مقالة منهجية

الفحص القائم على التدفق لتحديد معدلات الالتهام الذاتي لهشاشة العظام

DOI:

10.3791/61078

⸱

يوليو 8, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Grupo de Biología del Cartílago, Servicio de Reumatología, Instituto de Investigación Biomédica de A Coruña (INIBIC), Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, 2Biofarma Research Group, Center for Research in Molecular Medicine and Chronic Diseases (CIMUS), Universidad de Santiago de Compostela

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الورقة بالتفصيل مراقبة تدفق الالتهام الذاتي لتحديد جزيئات جديدة عن طريق فحص التصوير القائم على الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الالتهام الذاتي هو آلية مركزية لتنظيم التوازن. تساهم تغييرات الالتهام الذاتي في الأمراض المرتبطة بالشيخوخة. يمكن استخدام طرق النمط الظاهري لتحديد منظمات الالتهام الذاتي لتحديد العلاجات الجديدة. توضح هذه المقالة سير عمل فحص التصوير القائم على الخلايا الذي تم تطويره لمراقبة التدفق الذاتي باستخدام LC3 كمراسل للتدفق الذاتي (mCherry-EGFP-LC3B) في الخلايا الغضروفية البشرية. يتم الحصول على البيانات باستخدام مجهر آلي لنظام فحص التصوير عالي المحتوى. تم تطوير بروتوكول تحليل الصور الآلي القائم على الخوارزمية والتحقق من صحته لتحديد الجزيئات التي تنشط التدفق الذاتي. يتم الإبلاغ عن الخطوات الحاسمة والملاحظات التوضيحية والتحسينات على بروتوكولات مراقبة الالتهام الذاتي الحالية. يمكن أن تسهل مناهج فحص النمط الظاهري ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لاستهداف السمات المميزة للشيخوخة استراتيجيات اكتشاف الأدوية الأكثر فعالية للأمراض العضلية الهيكلية المرتبطة بالعمر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترتبط العديد من الأمراض المزمنة بالسمات المميزة للشيخوخة ، بما في ذلك الالتهام الذاتي المعيب1. هشاشة العظام (OA) هو أكثر أمراض المفاصل انتشارا وله تأثير كبير في تقييد الأنشطة اليومية لدى كبار السن ، ولكن لا تتوفر حتى الآن تدابير وقائية أو علاجات معدلةللمرض 2.

ترتبط شيخوخة المفاصل والزراعة العضوية بالسمات المميزة التي تحدد تطور تنكس الغضروف ، بما في ذلك الالتهام الذاتي المعيب والشيخوخة3،4. يمكن أن يساعد استهداف الالتهام الذاتي في الأنسجة العضلية الهيكلية في العثور على ابتكارات علاجية للأمراض الروماتيزمية5،6. يعد التعديل الدوائي للالتهام الذاتي آلية واعدة وذات صلة للتدخل في نماذج الأمراض قبلالسريرية 7. في الزراعة العضوية ، تم استخدام تنشيط الالتهام الذاتي لمنع ضعف المفاصل8. يمكن استخدام طرق مراقبة الالتهام الذاتي بناء على بروتوكولات قوية وقابلة للتكرار تسمح بالتحليل الكمي لتحديد العوامل الجديدة وتسهيل الاستهداف الدوائي للسمات المميزة للشيخوخة ذات الصلة بالأمراض.

يعكس تدفق الالتهام الذاتي نشاط التحلل وهو قياس ذي صلة لتحديد جزيئات جديدة تنشط الالتهام الذاتي9. تصف هذه الدراسة طريقة تم تطويرها لتحديد التدفق الذاتي عن طريق قياس نشاط التحلل الذاتي باستخدام خط خلية مراسل الالتهام الذاتي في الخلايا الغضروفية البشرية (TC28a2). يسمح التعبير العابر mCherry-EGFP-LC3- بالمراقبة المتزامنة لأحداث تكوين وتحلل الجسيم الذاتي عن طريق تحديد الاختلافات في حساسية الأس الهيدروجيني بين إشارات GFP و mCherry LC3 في الجسيمات الحالة للخلاياالحية 10.

قد يسمح تكييف طريقة قياس التدفق الخلوي المبلغ عنها مع نظام مراقبة تصوير التعبير المستقر في الخلايا الغضروفية الحية بتحديد الجزيئات التي تنشط التدفق الذاتي في سياق بيولوجيا الغضروف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليد خط خلية مراسل الالتهام الذاتي للخلايا الغضروفية البشرية الخالدة

ملاحظة: تم وصف إنشاء خط خلية مراسل الالتهام الذاتي عن طريق التعداء المستقر ل pBABE-mCherry-GFP-LC3 من خلال إنشاء قراءة كمية لقياس التدفق الخلوي سابقا11. تم استخدام خطين خلويتين في تعدي الفيروسات القهقرية: HEK 293-T17 أثناء عملية التعدي المشترك و T / C28a2 في خطوة العدوى.

  1. عملية التعدي
    1. تحضير وسط النمو لخلايا HEK 293-T17: 500 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي للنسر (EMEM) ، و 10٪ مصل بقري الجنين (FBS) ، و 1٪ بنسلين ستربتومايسين (P / S). قم بتخزين وسط النمو عند 4 درجات مئوية ودافئه إلى 37 درجة مئوية قبل كل استخدام.
    2. قم بالبذور 1 × 106 خلايا HEK 293-T17 لكل بئر في ألواح زراعة الخلايا مقاس 100 مم ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، وتأكد من أنها عند التقاء ~ 75٪ قبل البدء في عملية التعداد.
    3. قم بإزالة وسط الاستزراع ، واشطفه بمحلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، وأضف 8 مل من EMEM مع 2٪ FBS و 1٪ P / S.
    4. في أنبوب مخروطي ، أضف 10 ميكروغرام و 3 ميكروغرام و 7 ميكروغرام من pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B ، VSV. بلازميدات G و pCL-Eco ، على التوالي. ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط المصل المخفض 1x (جدول المواد). أضف كاشف التعدي (جدول المواد) كخليط غير شحمي من الدهون للحصول على نسبة 1: 3 (1 ميكروغرام من الحمض النووي: 3 ميكروغرام كاشف تعداء ؛ الحجم النهائي = 60 ميكرولتر).
      ملاحظة: يتم تحضير ما مجموعه 20 ميكروغرام من المزيج لكل صفيحة خلية مقاس 10 سم ليتم نقلها.
    5. احتضن الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل مزيج التعداء بعناية بالتنقيط إلى خلايا التعبئة HEK 293-T17. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لمدة 48 ساعة على الأقل قبل التحقق من تعبير البروتين الأخضر والأحمر بواسطة الفحص المجهري الفلوري.
      ملاحظة: في هذه الظروف ، يجب أن يكون أكثر من 75٪ من الخلايا إيجابية للتألق. تأكد من أن كفاءة التعدي عالية (على سبيل المثال ، أكثر من 75٪ من الخلايا إيجابية). استخدم الحمض النووي البلازميدي عالي الجودة (على سبيل المثال ، في الغالب فائق اللف وخالي من الحمض النووي الجيني والحمض النووي الريبي والبروتين ؛ عالي التركيز ؛ خال من السموم الداخلية والأملاح) بالإضافة إلى مزارع الخلايا عالية الجودة (على سبيل المثال ، متجانسة ، ممر منخفض ، أحادية الطبقة ، منقولة في مرحلة النمو الأسي ، خالية من الميكوبلازما).
  2. في نفس يوم التعدي ، قم بإعداد الخلايا الغضروفية T / C28a2.
    1. تحضير وسط نمو الخلايا T / C28a2: 500 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، و 10٪ مصل عجل الجنين (FCS) ، و 1٪ P / S. يخزن وسط النمو عند 4 درجات مئوية ودافئ إلى 37 درجة مئوية قبل كل استخدام.
    2. بذور 2 × 105 T / C28a2 الخلايا الغضروفية في اثنين من 6 ألواح متعددة الآبار وتحتضن لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  3. عملية العدوى بالفيروسات القهقرية
    1. وسط استزراع الشفط من خلايا التعبئة الفيروسية القهقرية HEK 293-T17 التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.1.5. اشطف 1x مع 4 مل من HBSS وشفط HBSS.
    2. أضف 2 مل من التربسين وانتظر دقيقتين عند 37 درجة مئوية. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 6 مل من وسط زراعة HEK 293-T17 وخلايا النقل والوسط في أنابيب مخروطية سعة 15 مل.
    3. خلايا الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. نقل الطاف إلى مرشح معقم من خلال غشاء 0.45 ميكرومتر.
    4. استنشق وسط ثقافة الخلايا الغضروفية T / C28a2 من 6 ألواح متعددة الآبار. قم بإصابة خلايا T / C28a2 عن طريق إضافة 2 مل من المعلق الفيروسي (الخطوة 1.3.3) لكل بئر في 6 ألواح متعددة الآبار. استخدم بئرا واحدا للتحكم (أي الخلايا غير المنقولة) ، مع إضافة 2 مل من وسط نمو الخلايا T / C28a2 بدلا من التعليق الفيروسي.
    5. احتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  4. لإجراء عملية الاختيار ، استخدم مجموعة مختارة من المضادات الحيوية على الخلايا المنقولة للقضاء على الخلايا غير المنقولة والحصول على مجموعة خلايا متجانسة.
    ملاحظة: يوفر ناقل الفيروسات القهقرية pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B مقاومة للمضادات الحيوية للثدييات للبورومايسين ، مما يتيح اختيار ثقافة خلية مستقرة بعد تعداء الفيروس. يجب إعداد منحنيات القتل للحصول على تركيز البيورومايسين الأمثل للخلايا الغضروفية T / C28a2 مسبقا لتهيئة الظروف المناسبة لاختيار استنساخ الخلايا التي تحمل الجينات المعدلة بمستويات تعبير عالية.
    1. تحضير T / C28a2-pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B وسط نمو خط الخلية الثابت: 500 مل من DMEM ، و 10٪ FCS ، و 1٪ P / S ، و 2.5 ميكرولتر / مل بورومايسين. يحفظ متوسطا في درجة حرارة 4 درجات مئوية ودافئا حتى 37 درجة مئوية قبل كل استخدام.
    2. قم بتغيير الوسيط. لكل 6 ألواح متعددة الآبار ، وسط ثقافة الشفط ، اشطف 1x مع 2 مل من HBSS واستنشقه. أضف 2 مل من الوسط واحتضانه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. هذه هي بداية عملية الاختيار.
    3. استبدل الوسط كل يومين ولاحظ الخلايا الميتة ومجموعات الخلايا المقاومة للبورومايسين. قارن النتائج بخلايا التحكم غير المنقولة ، والتي لا تقاوم بورومايسين وتموت.
  5. لبدء الانتقاء النسيلي ، تأكد من نمو المجموعات أحادية النسيلة. لكل 6 ألواح متعددة الآبار:
    1. أضف 200 ميكرولتر من الوسط لكل بئر في 96 بئر متعدد الصفيحات.
      ملاحظة: سيتم طلاء كل خلية مفردة مختارة من 6 آبار متعددة الألواح في آبار فردية من 96 بئر متعدد الصفائح.
    2. استخدم مجهرا لتحديد كل مجموعة أحادية النسيلة في 6 ألواح متعددة الآبار. يمكن ملاحظة المستعمرات المكونة من خلايا مفردة.
    3. استنشاق وسط ثقافة من 6 ألواح متعددة الآبار ، اشطف 1x مع 2 مل من HBSS ، وشفط HBSS.
    4. أضف 10 ميكرولتر من التربسين إلى كل مجموعة أحادية النسيلة لنقل الخلايا المفردة في كل بئر من 96 بئر متعدد الصفائح. احتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  6. بعد 48 ساعة ، استبدل الوسط ب 100 ميكرولتر من الوسط الطازج لكل بئر. كرر هذا الإجراء حتى تتشكل المستعمرات بسبب تمدد الخلايا المفردة.
  7. بمجرد أن تتوسع خلية واحدة جيدا ، قم بوضع كل مجموعة أحادية النسيلة في آبار فردية مكونة من 24 بئر و 6 آبار و 100 مم من ألواح زراعة الخلايا
  8. قم بإنشاء خط خلية أحادي النسيلة مستقر باستخدام طريقة فرز خلية واحدة.
    1. وسط ثقافة الشفط من ألواح زراعة الخلايا 100 مم. اشطف 1x مع 8 مل من HBSS وشفطه.
    2. أضف 2 مل من التربسين على كل طبق واحتضنه لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية. قم بتحييد التربسين بإضافة 8 مل من وسط الاستزراع.
    3. خلايا الطرد المركزي عند 252 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. أضف 4 مل من HBSS إلى كل حبيبات خلية ، وأعد تعليقها بعناية ، وانقلها إلى أنابيب القياس الخلوي.
    4. حقن كل عينة خلية في مقياس التدفق الخلوي (جدول المواد) باستخدام تقنية فرز الخلايا والخلايا المنفصلة ذات التألق الأخضر والأحمر العالي.
    5. نقل الخلايا المختارة إلى 15 مل من الأنابيب المخروطية وخلايا الطرد المركزي عند 252 × جم لمدة 5 دقائق. أضف حبيبات الخلية إلى قارورة T-25 مع 9 مل من وسط نمو خط الخلية المستقر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: بعد فرز الخلايا ، يجب الحصول على ثلاث مجموعات وحيدة النسيلة (الجدول 1).
  9. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسط وأضف 8 مل من الوسط الطازج. كرر هذا الإجراء كل يومين حتى تصل الخلايا إلى التقاء.
    ملاحظة: لدراسة التدفق الذاتي ، يمكن استخدام ضابطين: رابامايسين كمرجع إشارة تدفق ذاتي عالي والكلوروكين كمرجع إشارة تدفق ذاتي منخفض. قم بإعداد محلول مخزون رابامايسين 10 ملي مولار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ومحلول مخزون الكلوروكين 30 ملي مولار في H2O وتخزينه عند -20 درجة مئوية. لتحديد أفضل مجموعة أحادية النسيلة عن طريق اختبار التعبير mCherry و GFP ، يمكن استخدام طريقتين: قياس التدفق الخلوي (الخطوة 1.10) أو تحليل الصور الفلورية عالية المحتوى (الخطوة 1.11).
  10. قياس التدفق الخلوي
    1. البذور 2.5 × 105 خلايا لكل بئر من كل مجموعة أحادية النسيلة في 12 لوحة بئر قبل 24 ساعة على الأقل من المعالجة في 1 مل من وسط نمو خط الخلية المستقر وتحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    2. في يوم العلاج ، قم بإزالة الوسط ، وأضف 1 مل من وسط نمو خط الخلية المستقر مع 2٪ FCS لكل بئر. أضف 10 ميكرومتر من الرابامايسين و 30 ميكرومتر من الكلوروكين إلى وسط نمو خط الخلية المستقر مع 2٪ FCS واحتضانه لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    3. قم بإزالة الوسائط ، واشطفها ب 1 مل من HBSS لكل بئر ، وشفطها.
    4. أضف 500 ميكرولتر من التربسين في كل بئر ، واحتضن دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية وقم بتحييد التفاعل بإضافة 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع. كشط الخلايا ونقلها إلى أنابيب مخروطية.
    5. الطرد المركزي للخلايا عند 252 × جم لمدة 5 دقائق وشفط المادة الطافية. اشطف كريات الخلية ب 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). جهاز طرد مركزي عند 252 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
    6. أضف 500 ميكرولتر من PBS ، وقم بنقل الخلايا إلى أنابيب القياس الخلوي ، وحقن كل عينة في معدات القياس الخلوي. لكل شرط ، اجمع 10,000 حدث.
    7. لتحديد السكان أحادي النسيلة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، استخدم ليزر 488 نانومتر لإثارة EGFP وليزر 633 نانومتر ل mCherry. بعد ذلك ، قم بإنشاء نسبة من mCherry و EGFP الفلوري لتحديد مجموعة الخلايا ذات التدفق الذاتي المرتفع والمنخفض.
  11. تحليل صور الفلورسنت عالية المحتوى
    1. البذور 4 × 103 خلايا من كل مجموعة أحادية النسيلة لكل بئر في 384 لوحة بئر (جدار أسود / قاع صافي) في وسط نمو مكمل ب 10٪ FCS و 1٪ P / S و 2.5 ميكرولتر / مل بورومايسين. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة قبل العلاج.
    2. قم بإزالة الوسط وأضف 10 ميكرومتر من الرابامايسين و 30 ميكرومتر من الكلوروكين في 50 ميكرولتر من وسط نمو خط الخلية المستقر المكمل ب 2٪ FCS لكل بئر. احتضان لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    3. قم بإزالة الوسائط واشطفها ب 50 ميكرولتر من HBSS لكل بئر وشفطها. قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة PFA واشطفه ب 50 ميكرولتر من HBSS لكل بئر.
    4. لتحديد نوى الخلية ، قم بتلطيخ Hoechst 33342 (2.5 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. صبغة Aspirate Hoechst 33342 ، اشطفها ب 50 ميكرولتر من HBSS لكل بئر ، وأضف 50 ميكرولتر من PBS لكل بئر.
    5. إجراء الحصول على البيانات وتحليل التدفق الذاتي الذي تم الحصول عليه بواسطة منصة HTS كما هو موضح في القسم 3.
      ملاحظة: تعتمد معايير اختيار السكان أحادي النسيلة على ما إذا كان التدفق الذاتي يزيد أو ينخفض مع الرابامايسين أو الكلوروكين ، على التوالي (الجدول 1). تعتبر المستنسخة ذات المستويات العالية من تعبير mCherry و GFP أكثر ملاءمة لتحليل صور الفلورسنت بدقة عالية المحتوى ، وتحديد كمية تدفق الالتهام الذاتي.

2. مقايسة التدفق الذاتي المستند إلى الصور في الخلايا الغضروفية الحية

ملاحظة: بعد تحديد استنساخ ، ابدأ الفحص لتحديد التدفق الذاتي.

  1. باستخدام ماصة إلكترونية محمولة باليد 384 قناة ، قم بزرع 4 × 103 خلايا من الاستنساخ المحدد (الخطوة 1.11) لكل بئر في 384 لوحة بئر (جدار أسود / قاع شفاف) في 50 ميكرولتر من وسط نمو خط الخلية المستقر مع 10٪ FCS ، و 1٪ P / S ، و 2.5 ميكرولتر / مل بورومايسين لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة قبل العلاج.
  2. في يوم التجربة ، قم بإعداد لوحة فاصلة للإضافة المركبة.
    1. أضف حجما من كل مركب/عناصر تحكم ووسط نمو خط خلوي مستقر إلى لوحة الفاصل الزمني باستخدام تقنية معالجة السائل الصوتي وماصة إلكترونية 384 قناة، على التوالي، للحصول على تركيز فاصل زمني.
      ملاحظة: تضمنت الضوابط في هذا الاختبار وسط نمو خط خلوي مستقر مكملا بنسبة 2٪ FCS و 30 ميكرومتر من الكلوروكين و 10 ميكرومتر رابامايسين. تعتمد تركيزات الفاصل الزمني على التركيز النهائي المطلوب. على سبيل المثال ، في هذا الاختبار ، تمت إضافة الكلوروكين والرابامايسين في 50 ميكرولتر من وسط نمو خط الخلية المستقر لكل بئر للحصول على تركيز فاصل قدره 300 ميكرومتر و 100 ميكرومتر ، على التوالي.
    2. باستخدام روبوت غسالة الصفيحة الدقيقة ، قم بشفط الوسط من لوحة الخلية بطريقة آلية وأضف 45 ميكرولتر من وسط نمو خط الخلية المستقر المكمل بنسبة 2٪ FCS لكل بئر.
    3. ثم انقل 5 ميكرولتر لكل بئر من لوحة الفاصل الزمني إلى لوحة الفحص للحصول على تركيز نهائي باستخدام محطة عمل معالجة السوائل الآلية الأخرى.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 16 ساعة. باستخدام روبوت غسالة صفيحة دقيقة ، استنشق الوسيط.
  4. قم بإصلاح الخلايا التي تحتوي على 50 ميكرولتر من 4٪ PFA لكل بئر لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. يغسل ب 50 ميكرولتر من HBSS لكل بئر.
  5. قم بتلطيخ النوى باستخدام Hoechst 33342 (2.5 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. شفط Hoechst 33342 واشطفه ب 50 ميكرولتر من HBSS لكل بئر.
  6. أضف 50 ميكرولتر من PBS لكل بئر. اللوحة جاهزة الآن للقراءة وجمع البيانات والتحليل اللاحق.
    ملاحظة: تم وصف هذا البروتوكول للفحص عالي الإنتاجية (HTS). ومع ذلك ، إذا تم استخدام عدد قليل من المركبات ، فيمكن إضافتها يدويا ، بدون أدوات أوتوماتيكية. يسهل الحد الأدنى من التلاعب بالخلايا والمواد الطاففية باستخدام أدوات معالجة السوائل المعايرة و / أو الماصات الإلكترونية الإعداد الناجح للطبقات أحادية زراعة الخلايا لتقدير كمية تدفق الالتهام الذاتي عن طريق تحليل صور الفلورسنت عالية المحتوى.

3. الحصول على البيانات وتحليل تدفق البلاعم الذاتي

  1. للحصول على البيانات ، استخدم نظام فحص المحتوى العالي (HCS) والمجهر الآلي ، والذي يسمح بالحصول على الصور وتحليلها آليا بواسطة خوارزمية معالجة الصور.
  2. لتطوير بروتوكول اكتساب ، حدد عدة قنوات وأوقات تعرض (الجدول 2) لتحديد النوى وتشكيل الجسيمات الذاتية والجسيمات التحللية الذاتية أثناء أحداث التدفق الذاتي.
  3. لكل بئر ، اجمع الصور من أربعة حقول تغطي سطح البئر وفي أربعة أكوام تبدأ من 8 ميكرومتر مفصولة بمسافة عمل قدرها 0.2 ميكرومتر. التقط الصور باستخدام هدف 60x للتصوير التفصيلي للخلية.
  4. قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الصور الذي يوفره مجهر HCS. لتطوير خوارزمية بروتوكول تحليل قوية لمراقبة تدفق الالتهام الذاتي ، حدد الطريقة الأنسب لتجزئة صورة الخلية الآلية وللكشف على وجه التحديد عن البقع المقابلة لتنشيط LC3. قم بإجراء تسلسل التحليل النهائي عن طريق إضافة الطرق وخطوات تجزئة الخلايا وتعليمات القياس الكمي كما هو موضح أدناه:
    1. انقر فوق الكتلة البرمجية الإنشائية Find Nuclei واختر قناة الصبغة النووية Hoechst 33342. حدد الطريقة واختر نوى مجموعة الإخراج.
    2. انقر فوق الكتلة الأساسية Find Cytoplasm واختر قناة صبغة السيتوبلازمية Fluorescein. حدد الطريقة | العتبة الفردية.
    3. انقر فوق الكتلة الأساسية Find Cytoplasm (2) واختر RFP لقناة صبغة السيتوبلازم. حدد الطريقة | العتبة الفردية.
    4. انقر فوق الكتلة البرمجية الإنشائية للسكان وحدد نوى مجتمع الدراسة. حدد طريقة عوامل التصفية الشائعة (إزالة كائنات الحدود) واختر مجموعة الإخراج Nuclei Inside Border.
    5. انقر فوق الكتلة البرمجية الإنشائية Find Spots واختر قناة العلامة المحددة Fluorescein. حدد مجموعة الدراسة النوى داخل الحدود وحدد منطقة الدراسة السيتوبلازم. حدد الطريقة واختر البقع داخل الحدود.
    6. انقر فوق الكتلة البرمجية الإنشائية Find Spots (2) واختر RFP لقناة العلامة المحددة. حدد مجموعة الدراسة النوى داخل الحدود وحدد منطقة الدراسة السيتوبلازم (2). حدد الطريقة واختر النقاط الناتجة (2) داخل الحدود.
    7. انقر فوق الكتلة البرمجية الإنشائية حساب خصائص الكثافة واختر قناة العلامة المحددة Fluorescein. حدد مجموعة الدراسة النوى داخل الحدود وحدد منطقة الدراسة بقعة. حدد الطريقة واختر خصائص الإخراج Intensity Spot Fluorescein Inside Borders.
    8. انقر فوق الكتلة البرمجية الإنشائية حساب خصائص الكثافة واختر RFP لقناة العلامة المحددة. حدد مجموعة الدراسة النوى داخل الحدود وحدد منطقة الدراسة بقعة (2). حدد الطريقة واختر خصائص الإخراج Intensity Spot (2) RFP Inside Borders.
    9. انقر فوق الكتلة البرمجية الإنشائية تحديد النتائج ، وحدد عدد النوى داخل الحدود ، وحدد عدد كائنات النوى (متوسط) ، وحدد بقع الكثافة النسبية الفلورسين - المتوسط لكل بئر ، وحدد بقع الكثافة النسبية (2) - RFP - المتوسط لكل بئر.
  5. لتحديد التدفق الذاتي ، استخدم نفس الطريقة الموضحة سابقا لتحليل قياس التدفقالخلوي 11. حدد نسبة mCherry / EGFP للبقع ذات الكثافة النسبية.
    ملاحظة: الخلايا ذات التدفق العالي تكون أقل خضرة ، مما يزيد من نسبة mCherry / EGFP في الخلية. يعد تحديد عدد ذي مغزى من الإشارات ذات الصلة القادمة من أحداث تدفق الالتهام الذاتي في الخلايا وتحديده بدقة أمرا مهما للغاية لإنشاء اختلافات ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن مراقبة التدفق الذاتي في الخلايا عن طريق التعديل الدوائي أو عن طريق استجابة إجهاد الخلية. تم استخدام الخلايا الغضروفية البشرية الخالدة (T / C28a2) لتطوير خط خلية مراسل الالتهام الذاتي باستخدام LC3 كمراسل فلوري (mCherry-EGFP-LC3B) للالتهام الذاتي. يوضح الشكل 1 سير العمل التخطيطي لمقايسة الفحص بدءا من تطوير خط خلية مراسل الالتهام الذاتي في الخلايا الغضروفية البشرية (mCherry-EGFP-LC3-T / C28a2) ، إلى تحريض أو تثبيط التدفق الذاتي عن طريق التعديل الدوائي ، ثم تحليل البيانات الذي يتم إجراؤه با...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الالتهام الذاتي المعيب سمة مميزة مهمة لتنكس المفاصل المرتبط بالشيخوخة ، ولكن لا تتوفر حتى الآن العلاجات الوقائية أو المعدلة للمرض التي تستهدف الالتهام الذاتيلتنكس الغضروف 2. نظرا لأهميته وآثاره السريرية ، أصبح الالتهام الذاتي هدفا مثيرا للاهتمام لاكتشاف الأدوية وتطويرها ، على الرغم من أن طرق المراقبة المباشرة للتغيرات في آلية التوازن الرئيسية هذه أثبتت أنها صعبة.

هنا ، يتم وصف اختبار النمط الظاهري القائم على الخلية لتحديد التدفق الذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل معهد Salud Carlos III- Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spain, Plan Estatal 2013-2016 و Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), "Una manera de hacer Europa", PI14/01324 و PI17/02059, بواسطة منصة Innopharma Pharmacogenomics المطبقة للتحقق من صحة الأهداف واكتشاف الأدوية المرشحة للمراحل قبل السريرية, Ministerio de Economía y Competitividad. كما نشكر مؤسسة أبحاث أمراض الروماتيزم (FOREUM) على دعمها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
لوحة ثقافة الخلية 100 ممثقافة الخليةكورنينج430167
لوحة ثقافة الخلية 12 بئر متعدد الألواحكورنينج353043لوحة ثقافة الخلية
15 مل أنبوب مخروطي للطرد المركزيFalcon-Corning352095أنبوب مخروطي
24 بئر متعدد الألواحلوحة زراعةالخلية 351147ثقافة
الخلية 25 سم 2 قارورةثقافة الخليةFalcon-Corning353014قارورة ثقافة الخلايا
384 بئر متعددة الألواح حامل الخليةPerkin Elmer6007550لوحة ثقافة الخلية
6 آبار متعددة الألواحCorning351146لوحة ثقافة الخلية
96 بئر متعدد الألواحلوحة Corning353077لوحة ثقافة الخلية
تكنولوجيا معالجة السوائل الصوتيةLabcyte& ناقص ؛https://www.labcyte.com
الكلوروكينسيجما-ألدريتشC6628مثبط التدفق الذاتي
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريD2650مذيبات
وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM)لونزا ، بازل ، سويسراBE-604FT / C28a2 متوسط النمو
الحد الأدنى من الوسط الأساسي للنسر (EMEM)ATCC30 & ndash ؛ 2003HEK 293-T17 متوسط النمو
FACScalibur مقياس الخلويBecton Dickinson, CA& ناقص ;https://www.bdbiosciences.com/en-eu
مصل الأبقار الجنينية (FBS)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريF9665HEK 293-T17 مصل
العجل الجنيني (FCS)جيبكو من Life Technologies ، CA26010 & ndash ؛ 074مصل
FuGenePromegaE2691خليط غير شحمي من الدهون كطريقة توصيل البلازميد لإنشاء خط خلية تم الإبلاغ عنه عن الالتهام
ماصة إلكترونية محمولة 384 قناةIntegra& ناقص ؛https://www.integra-biosciences.com/united-states/en/electronic-pipettes/viaflo-96384#downloads
محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS)سيجما ألدريتشH6648العازلة
HEK 293-T17ATCCCRL-11268خط خلايا الكلى. تم استخدام الخلايا لتسهيل التعبئة والتغليف الفيروسي القهقري
نظام فحص المحتوى العاليPerkin Elmer& minus;https://www.perkinelmer.com/es/product/operetta-cls-system-hh16000000
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific62249لتلوين الحمض النووي
Perkin Elmer& ناقص ؛https://www.perkinelmer.com/es/product/harmony-4-9-office-license-hh17000010
محطة عمل مناولة السوائلPerkin Elmer& ناقص ؛https://www.perkinelmer.com/es/category/janus-liquid-handler-workstations
روبوت غسالة MicroplateBiotek& ناقص ؛https://go.biotek.com/405tradein
Opti-MEM® (1x)Thermo Fisher Scientific11058وسيط تعداء
بارافورمالدهيد (PFA)Sigma-Aldrich158127Fixer
pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3BAddgene ، كامبريدج ، ماساتشوستس22418بلازميد
pCL-EcoAddgene ، كامبريدج ، ماساتشوستس12371بلازميد
البنسلين الستربتومايسين (P / S)سيجما ألدريتشP0781مضاد حيوي
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)MP Biomedicals2810305Buffer
PuromycinSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوريP8833المضاد الحيوي
RapamycinCalbiochem ، ألمانيا5053210منشط التدفق الذاتي
برنامج CellQuestProBecton Dickinson& ناقص ؛https://www.bdbiosciences.com/en-eu
مرشحات الحقن 0.45 & mu ؛ مكورنينجCLS431220مرشح معقم
T / C28a2& ناقص ؛& ناقص;خط خلايا الغضروف البشرية
التربسينجيبكو من Life Technologies ، CA15400054Trypsin المستخدمة مع خلايا T / C28a2
TrypsinSigma-Aldrich ، سانت لويس ، MOSM-2002-CTrypsin المستخدمة مع خلايا HEK 293-T17
VSV. جيأدجين ، كامبريدج ، ماساتشوستس14888بلازميد
لوحة لوحة الذاتي برنامج تحليل الصور

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Lotz, M. K., Carames, B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nature Reviews Rheumatology. 7 (10), 579-587 (2011).
  3. Carames, B., Taniguchi, N., Otsuki, S., Blanco, F. J., Lotz, M. Autophagy is a protective mechanism in normal cartilage, and its aging-related loss is linked with cell death and osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 62 (3), 791-801 (2010).
  4. Carames, B., Olmer, M., Kiosses, W. B., Lotz, M. K. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis & Rheumatology. 67 (6), 1568-1576 (2015).
  5. Kroemer, G. Autophagy: a druggable process that is deregulated in aging and human disease. The Journal of Clinical Investigation. 125 (1), 1-4 (2015).
  6. Leidal, A. M., Levine, B., Debnath, J. Autophagy and the cell biology of age-related disease. Nature Cell Biology. 20 (12), 1338-1348 (2018).
  7. Maiuri, M. C., Kroemer, G. Therapeutic modulation of autophagy: which disease comes first. Cell Death & Differentiation. 26 (4), 680-689 (2019).
  8. Vinatier, C., Dominguez, E., Guicheux, J., Carames, B. Role of the inflammation- autophagy-senescence integrative network in osteoarthritis. Frontiers in Physiology. 9, 706(2018).
  9. du Toit, A., Hofmeyr, J. S., Gniadek, T. J., Loos, B. Measuring autophagosome flux. Autophagy. 14 (6), 1060-1071 (2018).
  10. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO Reports. 10 (2), 173-179 (2009).
  11. Gump, J. M., Thorburn, A. Sorting cells for basal and induced autophagic flux by quantitative ratiometric flow cytometry. Autophagy. 10 (7), 1327-1334 (2014).
  12. Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and Measuring Autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).
  13. Nogueira-Recalde, U., et al. Fibrates as drugs with senolytic and autophagic activity for osteoarthritis therapy. EBioMedicine. 45, 588-605 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LC3 mCherry EGFP LC3B
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة