انخفاض بروتيوستاتيكي هو السمة المميزة للشيخوخة، وتسهيل ظهور الأمراض العصبية. نحن الخطوط العريضة لبروتوكول لقياس قياس كميا proteostasis في اثنين من مختلف الأنسجة Elegans Caenorhabditis من خلال التعبير heterologous من polyglutamine يكرر تنصهر لمراسل الفلورسنت. يسمح هذا النموذج بسرعة في التحليل الجيني في الجسم الحي للبروتيوستاسي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس الانخفاض البروتيني البروتيوستيكي الخاص بالأنسجة في إليجانات Caenorhabditis
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
القدرة على الحفاظ على وظيفة سليمة وقابلة للطي من البروتيوم (البروتين التوازن) تنخفض خلال الشيخوخة العادية، مما يسهل ظهور عدد متزايد من الأمراض المرتبطة بالعمر. على سبيل المثال، البروتينات مع توسعات البوليغلوتامين عرضة للتراكم، كما يتضح من بروتين هنتنغتين وما يصاحبه من بداية مرض هنتنغتون. وقد درس على نطاق واسع تدهور المرتبطة بالعمر من البروتيوم من خلال استخدام elegans Caenorhabditis المعدلة وراثيا التعبير عن polyQ يكرر تنصهر إلى بروتين الفلورسنت الأصفر (YFP). هذا النموذج الحيواني المعدل وراثيا polyQ::YFP يسهل القياس الكمي المباشر للانخفاض المرتبط بالعمر من البروتيوم من خلال تصوير التكوين التدريجي لل البؤر الفلورية (أي مجاميع البروتين) وظهور عيوب الحركة اللاحقة التي تتطور نتيجة لانهيار البروتيوم. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون التعبير عن المتحول متعدد التخصصات: YFP مدفوعا بجهات مروجة خاصة بالأنسجة ، مما يسمح بتقييم البروتيوستاسي عبر الأنسجة في سياق كائن حي متعدد الخلايا سليم. هذا النموذج قابل للغاية للتحليل الجيني ، وبالتالي توفير نهج لتحديد حجم الشيخوخة التي تكمل اختبارات العمر. نحن نصف كيفية قياس بدقة متعدد الأضلاع::تشكيل بؤر YFP داخل الخلايا العصبية أو عضلة جدار الجسم أثناء الشيخوخة، وظهور العيوب السلوكية اللاحقة. بعد ذلك، نسلط الضوء على كيفية تكييف هذه النهج مع الإنتاجية العالية، والتطبيقات المستقبلية المحتملة باستخدام استراتيجيات ناشئة أخرى للتحليل الجيني C. elegans.
المقدمة
البروتين التوازن (بروتيوستسيس) يعرف بأنه القدرة الخلوية للحفاظ على وظيفة مناسبة وقابلة للطي من البروتيوم. التحدي الكامن في البروتيوستاسيس هو ضمان طي جميع البروتينات بشكل صحيح والحفاظ عليها في تشكيل أصلي ، والذي يتم تضخيمه بشكل أكبر من خلال الطبيعة المتنوعة لحجم البروتين ، وتكوين الأحماض الأمينية ، والتكوين الهيكلي ، والاستقرار ، والدوران ، والتعبير ، والتجزيء دون الخلوي ، والتعديلات1. يتم الحفاظ على بروتيوستسيس من خلال العمل المنسق لشبكة بروتيوستاتيكي كبيرة، تتكون من ما يقرب من 2000 البروتينات الفريدة، والتي تنظم التوليف السليم، للطي، والاتجار، وتدهور داخل البروتيوم2،3. مكونات حصان العم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف
- اختر الجينات ذات الأهمية التي سيتم تعطيلها عن طريق RNAi القائم على التغذية. شراء مخزونات من HT115 E. القولونية التي تحتوي على استنساخ RNAi منالفائدة 20. بدلا من ذلك، subclone cDNA من الجين من الفائدة في موقع متعدد النسيلة من البلازميد L4440.
ملاحظة: لمنع تدهور dsRNA داخل البكتيريا، استخدم سلالة HT115. هذا هو RNase الثالث ناقص E. القولونية سلالة مع IPTG-inducible T7 نشاط البوليميراز. بالنسبة لدراسات البروتيوستاسي التي لا تستخدم ال RNAi القائم على التغذية، يمكن استخدام إما HT115 أو OP50 E. coli على لوحات NGM القياسية. - إعداد لوحات 5 × 6 سم لكل حالة اختبار. للتجارب باستخدام RNAI، حث....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في C. elegans، كان نموذج تكرار البوليglutamine مفيدا لتحديد الجينات التي تنظم الشبكة البروتيوستاتيكية. على سبيل المثال، أظهرنا سابقا أن كيناز البروتين التفاعل homeodomain (hpk-1)، وهو عامل مساعد النسخ، ويؤثر على البروتيوستاسيس أثناء الشيخوخة من خلال تنظيم التعبير عن autophagy والمرافقين الجزيئية31. وجدنا أن فقدان hpk-1، إما عن طريق إسكات RNAi أو في hpk-1 (pk1393) الحيوانات المتحولة فارغة ، يزيد من عدد المجاميع Q35::YFP التي تتراكم أثناء الشيخوخة. اليوم .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتتميز الشيخوخة من قبل انخفاض تدريجي في البروتيوستاسيس. يتم الحفاظ على البروتيوستازي من خلال نظام معقد، شبكة بروتيوستاتيكي، للتحكم المنسق والديناميكي والمستجيب للإجهاد في طي البروتين وتدهوره وترجمته. لماذا يفشل البروتيوستاسي في سياق الشيخوخة غير مفهومة بشكل جيد ، ولكن epigenome المتحللة ، وانخفاض عدم قابلية استجابات الإجهاد ، وفقدان الكلام المتبادل التعويضي تتزامن جميعها مع هذا الانهيار. في C. elegans ، ينخفض قابلية النسخ لأشكال متعددة من الاستجابة للإجهاد بسرعة في غضون ساعات قليلة بعد ظهور الإنجاب بسبب تكوين عل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نود أن نشكر الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر سامويلسون على مساعدتهم في صقل هذه الطريقة و/ أو المناقشة التي ساعدت على تطوير هذه المخطوطة. تم دعم الأبحاث التي تم الإبلاغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للشيخوخة للمعاهد الوطنية للصحة تحت أرقام الجوائز RF1AG062593 وR21AG064519. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار نشر المخطوطة أو إعدادها.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 24 لوحة ثقافة الآبار | Greiner Bio-One | # 662102 | |
| 2 مل 96 ألواح بئر | Greiner Bio-One | # 780286 | |
| 600 & micro ؛ L 96 بئر ألواح | Greiner Bio-One | # 786261 | |
| 96 دبوس لوحة مكررة | Nunc | 250520 | |
| ختم اللوحة المنفذة للهواء | VWR | 60941-086 | |
| أجار البكتريولوجي | Affymetrix / USB | 10906 | |
| باكتو الببتون | VWR | 90000-368 | |
| C. elegans مكتبة استنساخ RNAi في بكتيريا HT115- Ahringer | المصدر علم الأحياء | الحيوي C. ايليجانس مجموعة الحمض النووي الريبي (أهرينجر) | انظر أيضا كاماث وآخرون ، طبيعة سجية 2003. |
| C. elegans مكتبة استنساخ RNAi في بكتيريا HT115- Vidal | Source Bioscience | C. elegans مورد ORF-RNAi (Vidal) | انظر أيضا Rual et al. ، أبحاث الجينوم 2004. هذه المكتبة متاحة أيضا من Dharmacon. |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| زلات غطاء المجهر الزجاجي | VWR | 48404-455 | |
| شرائح المجهر الزجاجي | VWR | 160004-422 | |
| IPTG (الأيزوبروبيل بيتا-D-1-thigalactopyranoside) | Gold Bio | 12481C100 | |
| لوحة بئر واحدة غير معالجة ، 128x86mm | Thermo-Fisher | 242811 | |
| أزيد الصوديوم ، CAS # 26628-22-8 | سيجما ألدريتش | S2002 | |
| مجهر Zeiss Axio Imager M2m مع برنامج AxioVision v4.8.2.0 | Zeiss | غير معروف | |
| Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad مجهر | Zeiss | غير معروف |
المراجع
- Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Powers, E. T., Morimoto, R. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
