدة 24 ساعة.
  4. تنظيف سطح القناع مع الإيثانول 70٪ (EtOH). ضع مربع التسوية مع قناع الشريحة المطلوب في الفرن. استخدم منقلة رقمية لضمان مستوى الجزء العلوي من القناع. ضبط مسامير التسوية إذا لزم الأمر.

2. تصنيع PDMS

ملاحظة: يتم استخدام تصميم رقاقة ضحلة البئر (1 مم) للنشاط الوظيفي (التشكيل وإعادة الامتصاص) ، ويستخدم تصميم رقاقة عميقة البئر (10 مم) لدراسات التحميل الميكانيكية. يتم تشكيل الجزء السفلي من البئر العميق عن طريق إرفاق غشاء PDMS رقيقة منفصلة(الشكل 1B).

  1. طبقة الغطاء (الطبقة 1)
    1. الجمع بين 63 غرام من PDMS prepolymer و 6.3 غرام من عامل علاج (نسبة 10:1) في كوب من البلاستيك. مزيج شامل مع ملعقة الخلية المتاح وديغا في فراغ desiccator لمدة 30 دقيقة.
    2. صب الخليط ببطء في مربع التسوية المعدة. دع PDMS الجلوس لمدة 30 دقيقة ثم خبز في 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    3. تخفيف حواف PDMS مع ملعقة مختبر مدبب وإزالة ورقة البوليمر من مربع التسوية.
    4. اقطع الأغطية الفردية إلى حجم (70 مم × 34 مم) باستخدام مشرط وقالب مطبوع ثلاثي الأبعاد.
    5. ثقوب الوصول لكمة من خلال كل غطاء مع لكمة خزعة (قطر 1 مم).
    6. سطح تنظيف الأغطية مع شريط التعبئة والتغليف.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الأغطية على الفور، قم بتغليف كل منها في شريط التعبئة والتغليف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. كذلك وطبقة القناة الدقيقة (طبقة 2)
    1. الجمع بين PDMS قبل البوليمر وكيل علاج (نسبة 10:1) في كوب من البلاستيك. تصميم بئر الضحلة يتطلب 43 غرام من قبل البوليمر و 4.3 غرام من عامل علاج، وتصميم عميق جيدا يتطلب 227 غرام من قبل البوليمر و 22.7 غرام من عامل علاج. تخلط البوليمر بقوة وديغا لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يفترض هذا بعد قناع 152.4 مم × 152.4 مم.
    2. صب الخليط ببطء على قناع مناسب قبل التسوية. دع PDMS الجلوس لمدة 30 دقيقة ثم خبز في 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    3. تخفيف حواف PDMS مع ملعقة مختبر مدبب وقشر بعناية البوليمر بعيدا عن القناع. استخدم قالب مشرط و3D مطبوع لقطع رقائق الفردية.
      ملاحظة: بالنسبة لدراسات التحميل، من المهم أن تكون أبعاد الشريحة (70 × 34 مم) دقيقة وأن البئر يقع في وسط الشريحة.
    4. سطح تنظيف PDMS مع شريط التعبئة والتغليف.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الرقائق على الفور، قم بتغليف كل رقاقة في شريط التعبئة والتغليف وتخزينها في RT.
  3. غشاء PDMS رقيقة (طبقة 3)
    ملاحظة: يتم استخدام هذه الطبقة فقط لتصميم بئر عميق.
    1. إضافة 12.7 غرام من PDMS prepolymer و 1.3 غرام من عامل علاج (نسبة 10:1) إلى كوب من البلاستيك. تخلط بقوة وdegas لمدة 30 دقيقة.
    2. صب البوليمر ببطء في مربع التسوية المعدة وكشط تماما كوب من البلاستيك لإزالة أكبر قدر ممكن PDMS.
    3. استخدام ملعقة الخلية لنشر PDMS على سطح كامل.
      ملاحظة: إذا لم يتم نشر البوليمر يدوياً، سوف يكون التوتر السطحي كافياً لمنع البوليمر من تشكيل ورقة موحدة.
    4. دع PDMS الجلوس لمدة 30 دقيقة ثم خبز في 45 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.
    5. تخفيف حواف PDMS مع ملعقة مدببة وإزالة ورقة PDMS بعناية من مربع التسوية. قطع الأغشية الفردية التي تتطابق مع أبعاد الطبقة 2.
    6. قياس سمك الغشاء في وسط الغشاء باستخدام الفرجار. تخلص من أي أغشية خارج السماكة المطلوبة (0.5 مم ± 0.1 مم).
    7. الأغشية نظيفة بعناية مع شريط التعبئة والتغليف ومكان على قطعة من فيلم البارافين.
      ملاحظة: إذا لم يتم استخدام الأغشية على الفور، قم بتغطية الجزء العلوي من الغشاء بشريط التعبئة والتغليف وتخزينها في RT.

3. ركائز النشاط الوظيفي

ملاحظة: يجب إرفاق أقراص البوليسترين ورقائق العظام إلى الجزء السفلي من الآبار التي سيتم استخدامها لثقافات العظام والعظام، على التوالي.

  1. أقراص البوليسترين(الشكل 1C)
    1. وضع شريط اخفاء على الجانب الخلفي من ثقافة الأنسجة المعالجة غطاء البوليسترين. قطع الأقراص الدائرية من الغطاء باستخدام شحذ الفلين بورر (قطر 5.4 ملم). غمر الأقراص في 70٪ EtOH وترك بين عشية وضحاها.
    2. فرك بلطف السطح العلوي من القرص مع قضيب القطن يميل غارقة في 70٪ EtOH. تأكد من تنظيف الحافة الخارجية للقرص تمامًا.
    3. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، عقد القرص وإزالة إخفاء الشريط الدعم. ضع القرص الجانب المعالجة أسفل وتنظيف الجانب الخلفي مع قضيب القطن يميل.
    4. تراجع نهاية خشبية من قضيب القطن يميل في خليط degassed من PDMS uncured ووضع كمية صغيرة من البوليمر على الجزء السفلي من البئر المطلوب.
      ملاحظة: يمكن تخزين PDMS غير المعبّر المتبقية عند -20 درجة مئوية.
    5. ضع قرص البوليسترين، تعامل الجانب لأعلى، في البئر واضغط بلطف لأسفل على القرص مع مسحة القطن. تأكد من عدم اتصال PDMS غير المعمرة بالجانب المعالج من القرص.
      ملاحظة: إذا كان PDMS لا تأتي في اتصال مع السطح المعالج من القرص، إزالة القرص من البئر وتكرار الخطوات 3.1.4 و 3.1.5 مع قرص جديد.
    6. دع الشريحة تُجلس على سطح مستوي لمدة 30 دقيقة ثم تخبز على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 4 سه.
  2. رقائق العظام
    1. استخدم ملقط لوضع رقاقة عظمية (قطرها 6 مم، سمكها 0.4 مم) في الجزء السفلي من طبق 100 مم. عقد رقاقة ثابتة مع ملقط وحفر بلطف 'X' على الجزء الخلفي من رقاقة مع مشرط.
      ملاحظة: أثناء عملية التصوير، يتم استخدام "X" للتمييز بين الجزء الخلفي من الرقاقة والسطح الذي تم بذر الخلايا عليه.
    2. استخدام نهاية خشبية من قضيب القطن يميل لإضافة كمية صغيرة من PDMS uncured إلى الجزء السفلي من البئر المطلوب. ضع رقاقة العظام، ملحوظ الجانب إلى أسفل، في البئر واستخدام قضيب القطن يميل للضغط على رقاقة أسفل.
    3. دع الشريحة تُجلس على سطح مستوي لمدة 30 دقيقة ثم تخبز على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 4 سه.

4. رقاقة التجمع والتعقيم

  1. قم بتنشيط أسطح الطبقة 1 والطبقة 2 باستخدام منظف بلازما لمدة 30 ق باستخدام إعداد طاقة التردد الراديوي المتوسط (RF) (أي ما يعادل 10.2 واط تقريبًا).
  2. محاذاة ثقوب الوصول في طبقة 1 مع القنوات الدقيقة في طبقة 2 واضغط بحزم على طبقتين معا.
  3. لتصميم بئر عميق، كرر الخطوة 4.1 مع طبقة 2 وطبقة 3. أثناء معالجة البلازما، استخدم الشريط على الوجهين لإرفاق فيلم البارافين من الطبقة 3 إلى سطح مستو.
  4. استخدام مشرط لتقليم قبالة المواد الزائدة من غشاء PDMS. قشر بعناية بعيدا ورقة من فيلم البارافين من الجزء السفلي من رقاقة
  5. خبز رقاقة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لزيادة قوة السندات بين طبقات PDMS.
  6. إدراج نصائح الاستغناء الزاوية (18 قياس، 0.5 في، 90 درجة) في ثقوب الوصول في الغطاء. تأمين نصائح الاستغناء عن الغطاء مع اثنين من جزء الايبوكسي. استخدام تلميح micropipette لتطبيق الايبوكسي حول كل نصيحة الاستغناء.
  7. بعد الايبوكسي قد شفي تماما، سطح تنظيف رقاقة مع 70٪ EtOH ووضعها في خزانة السلامة البيولوجية. تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
  8. قم بتوصيل حقنة 5 مل بنصائح الاستغناء عن أنابيب السيليكون المعقمة (معرف 1/32' ، ~ 10 سم في الطول) وملء الشريحة بأكملها مع 70٪ EtOH لمدة 30 s على الأقل. لتصميم بئر الضحلة، وإدارة جميع السوائل مع مضخة حقنة تعيين إلى معدل تدفق 4 مل / ساعة. لتصميم عميق جيدا، وإدارة جميع السوائل عن طريق الاستغناء ببطء الحقنة باليد.
  9. إزالة EtOH من رقاقة وتعقيم رقاقة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها.
  10. غسل رقاقة 3 مرات مع dH2O. ملء رقاقة مع dH2O، وإزالة أنابيب من نصائح الاستغناء واحتضان لمدة لا تقل عن 48 ساعة في 37 درجة مئوية.

5. تجميع جهاز التحميل الميكانيكي

ملاحظة: تم وصف عمليات التصميم والتصنيع لجهاز التحميل الميكانيكي المطبوع ثلاثي الأبعاد(الشكل 2A-C)مسبقًا وتم توفير جميع ملفات التصميم للمكونات المطبوعة مسبقًا13.

  1. أوتوكلاف جميع مكونات جهاز التحميل لمدة 30 دقيقة في 121 درجة مئوية.
    ملاحظة: لتجنب تزييف المكونات المطبوعة، قم بتغليف كل قطعة بشكل فردي في احباط ووضعها على سطح مستو صلب أثناء عملية الأوتوكلاف. يمكن لف الأجهزة المعدنية معا. أكمل جميع الخطوات اللاحقة داخل خزانة السلامة البيولوجية.
  2. وضع ربيع ضغط حول رمح من الصفائح وإدراج الصفائح في حفرة مركزية على الجزء السفلي من القاعدة(الشكل 2D).
  3. إرفاق كتلة الطلب إلى الجزء السفلي من القاعدة باستخدام أربعة مسامير التنصت الذاتي.
  4. وضع الربيع ضغط الثاني حول المسمار المركزي. أدخل المسمار في ثقب سداسي الشكل في الجزء السفلي من الطلب والمسمار الجمعية في ثقب مترابطة في وسط كتلة الطلب.
  5. المسمار أربع مواجهات بين الذكور والإناث في الجزء السفلي من القاعدة.
  6. قم بإزالة الركود من الجهاز عن طريق تحويل اتجاه عقارب الساعة إلى أن يكون الجزء العلوي من اللوحة أسفل الجزء العلوي من القاعدة. ثم بدوره ببطء في اتجاه عقارب الساعة حتى أعلى لوحة هو مستوى مع الجزء العلوي من القاعدة.

6- التجريب

ملاحظة: بروتوكولات لتجارب النشاط الوظيفي قدمت سابقا11،12.

  1. دراسات التحميل(الشكل 3)
    1. بعد الخطوة 4.9، استخدم حقنة 5 مل لإزالة dH2O من رقاقة بئر عميق. معطف الجزء السفلي من البئر مع 200 ميكرولتر من 0.15 ملغ / مل نوع الأول الكولاجين (CTI) في 0.02 M حمض الخليك لمدة 1 ساعة.
    2. شطف رقاقة ثلاث مرات مع دلبيكو الفوسفات المخزنة مؤقتا مع الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS ++).
    3. ضع رقاقة في حامل الشريحة والبذور مع MLO-Y4 العظام بكثافة 2 × 104 خلايا / مل في الحد الأدنى من متوسط ألفا الأساسية (MEMα) تكملها 5٪ مصل العجل، 5٪ مصل البقر الجنين، و 1٪ البنسلين / العقديات.
    4. إزالة الأنابيب من نصائح الاستغناء ووضع رقاقة في طبق ثقافة عميقة جيدا (150 ملم × 25 ملم). الخلايا المحتضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة.
    5. إرفاق أنابيب معقمة إلى نصائح الاستغناء واستخدام حقنة 5 مل لإزالة متوسط الثقافة المستهلكة من رقاقة. الاستغناء ببطء في الثقافة الجديدة المتوسطة لإعادة ملء رقاقة.
    6. ضع حامل الشريحة في الداخل المستطيل في الجزء العلوي من قاعدة جهاز التحميل. تغذية أنابيب من خلال فتحات تقع على غطاء جهاز التحميل وتأمين الغطاء إلى القاعدة مع أربعة مسامير رئيس عموم والمكسرات عرافة.
      ملاحظة: للتأكد من أن الغطاء لا يزال مستوى، تأمين أولاً اثنين من مسامير التي تقع قطرياً من بعضها البعض قبل تأمين مسامير المتبقية اثنين.
    7. تطبيق تحميل على الخلايا عن طريق تحويل الطلب في اتجاه عقارب الساعة حتى يتم الوصول إلى إزاحة الصفائح المطلوبة.
      ملاحظة: تم تصميم الجهاز بحيث دوران واحد من الطلب يعادل إزاحة لوحة من 1 مم. حقل سلالة ولدت على الجزء العلوي من غشاء PDMS كان سابقا على غرار وظيفة من الإزاحة الصفائح باستخدام تحليل العناصر المحدودة (FEA)13.
    8. ضع جهاز التحميل في مربع تلميح P1000 ميكروبيزيت فارغ. احتضان الخلايا مع الحمل المطبق لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: فترة التحميل الزمنية المستخدمة هنا بمثابة مثال. يمكن استخدام أوقات التحميل البديلة.
    9. بعد الحضانة، قم بإزالة الحمل من الخلايا عن طريق تحويل اتجاه عقارب الساعة إلى أن يعود الصفائح إلى موضع البداية الأصلي. قم بإزالة الغطاء من الجهاز ووضع حامل الشريحة في لوحة الثقافة العميقة. احتضان الخلايا لفترة استرداد تحميل آخر 90 دقيقة.
      ملاحظة: مرة أخرى، فترة الاسترداد الزمنية المستخدمة هنا بمثابة مثال. يمكن استخدام أوقات الاسترداد البديلة. للدراسات طويلة الأجل، تغذية الخلايا كل 72 ساعة.
    10. استخدم حقنة 5 مل لإزالة الوسط المكيف من الشريحة.
      ملاحظة: يمكن حفظ هذا الوسط وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
    11. إزالة رقاقة من حامل رقاقة واستخدام ملعقة مدبب لكسر السندات بين غطاء PDMS وطبقة جيدا.
      ملاحظة: يمكن الآن تنفيذ المقالات الخلوية بعد أي بروتوكول تم إنشاؤه للوحة ثقافة الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن استخدام التكوين الضحل ة البئر لتحليل النشاط الوظيفي للعظام والعظام. تكوين العظام عن طريق العظام وارتشاف عبر العظام يتطلب أوقات التبهي على أمر عدة أسابيع إلى أشهر. تم قياس تكوين العظام من MC3T3-E1 قبل العظم باستخدام الأليسارين الأحمر وفون كوسا البقع11،15. في اليوم 49 ، كان متوسط مساحة السطح الملطخة باللون الأحمر الأليسارين 10.7٪ ± 2.2٪ (متوسط الأخطاء القياسية ± للمتوسط)11. كان متوسط مساحة السطح الملطخة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تصف هذه المقالة الأسس لتلفيق منصة LOC لإعادة عرض العظام لاستزراع الخلايا العظمية والعظام والعظام. عن طريق تغيير عمق وحجم البئر داخل الشريحة ، تم تطوير تكوينات متعددة لتحفيز العظام مع الحمل الميكانيكي وتحديد النتائج الوظيفية لإعادة عرض العظام(الشكل 1B).

أثناء تجميع رقاقة، كان تحسين بروتوكول أكسدة البلازما حاسمة للقضاء على المخاوف التسرب. وجدنا أن تعريض أسطح PDMS إلى 30 ثانية من بلازما الأكسجين التي تم إنشاؤها باستخدام إعداد طاقة تردد متوسط (الخطوة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم بموجب رقم المنحة (CBET 1060990 وEBMS 1700299). كما تستند هذه المواد إلى العمل الذي يدعمه برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم بموجب المنحة رقم (2018250692). أي آراء أو استنتاجات أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
لوح أكريليكOptix-3.175 مم بسمك 3.175 مم
نصائح توزيع بزاويةJensen GlobalJG18-0.5X-90قم بإزالة الموصل البلاستيكي قبل الاستخدام
خزعة لكمةRobbins InstrumentsRBP-10قطر 1 مم
رقائق العظامBoneslices.com0.4 مم بسمك 0.4 مم
مصل العجل البقريHycloneSH30072
الفرجارالعالمية الصناعيةT9F534164
خلية ملعقةTPP99010
قناع رقاقةProtoLabsمصممة خصيصامواد الطباعة: أكورا SL 5530
حفار الفلينفيشر Scientific07-865-10B
قضيب قطني مائلPuritan806-WCL
Culture طبق (100 مم)كورنينج430591معقم ، معالج بزراعة الأنسجة
طبق ثقافة (150 مم)كورنينج430597معقم ، غير معالج بزراعة الأنسجة
شريط على الوجهين3M CompanyScotch 237
مصل الأبقارالجنيني HycloneSH30910
ملقطفيشر Scientific22-327379
صندوق التسويةحسب الطلب-مطبوع ثلاثي الأبعاد
3M شركةScoth 2600
MC3T3-E1 preosteoblastsATCCCRL-2593Subclone 4
جهاز تحميل ميكانيكيحسب الطلب-3D مطبوعة
الحد الأدنى الأساسي ألفا المتوسطةGibco12571-063
MLO-Y4 الخلايا العظمية----هدية من الدكتورة ليندا بونوالد
شريط التعبئة والتغليفDuck Brand-شريط التغليف القياسي
البارافينBemis ParafilmPM999
Penicillin / StreptomycinInvitrogenp4333
منظف البلازماHarrick PlasmaPDC-001منظف البلازما الموسع
طقم PolydimethylsiloxaneDow CorningSylgard 184
أغطية البوليسترينNunc Thermanox174942معقم ، معالجة بزراعة الأنسجة
مختبر QuincyLab 12-180
RAW264.7 preosteoclastsATCCTIB-71
مشرطBD 372611
طبي أنابيب سيليكونSaint-Gobain TygonABW00001ID: 1/32 بوصة (0.79 مم) ، OD: 3/32 بوصة (2.38 مم)
برنامج SolidWorksDassault Systè mes-تستخدم لتوليد نماذج مطبوعة ثلاثية الأبعاد وأداء FEA
رذاذ لاصقلوكتايت2323879لاصقة متعددة الأغراض
(5 مل)طبية 309646 معقمة BD
هارفارد70-2213مضخة 11 بيكو بلس
ملعقة مختبر مدببةفيشر ساينتيك21-401-10
جزأين expoxyLoctite1395391مجموعة سريعة لمدة 5 دقائق
النوع الأول من الكولاجينمن النوع الأول Corning354236ذيل الفئران الكولاجين
المجفف الفراغيBel-ArtF42010-0000
مانع التسرب المقاوم للماءGorilla8090001التسرب السيليكوني بنسبة 100٪
شريط اخفاء فيلم حقنة مضخة حقنة جهاز من مانع

المراجع

  1. Hemmatian, H., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., van Lenthe, G. H. Aging, Osteocytes, and Mechanotransduction. Current Osteoporosis Reports. 15 (5), 401-411 (2017).
  2. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  3. Middleton, K., Al-Dujaili, S., Mei, X., Gunther, A., You, L. Microfluidic co-culture platform for investigating osteocyte-osteoclast signalling during fluid shear stress mechanostimulation. Journal of Biomechanics. 59, 35-42 (2017).
  4. Kou, S., et al. A multishear microfluidic device for quantitative analysis of calcium dynamics in osteoblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications. 408 (2), 350-355 (2011).
  5. Ma, H. P., et al. A microfluidic chip-based co-culture of fibroblast-like synoviocytes with osteoblasts and osteoclasts to test bone erosion and drug evaluation. Royal Society Open Science. 5 (9), 180528(2018).
  6. Jang, K., et al. Development of an osteoblast-based 3D continuous-perfusion microfluidic system for drug screening. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 390 (3), 825-832 (2008).
  7. Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PLOS ONE. 9 (2), e89966(2014).
  8. Hwang, P. W., Horton, J. A. Variable osteogenic performance of MC3T3-E1 subclones impacts their utility as models of osteoblast biology. Scientific Reports. 9 (1), 8299(2019).
  9. Beier, E. E., Holz, J. D., Sheu, T. J., Puzas, J. E. Elevated lifetime lead exposure impedes osteoclast activity and produces an increase in bone mass in adolescent mice. Toxicological Sciences. 149 (2), 277-288 (2016).
  10. Chaudhary, L. R., Hofmeister, A. M., Hruska, K. A. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation. Bone. 34 (3), 402-411 (2004).
  11. George, E. L., Truesdell, S. L., York, S. L., Saunders, M. M. Lab-on-a-chip platforms for quantification of multicellular interactions in bone remodeling. Experimental Cell Research. 365 (1), 106-118 (2018).
  12. Truesdell, S. L., George, E. L., Saunders, M. M. Cellular considerations for optimizing bone cell culture and remodeling in a lab-on-a-chip platform. Biotechniques. , In review (2019).
  13. Truesdell, S. L., George, E. L., Seno, C. E., Saunders, M. M. 3D printed loading device for inducing cellular mechanotransduction via matrix deformation. Experimental Mechanics. 59 (8), 1223-1232 (2019).
  14. George, E. L., Truesdell, S. L., Magyar, A. L., Saunders, M. M. The effects of mechanically loaded osteocytes and inflammation on bone remodeling in a bisphosphonate-induced environment. Bone. 127, 460-473 (2019).
  15. George, E. L. Quantifying the roles of stimulated osteocytes and inflammation in bone remodeling Doctor of Philosophy. , University of Akron. (2019).
  16. York, S. L., Sethu, P., Saunders, M. M. In vitro osteocytic microdamage and viability quantification using a microloading platform. Medical Engineering & Physics. 38 (10), 1115-1122 (2016).
  17. Hui, A. Y., Wang, G., Lin, B., Chan, W. T. Microwave plasma treatment of polymer surface for irreversible sealing of microfluidic devices. Lab Chip. 5 (10), 1173-1177 (2005).
  18. Millare, B., et al. Dependence of the quality of adhesion between poly(dimethylsiloxane) and glass surfaces on the conditions of treatment with oxygen plasma. Langmuir. 24 (22), 13218-13224 (2008).
  19. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent compatibility of poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
  20. Regehr, K. J., et al. Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture. Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).
  21. Wang, Y., Burghardt, T. P. Uncured PDMS inhibits myosin in vitro motility in a microfluidic flow cell. Analytical Biochemistry. 563, 56-60 (2018).
  22. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab Chip. 7 (8), 987-994 (2007).
  23. Kilic, O., et al. Brain-on-a-chip model enables analysis of human neuronal differentiation and chemotaxis. Lab Chip. 16 (21), 4152-4162 (2016).
  24. Van Scoy, G. K., et al. A cellular automata model of bone formation. Mathematical Biosciences. 286, 58-64 (2017).
  25. Truesdell, S. L., Saunders, M. M. Bone remodeling platforms: Understanding the need for multicellular lab-on-a-chip systems and predictive agent-based models. Mathematical Biosciences and Engineering. 17 (2), 1233-1252 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS

مقالات ذات صلة