مقالة منهجية

تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا

3.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61112

⸱

مايو 31, 2020

 , 
1Institute for Human Infections and Immunity, University of Texas Medical Branch, 2Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch, 4World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses, University of Texas Medical Branch

في هذه المقالة

ملخص

ويمكن للبروتوكول المقدم أن يحدد كفاءة البعوض Aedes aegypti في حالات الإصابة بفيروس معين، مثل زيكا، في بيئة احتواء.

الملخص

وتصف الإجراءات المقدمة منهجية معممة لإصابة بعوض Aedes aegypti بفيروس زيكا في ظل ظروف مختبرية لتحديد معدل العدوى، والعدوى المنتشرة، واحتمال انتقال الفيروس بين البعوض المعني. وتستخدم هذه الإجراءات على نطاق واسع مع تعديلات مختلفة في تقييمات الكفاءة ناقلات على الصعيد العالمي. وهي مهمة في تحديد الدور المحتمل الذي يمكن أن تلعبه بعوضة معينة (أي الأنواع والسكان والأفراد) في انتقال عامل معين.

المقدمة

ويعرف الكفاءة ناقلات القدرة على مستوى الأنواع, السكان, وحتى فرد, من المفصليات معينة مثل البعوض, القراد, أو ذبابة الرمل phlebotomine, للحصول على ونقل عامل بيولوجيا مع تكرار أو تطوير في المفصليات1,2. وفيما يتعلق بالبعوض والفيروسات المنقولة بالمفصليات (أي الفيروسات الأربو)، فإن العامل يتم إصابة العامل من مضيف فيرميا بعوضة أنثى. بعد الابتلاع ، يجب أن يصيب الفيروس بشكل منتج واحدة من مجموعة صغيرة من الخلايا الظهارية المتوسطةالغوت 3، والتغلب على العقبات الفسيولوجية المختلفة مثل التدهور البروتيوليك بواسطة الإنزيمات الهضمية ، ووجود الميكروبات (حاجز العدوى في منتصف الطريق ، أو MIB) ، والمصفوفة المحيطية المفرزة. يجب أن يتبع عدوى ظهارة منتصف الغوت تكرار الفيروس والهروب في نهاية المطاف من منتصف الطريق إلى نظام الدورة الدموية المفتوح للبعوض ، أو الهيموليم ، والذي يمثل بداية عدوى تنتشر للتغلب على حاجز الهروب من منتصف الطريق (MEB). عند هذه النقطة يمكن للفيروس إنشاء التهابات الأنسجة الثانوية (مثل الأعصاب والعضلات والهيئات الدهنية) والاستمرار في تكرار، على الرغم من أن مثل هذا النسخ المتماثل الثانوي قد لا يكون ضروريا تماما للفيروس لإصابة الخلايا الأسينارية في الغدد اللعابية (التغلب على حاجز عدوى الغدة اللعابية). الخروج من خلايا الغدة اللعابية acinar في تجاويفها apical ومن ثم الحركة في القناة اللعابية تمكن تلقيح الفيروس إلى المضيفين اللاحقة على العض، ويكمل دورة انتقال1،2،4،5،6،7.

وبالنظر إلى هذه الآلية الجيدة الخصائص والمحافظ عليها عموما للانتشار داخل ناقل البعوض، فإن تقييمات كفاءة ناقلات الأمراض المختبرية غالبا ما تكون متشابهة منهجيا، على الرغم من وجود اختلافات في البروتوكولات1و2. عموما، بعد التعرض للفيروس عن طريق الفم، يتم تشريح البعوض بحيث يمكن فحص الأنسجة الفردية مثل المنتصف والساقين والمبيضين والغدد اللعابية للعدوى الفيروسية، ونشر العدوى، ونشر العدوى / انتقال العدوى عبر المتغير المحتمل، ونشر العدوى / الكفاءة المحتملة لانتقال العدوى، على التوالي8. وجود مجرد فيروس في الغدد اللعابية، ومع ذلك، ليس دليلا قاطعا على القدرة على انتقال العدوى، نظرا للأدلة على وجود حاجز الهروب / الخروج الغدة اللعابية (SGEB) في بعض مجموعات ناقلات / فيروس1،2،4،5،7،9. الطريقة القياسية لإثبات كفاءة انتقال العدوى لا تزال انتقال البعوض إلى عرضة10،11،12. ومع ذلك ، بالنظر إلى أن العديد من arboviruses هذا يتطلب استخدام نماذج المورين مناعة13،14،15،16، هذه الطريقة غالبا ما تكون باهظة التكلفة. والبديل الشائع الاستخدام هو جمع لعاب البعوض، الذي يمكن تحليله عن طريق النسخ العكسي - البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) أو إجراء فحص معد لإثبات وجود الجينوم الفيروسي أو الجسيمات المعدية، على التوالي. وتجدر الإشارة إلى أن طرق جمع اللعاب في المختبر هذه قد تبالغ في تقدير12 أو تقلل منشأن 17 كمية الفيروس المودع أثناء التغذية الحية، مما يشير إلى أنه يجب تفسير هذه البيانات بحذر. ومع ذلك ، فإن طريقة المختبر ذات قيمة عالية عند تحليلها من منظور مجرد وجود فيروس في اللعاب ، مما يشير إلى إمكانية انتقال العدوى.

ويوجد نهجان رئيسيان لتحديد دور ناقلات البعوض في فاشيات الأمراض الأروفيرالية. تتضمن الطريقة الأولى الترصد الميداني، حيث يتم جمع البعوض في سياق الانتقال النشط18و19و20و21و22و23و24. ومع ذلك، وبالنظر إلى أن معدلات العدوى عادة ما تكون منخفضة جدا (على سبيل المثال، معدل العدوى المقدر بنسبة 0.061٪ للبعوض في مناطق دوران فيروس زيكا النشط (ZIKV) في الولايات المتحدة21)،يمكن أن يكون تجريم الأنواع الناقلة المحتملة متحيزا بشدة من خلال منهجية المحاصرة25و26 وفرصة عشوائية (على سبيل المثال، أخذ عينات من فرد مصاب واحد من أصل 1600 غير مصاب)21 . مع أخذ ذلك في الاعتبار ، قد لا تكتسب دراسة معينة ما يكفي من البعوض في كل من الأعداد الخام أو تنوع الأنواع لأخذ عينات دقيقة من البعوض المشارك في انتقال العدوى. وعلى النقيض من ذلك، تجرى تحليلات كفاءة النواقل في بيئة مختبرية، مما يسمح بمراقبة صارمة لمعلمات مثل الجرعة الفموية. ورغم أن هذه التقييمات المختبرية غير قادرة تماما على تمثيل التعقيد الحقيقي للعدوى بالبعوض والقدرة على انتقاله في بيئة ميدانية، فإنها تظل أدوات قوية في مجال علم الفيروسات.

استنادا إلى تحليلات الكفاءة ناقلات مختلفة مع ZIKV في العديد من أنواع البعوض، populations، وأساليب27،28،29،30،31،32،فضلا عن استعراض مؤخرا لتقييمات الكفاءة ناقلات1،ونحن نصف هنا العديد من البروتوكولات المرتبطة سير العمل كفاءة ناقلات نموذجية. في هذه التجارب تعرض ثلاثة من سكان Ae. aegypti من الأمريكتين (مدينة سلفادور، البرازيل؛ الجمهورية الدومينيكية؛ ووادي ريو غراندي السفلي، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية) لسلالة واحدة من ZIKV (Mex 1-7، GenBank Accession: KX247632.1) عند 4 أو 5 أو 6 سجل10 وحدات تشكيل بؤري (FFU)/mL عن طريق الجرعات الاصطناعية من الدم. في وقت لاحق ، تم تحليلها للحصول على أدلة على العدوى ، ونشر العدوى ، وكفاءة انتقال العدوى بعد أوقات مختلفة من الحضانة الخارجية (2 و 4 و 7 و 10 و 14 يوما) عن طريق التشريح و المقايسة المعدية القائمة على ثقافة الخلية. على الرغم من أن سير العمل الحالي / البروتوكولات محسنة ل ZIKV ، إلا أن العديد من العناصر قابلة للترجمة مباشرة إلى الفيروسات arboviruses الأخرى التي يحملها البعوض في مستويات احتواء المفصليات والسلامة الحيوية 2 و 3 (ACL / BSL2 أو ACL / BSL3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت جميع الإجراءات التي أجريت في هذه البروتوكولات في امتثال تام للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية للسلامة البيولوجية واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للفرع الطبي لجامعة تكساس في غالفستون.

1. تضخيم ZIKV في خلايا فيرو

  1. تنمو خلايا Vero (CCL-81 أو VeroE6) في تعديل دولبيكو للوسط الأساسي الأدنى للنسر (DMEM) المكمل ب 10٪ v/v مصل بقرة الجنين المعطل حراريا (FBS)، و1٪ (v/v) البنسلين-ستربتوميسين (100 U/mL و 100 ميكروغرام/مل، على التوالي) في حاضنة 37 درجة مئوية مرطبة مع 5٪ CO2 إلى ما بين 80-90٪ التقاء في قارورة زراعة الأنسجة 150 سم2.
  2. في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) ، قم بإزالة الوسط والتخلص منه إما في تبييض بنسبة 10٪ أو تخفيف عمل الأمونيوم الرباعي المزدوج(جدول المواد). تلقيح الطبقة الأحادية على الفور بمخزون فيروسي واحد مل، بهدف 0.1−1 جسيم فيروسي معدي لكل خلية. حرض القارورة على الفور بحيث يتصل inoculum بالطابير الأحادي في مجمله.
  3. أعلى المتوسطة إلى حجم 5 مل باستخدام DMEM تكملها مع 2٪ v/v الحرارة تعطيل FBS، و 1٪ (v/v) البنسلين-streptomycin. ثم نقل القارورة إلى حاضنة 37 درجة مئوية الرطبة مع 5٪ CO2 لمدة 60 دقيقة.
  4. إزالة القارورة من الحاضنة وتقديمه إلى BSC. إضافة متوسطة إضافية إلى حجم إجمالي قدره 15 مل باستخدام DMEM تكملها مع 2٪ v/v الحرارة تعطيل FBS، و 1٪ (v/v) البنسلين-streptomycin. نقل القارورة إلى حاضنة 37 درجة مئوية مرطبة مع 5٪ CO2.
  5. فحص القارورة يوميا تحت المجهر النقيض المرحلة للحصول على أدلة على الآثار الخلوية (CPE). انتقل إلى الحصاد الفيروسي (الخطوة 1.7) عندما يبقى ما يقرب من 40−50٪ فقط من الخلايا في الطبقة الأحادية ، عادة 3-5 أيام بعد الإصابة اعتمادا على سلالة ZIKV المستخدمة.
  6. يستنشق supernatant ومكان في قارورة مخروطية 50 مل. توضيح النتواء الفائق للحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي (3500 × غرام لمدة 20 دقيقة).
    ملاحظة: إذا كانت قوارير متعددة مصابة بشكل متطابق، يمكن دمج الناسخات من قوارير متعددة في أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
  7. إزالة supernatant من أنبوب مخروطي 50 مل إلى واحدة جديدة، مع الحرص على عدم تعطيل بيليه. تكملة supernatant مع FBS الحرارة المعطلة إلى تركيز النهائي من 30٪ (v/v). Aliquot هذا الخليط في أنابيب غطاء المسمار الفردية وتجميد في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. إعداد دقيق الدم الاصطناعي

  1. في اليوم الذي يتعرض فيه البعوض لدقيق الدم المعدي ، قم بتشغيل مصدر الطاقة(جدول المواد)في منشأة احتواء المفصليات بحيث يتم تسخين وحداتالتغذية (جدول المواد)بحلول الوقت الذي يتم فيه إعداد البعوض للتعرض.
  2. إعداد دقيق الدم الاصطناعي باستخدام إحدى الطرق الموضحة أدناه.
    1. الطريقة 1: الجمع بين حصادها حديثا (في غضون أسبوع) citrated أو الدم البشري الهيبارين شراؤها تجاريا 1:1 v/v مع المخزون الفيروسي (أعدت على النحو المبين في القسم 1).
      ملاحظة: هذه الطريقة تعتمد على عدم وجود أي أجسام مضادة لعائلة الفيروس/الفيروس الموجودة في الدم.
    2. إذا لم يتم تأكيد عدم وجود أجسام مضادة أو كان من المعروف أن مصدر الدم لديه التعرض للفيروسات الفلافية السابقة، وغسل وحزمة كريات الدم الحمراء يدويا.
      1. في BSC، أضف 30 مل من الدم البشري الكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل وأعلى حتى 50 مل مع ملحي عازل للفوسفات (PBS).
      2. جهاز طرد مركزي عند 3500 × غرام لمدة 20 دقيقة.
      3. يستنشق supernatant إما عن طريق صب بلطف في مقلاة صينية تحتوي إما على 10٪ التبييض أو تخفيف العمل من الأمونيوم الرباعي المزدوج، مع الحرص على عدم التخلص من بيليه كريات الدم الحمراء.
      4. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني والاستفادة بلطف الجزء السفلي من أنبوب مخروطي ضد الجزء السفلي من BSC بحيث تم إعادة تشكيل بيليه كريات الدم الحمراء. جعل حجم التعليق تصل إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني. مزيج من قبل انعكاس لطيف.
      5. كرر الخطوات 2.2.2.1−2.2.2.4 بإجمالي 4−6x. تأكد من أن supernatant واضحة أو وردي قليلا فقط ولم تعد مبهمة. إزالة كل supernatant باستخدام ماصة المصلية. إعادة إنفاق بيليه الكريات الحمراء في 1−2 مل من برنامج تلفزيوني.
      6. تجميع دقيق الدم: 350 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء المعبأة، 100 ميكرولتر من السكروز 10٪، 200 ميكرولتر من FBS المعطل حراريا، 900 ميكرومتر ATP المؤتلف، و 2 مل من مخزون الفيروس المخفف بشكل مناسب باستخدام DMEM تكملها مع 2٪ v/v FBS المعطل للحرارة، و 1٪ (v/v) البنسلين-ستربتوميسين.
  3. تراكب معيار 3 مل وحدة خزان(جدول المواد)مع الجلد من الماوس غير المصابة (وتشمل الخيارات الأخرى فيلم البارافين، والأغشية الكولاجين، أو غلاف النقانق).
  4. ضع الخزان المغطى على مناشف ورقية بيضاء. إضافة ~ 2 مل من دقيق الدم المعدية إلى الخزان 1 مل في وقت واحد. فحص منشفة تحت المغذية لأي دليل على التسرب. إذا كانت التسريبات موجودة، استرداد دقيق الدم من مغذيات وتجاهل الأغطية. ختم مغذيات مع المقابس. مرة أخرى تأكيد عدم وجود تسرب.

3. دعم دقيق الدم / فحص البلاك

  1. باستخدام الحجم المتبقي من دقيق الدم المعد ، قم بإجراء سلسلة تخفيف متسلسلة 10x (أي 6 مخففات ، تتراوح من 10x مخففة إلى 1000000x) باستخدام DMEM تكملها 2٪ v / v FBS المعطل حراريا ، و 1٪ (v /v) البنسلين -streptomycin.
  2. Aliquot 100 ميكرولتر من التخفيفات في آبار 24 أو 12 لوحات الآبار من المخفف الأكثر إلى الأكثر تركيزا.
  3. حضانة لمدة ساعة واحدة في حاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  4. في نهاية فترة حضانة 1 ساعة، وجلب لوحات مرة أخرى إلى BSC وإضافة 1 مل أو 2 مل من تراكب ميثيلسليلوز إلى 24 جيدا أو 12 لوحات البئر، في المقابل.
  5. ضع لوحات متراكبة مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربونواحتضنها لمدة 3-7 أيام (تعتمد على سلالة الفيروس).
  6. بعد الحضانة، قم بإزالة اللوحات من الحاضنة وجلبها إلى BSC. تجاهل تراكب الميثيلسليلوز في مقلاة صينية تحتوي على 10٪ من التبييض أو مطهر الأمونيوم الرباعي المزدوج.
  7. غسل كل بئر 2x مع برنامج تلفزيوني، والتخلص من غسل في مقلاة صينية تحتوي على 10٪ التبييض أو الأمونيوم الرباعي المزدوج.
  8. إضافة ~ 1 مل من الميثانول: الأسيتون (1:1 v:v) والسماح للخلايا لإصلاح على لوحة لمدة 30 دقيقة على الأقل في BSC في درجة حرارة الغرفة (RT). التخلص من الميثانول: الأسيتون وفقا للسياسة المؤسسية بشأن النفايات العضوية.
  9. تصور ZIKV باستخدام واحدة من طريقتين الموضحة أدناه.
    1. بعد إزالة الميثانول: الأسيتون، وصمة عار على الفور مع محلول الكريستال البنفسجي (0.25٪ ث / الخامس في الميثانول 30٪) لمدة 5 دقائق. شطف 2x في ماء الصنبور وترك لتجف، ثم تصور مباشرة عن طريق العين للحصول على أدلة على لويحات أو تدمير أحادية الطبقة.
    2. بدلا من ذلك، إجراء اختبار تشكيل التركيز.
      1. السماح للوحات للهواء الجاف حتى لا يبقى مثبت العضوية.
        ملاحظة: يجب أن يستغرق ذلك ~ 2−3 ساعة خارج BSC ولكن يمكن تسريعه عن طريق تجفيف الهواء في غطاء محرك السيارة BSC أو الدخان الكيميائي.
      2. غسل كل بئر 3X لمدة 15 دقيقة لكل منهما في برنامج تلفزيوني غيرsterile (ملغ2 + وكا2 + مجانا) على الروك لوحة المدارية. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من حل حجب (برنامج تلفزيوني + 3٪ FBS) إلى كل بئر والصخور لمدة 15 دقيقة في RT.
      3. إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر من α-ZIKV أو α-flavivirus الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، مجموعة الفيروسات الفلافية الهجين D1-4G2-4-15 [4G2]) في تخفيف 1:2000 في حل حجب. احتضان مع هزاز لمدة لا تقل عن 4 ساعة (ويفضل بين عشية وضحاها، لا تتجاوز 18 ساعة) في RT.
      4. إزالة الأجسام المضادة الأساسية وغسل 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع برنامج تلفزيوني (ملغ2 + وكا2 + مجانا) على الروك لوحة المداري.
      5. إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر من الأجسام المضادة الثانوية (الماعز α الماوس HRP المسمى) المخفف 1:2,000 في حظر العازلة. احتضان مع هزاز لمدة 1 ساعة في RT.
      6. غسل 3x لمدة 15 دقيقة لكل منهما مع برنامج تلفزيوني (ملغ2 + وكا2 + مجانا) على الروك لوحة المدارية.
      7. Aliquot 100 ميكرولتر من الركيزة تنمية كاشف(جدول المواد)في بئر. لوحات صخرية في RT لمدة 15 دقيقة.
      8. وقف رد الفعل على تطوير بؤر / لويحات عن طريق إزالة الركيزة وشطف لوحات 2x مع مياه الصنبور. صب قبالة مياه الصنبور والسماح للوحات للهواء الجاف قبل تحديد كميا.
      9. عد بؤر الفيروسية لتحديد عدد FFU موجودة في عينة معينة.

4. إدارة دقيق الدم

  1. استخدم بعوض Ae. aegypti بعد 2-4 أيام من الانفجار. فرز البعوض الإناث إلى 0.5 لتر كرتون من الورق المقوى مع الأغطية التي تم فحصها وحرمانهم من السكر (عموما 36−48 ساعة قبل دقيق الدم المعدية). توفير مياه libitum الإعلانية عن طريق كرات القطن المشبعة بالماء.
  2. إزالة كرات القطن المشبعة بالماء في الصباح الذي سيتعرض فيه البعوض لدقيق الدم المعدي.
  3. إرفاق الخزانات التي تحتوي على دقيق الدم الاصطناعي إلى وحدة التغذية يؤدي داخل مربع قفازات بلاستيكية واضحة.
  4. داخل صندوق القفازات، ضع كرتونة من الورق المقوى 0.5 لتر مع غطاء تم فحصه، يحتوي على 50−100 بعوض Ae. aegypti جائع، تحت وحدة التغذية المرفقة بالمخزان.
    ملاحظة: يتغذى البعوض الجائع بشكل مناسب بشكل عام في غضون 20 دقيقة. يمكن أن تطول التغذية حسب الحاجة لزيادة حجم العينة في المجموعات السكانية الأبطأ ، على الرغم من أن هذا لا ينبغي أن يمتد إلى أكثر من 60 دقيقة ، لأن (ZIKV) التيتر الفيروسي يمكن أن ينخفض داخل وحدة التغذية بعد ~ 60 دقيقة.
  5. عند الانتهاء من التغذية، وإزالة الخزان وتزج في التبييض الطازج 10٪.
  6. التخدير البارد للبعوض عن طريق الحضانة لمدة 30 s في -20 درجة مئوية أو لمدة 5 دقائق في الثلاجة.
  7. داخل صندوق القفازات، صب البعوض في طبق بيتري على الجليد. عد وفرز الإناث المهندسات من البعوض غير المهندسة. التخلص من البعوض غير المهندسة عن طريق الغمر في أنبوب مخروطي أنبوب 50 مل مليئة الإيثانول 70٪. في حين أن البعوض لا يزال مخدرا ، قم بصبه مرة أخرى في كرتونة الورق المقوى 0.5 L وغطه بسرعة بالشاشة والغطاء. تقليم شبكة الشاشة الزائدة الخروج من الكرتون وتأمين شبكة مع الشريط.
  8. إضافة كرة القطن المشبعة مع سكروز مائي معقمة 10٪ إلى شاشة كل الكرتون. ضع جميع علب البعوض في حاوية بلاستيكية كبيرة ثانوية مع اسفنجة رطبة للحفاظ على الرطوبة.
  9. ضع حاوية ثانوية تحتوي على كرتون البعوض في حاضنة درجة حرارتها 27 ± 1 درجة مئوية (أو حسب الاقتضاء لمحاكاة الظروف في المنطقة ذات الاهتمام) مع 80٪ ± رطوبة نسبية بنسبة 10٪ ودورة خفيفة:داكنة 16:8). الحفاظ على البعوض مع وصول libitum الإعلانية إلى السكروز 10٪ حتى الانتهاء من التجارب.

5. الحصول على عينة وتجهيزها

  1. في أيام محددة بعد التغذية ، يستنشق عددا محددا مسبقا من البعوض من الكرتون المناسب باستخدام متنفس ميكانيكي داخل صندوق قفازات. وضع حد أقصى للأنبوب جمع مع جولة القطن بعد الحصول على العدد المطلوب من البعوض.
  2. التخدير البارد للبعوض عن طريق الحضانة لمدة 30 ثانية عند -20 درجة مئوية أو لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. داخل صندوق القفازات، صب البعوض في طبق بيتري على الجليد. باستخدام زوجين من ملقط، إزالة جميع الساقين ستة من كل البعوض ومكان في أنبوب طارد مركزي مستدير 2 مل قبل التسمية التي تحتوي على كرة الفولاذ المقاوم للصدأ المعقمة تحمل (7/32") و 500 ميكرولتر من وسائل جمع البعوض (MCM) تتألف من DMEM، 2٪ FBS، 1٪ البنسلين-streptomycin، و 2.5 ميكروغرام / مل amphotericin.
  4. ضع البعوض برفق على قطرة من الزيت المعدني لكبح جماحه ، مع الحرص على عدم السماح بأي اتصال بين الزيت ورأس البعوضة وخرطومها.
  5. أدخل خرطوم البعوض في طرف ماصة سعة 10 ميكرولتر مليء ب 10 ميكرولتر من FBS المعطل حراريا.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن ملء ماصة مع السكروز، والدم، أو الزيوت المعدنية. النفط يسمح للتصور المباشر لفقاعات اللعاب عن طريق المجهر الخفيفة.
  6. السماح للبعوضة باللعاب لمدة 30 دقيقة. إخراج طرف micropipette التي تحتوي على FBS + اللعاب في أنبوب الطرد المركزي الدقيق التي تحتوي على 100 ميكرولتر من MCM، ثم وضع الذبيحة في أنبوب منفصل 2 مل أسفل جهاز الطرد الدقيق تحتوي على حامل كرة الصلب المعقمة و 500 ميكرولتر من MCM. تأكد من أن الأنابيب المستخدمة للأجسام والساقين واللعاب تحمل علامة بحيث يكون واضحا أن جميع العينات الثلاث نشأت من نفس البعوضة.
  7. بينما تسيل لعاب البعوضة، نفذ الخطوات 5.3-5.5 على البعوض المتبقي.
  8. نقل الأنابيب التي تحتوي على الجثث والساقين إلى حبة طحن الأنسجة جهاز تجانس الواردة داخل BSC. تريتورات جميع عينات الجسم والساق في 26 هرتز لمدة 5 دقائق لتحرير الجسيمات الفيروسية في supernatant. توضيح جميع العينات عن طريق الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق لبيليه الحطام الخلوي.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تجميد العينات عند -80 درجة مئوية، أو يتم فحصها على الفور.

6. الكشف عن ZIKV عن طريق الفحص المعدية

  1. في BSC، وإعداد 24 لوحات زراعة أنسجة الآبار مع خلايا فيرو (105 خلايا لكل بئر) 24 ساعة قبل بداية الفحص المعدية. تسمية كل بئر مع هوية البعوض واحد / عينة.
  2. إذا تم تجميد العينات عند -80 درجة مئوية، فسمح بالذوبان.
  3. إزالة الوسائط من لوحات الخلية Vero قبل التطعيم مع عينات لوحة واحدة في وقت واحد.
  4. لعينات تحتوي على أجسام أو أرجل، بدقة aliquot 100 ميكرولتر من supernatant أوضح في كل بئر، مع الحرص على عدم تعكير صفو حطام خلايا البعوض من بيليه.
    ملاحظة: يمكن تخفيف عينات اللعاب 1:1 (v/v) مع MCM قبل التطعيم على الخلايا للحفاظ على عينات ل titration في وقت لاحق، إذا لزم الأمر.
  5. نقل لوحات إلى 37 درجة مئوية، 5٪ حاضنة CO2 واحتضان لمدة 1 ساعة.
  6. إعادة لوحات إلى BSC وإضافة ~ 1 مل من تراكب ميثيلسليلوز إلى كل بئر. ضع اللوحات المتراكبة مرة أخرى فيحاضنة 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون واحتضنها لمدة 3-7 أيام (تعتمد على الفيروسات/السلالات).
  7. نفذ التثبيت والتصور كما هو موضح في الخطوات 3.6−3.9.
  8. فيما يتعلق بتسجيل النقاط عن طريق اختبار تشكيل التركيز ، قم بتحديد الآبار الإيجابية عن طريق الفحص تحت المجهر الخفيف. الكشف عن تلطيخ داخل السيتوبلازمي من الخلايا في بئر يشير إلى وجود فيروس. يتم تسجيل العينات فقط على أنها إيجابية التركيز أو -السلبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ثلاثة سكان من Ae. aegypti من الأمريكتين (سلفادور، تعرضت البرازيل؛ الجمهورية الدومينيكية؛ ووادي ريو غراندي، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية) لسلالة فاشية من ZIKV من الأمريكتين (ZIKV Mex 1-7، ولاية تشياباس، المكسيك، 2015) على مدى مجموعة من تيتر الدم (4 و 5 و 6 سجل10 FFU/mL) المقدمة في الدم الاصطناعي القائم على كريات الدم البشرية المغسولة. في الأيام 2 و4 و7 و10 و14 بعد الإصابة، تم تجهيز مجموعات فرعية من البعوض لتحديد العدوى والنشر ومعدلات انتقال العدوى المحتملة.

في ترجل دقيق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وتوفر الأساليب الموصوفة هنا سير عمل معمما لإجراء تحليلات كفاءة النواقل. وك إطار عام، يتم الحفاظ على العديد من هذه المنهجيات في جميع الأدبيات. ومع ذلك ، هناك مجال كبير للتعديلات (استعرضت في عازار ويفر1). ومن المعروف أن الفيروس (مثل النسب الفيروسي، وتخزين فيروس التحدي، وتاريخ المرور الفيروسي)، وعلم الحشرات (مثل الاستعمار المختبري لأعداد البعوض، والمناعة الفطرية، وميكرو بيوم البعوض/فيروم)، والمتغيرات التجريبية (مثل تكوين دقيق الدم، والتغذية المتسلسلة للدم، ودرجة حرارة الحضانة) كلها تؤثر على كفاءة الن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

نعترف بموظفي المركز المرجعي العالمي للفيروسات الناشئة وفيروسات الأربو (WRCEVA): الدكتور روبرت تيش، هيلدا غوزمان، الدكتور كينيث بلانت، الدكتورة جيسيكا بلانت، ديونا شارتن، وديفيا ميرشانداني، لعملهم الدؤوب في تنظيم وتوفير العديد من السلالات الفيروسية المستخدمة لتجارب الكفاءة ناقلات لدينا وغيرها من المجموعات. تم تمويل العمل المقدم من قبل صندوق زمالة ماكلوفلين (SRA) وتمنح المعاهد القومية للصحة AI120942 وAI121452.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3 مل الخزان القياسيR37P30Hemotek Ltdالمعدات الحشرية
7/32 "الفولاذ المقاوم للصدأ 440 كرات الصف C4RJH9Graingerطحن وسائل الإعلام
الأسيتون ، الصف النسيجي ، فيشر للكيماويات ، زجاجة بولي ، 4 لتر ، 4 / حالةA16-P4فيشر المثبت
العلمي الأدينوزين 5'-ثلاثي فوسبات هيدرات ملح ثنائي الصوديوم ، ميكروبي ، كاشف حيوي ، مناسب للخلية ثقافةA6419-1GMilliporeSigmaكاشف
الجسم المضاد للمستضد لمجموعة الفيروسات المتذورة ، استنساخ D1-4G2-4-15MAB10216MilliporeSigmaالجسم المضاد الأساسي لتشكيل الاختبار
المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد ، مصل بشري ممتص ومصنف بالبيروكسيداز ، 1.0 مل / زجاجة5450-0011KPL / Seracareالجسم المضاد الثانوي لتشكيل التركيز المبيض
NC0427256FisherScientificDepollution
Corning ، قوارير معالجة بزراعة الخلايا ، 150 سم 2 ، غطاء تنفيس ، علبة 5010-126-34FisherScientific
Cell Cell Cultures القابل للاستهلاك لزراعة خلايا Costar ، 24 بئر ، 5 / كيس ، 100 / علبة ، Corning07-200-740FisherScientific
Plants Glasgow Cell Plates ، 96 بئر ، 5 / كيس ، 100 / علبة ، Corning07-200-91FisherScientificثقافة الخلية الاستهلاكية
كريستال البنفسجيC0775-100GMilliporeSigmaوصمة عار
Eppendorf المفاجئة كاب الطرد المركزي الدقيق قفل آمن 2 مل أنابيب ، 500 / حالة05-402-7فيشر العلومالبلاستيكية الاستهلاكية
فالكون 15 مل أنابيب مركزية مخروطية14-959-70Cفيشر العلوم البلاستيكيةالاستهلاكية
فالكون 50 مل أنابيب مركزية مخروطية14-959-49Aفيشر ساتفيونيستالبلاستيك الاستهلاكي
فالكون البوليسترين المصلي القابل للتصرف 10 مل ماصات ، 200 / حالة13-675-20فيشر ساتفيونيستالبلاستيك
المستهلك فالكون البوليسترين المصلي القابل للتصرف 1 مل ماصات ، 1000 / حالة13-675-15Bفيشر العلوم البلاستيكيةالاستهلاكية
فالكون البوليسترين المصلية المتاح 25 مل ماصات ، 200 / حالة13-675-30فيشر ساتفندالبلاستيك الاستهلاكي
فالكون البوليسترين المصلي القابل للتصرف 5 مل ماصات ، 200 / حالة13-675-22فيشر ساينتيفالبلاستيك المستهلك
فالكون أطباق زراعة الأنسجة القياسية08-772Bفيشر مصلالأبقار
الجنيني الاستهلاكي للبلاستيك العلمي ، 500 ملS11150أتلانتا بيولوجيكاشف
زراعة الخلاياشرائح مجهر زجاجي عادي من FisherbrandEconomy 12-550-A3Fisher التثبيت العلميللبعوض
FU1 FeederFU1-0Hemotek Ltdالمعدات الحشرية ؛ وحدات التغذية
Gibco DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، زجاجات 10 × 500 مل140-040-182كاشف ثقافة الخليةالعلمي
فيشر جيبكو Fungizone ، أمفوتريسين ب ، 250 & مو ؛ جم / مل ، 50 مل / زجاجة15-290-026كاشف ثقافة الخلية
فيشر جيبكو بنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) ، 100 مل / زجاجة ، 20 زجاجة / علبة15-140-163كاشف ثقافة الخليةفيشر ساتفانتيكال
جيبكو ، تريبتسين-EDTA (.25٪) ، فينول أحمر ، 20 × 100 مل زجاجات25-200-114كاشف ثقافة الخليةفيشر ساتفانتیک
جيبكوم DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، زجاجات 10 × 500 مل11-965-118كاشف ثقافة الخلاياالعلمي فيشر
الدم البشري ، جنس غير محدد ، Na-citrate ، 1 وحدة7203706Lampireتحضير دقيق الدم
InsectaVac Aspirator2809BBioquipمعدات الحشرات
الميثانول ، ACS المعتمد ، فيشر كيماويات ، زجاجة زجاجية كهرمانية ، 4 لتر ، 4 / حالةA412-4فيشر المثبت العلمي
ميثيل السليلوز ، اللزوجة: 3،500-5،600 cP ، 2٪ في الماء (20 درجة ؛ ج) ، 250 جم / زجاجةM0512-250GMilliporeSigmaكاشف ثقافة الخلية
Micro-chem Plus منظف مطهرC849T34توماس ساينتيكديفال ؛ تخفيف العمل لزيت الأمونيوم المعدني الرباعي
المزدوج ، الكاشف الحيوي ، للبيولوجيا الجزيئيةM5904-5X5MLMilliporeSigmaتثبيت البعوض
يا الحلقاتOR37-25Hemotek Ltdمعدات الحشرات
المقابس البلاستيكيةPP5-250Hemotek Ltdالمعدات الحشرية
وحدة الطاقة PS6 (110-120 فولت)PS6120Hemotek Ltdالمعدات الحشرية ؛ مصدر الطاقة
ملقط روبيس ، شفرات الأوفست ، نقاط فائقة الدقة4525Bioquipمعدات الحشرات
Sarstedt Inc ، أنبوب صغير بغطاء لولبي 2 مل ، قاع مخروطي ، غطاء دائري ، معقم ، 1000 / حالة50-809-242الاستهلاكي للبلاستيكمن FisherScientific
، BioUltra ، للبيولوجيا الجزيئية84097-250GMilliporeكاشف سيجما
ThermoScientific ، حاجز ART احتفاظ منخفض 1000 & mu ؛ L أطراف الماصة ، 100 طرف / رف ، 8 رفوف / حزمة ، 4 عبوات / علبة21-402-487FisherScientificالبلاستيك الاستهلاكي
الحراري العلمي ، حاجز ART احتفاظ منخفض 200 مو ؛ L نصائح الماصة ، 96 طرف / رف ، 10 رفوف / حزمة ، 5 عبوات / علبة21-402-486FisherScientificالبلاستيك الاستهلاكي
ThermoScientific ، حاجز ART احتفاظ منخفض 20 & L أطراف الماصة ، 96 طرف / رف ، 10 رفوف / حزمة ، 5 عبوات / علبة21-402-484FisherScientificالبلاستيك الاستهلاكي
ThermoScientific ، ART Barrier منخفض الاحتفاظ ، الوصول الممتد 10 & mu ؛ L أطراف الماصة ، 96 طرف / رف ، 10 رفوف / عبوة ، 5 عبوات / علبة21-402-482FisherScientific
البلاستيك القابل للاستهلاك المناديلLyser II85300QIAGENHomogen
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit ، 200 مل5510-0030Seracareتطوير حل لتشكيل التركيز
VeroCCL-81مجموعةالثقافة من النوع الأمريكيخط خلايا الثدييات لتضخيم الفيروس وإجراء الفحص المعدي
Vero C1008 [Vero 76 ، استنساخ E6 ، Vero E6]CRL-1586مجموعة ثقافة النوع الأمريكيخط خلايا الثدييات لتضخيم الفيروس وإجراء الفحص المعدي
Cell Nozzle Nozzle العلمية السكروز

المراجع

  1. Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867(2019).
  2. Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
  3. Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck. Virology. 372 (1), 176-186 (2008).
  4. Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission. Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).
  5. Kramer, L. D., Ciota, A. T. Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses. Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).
  6. Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).
  7. Lounibos, L. P., Kramer, L. D. Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus. The Journal of Infectious Diseases. 214, suppl 5 453-458 (2016).
  8. Heitmann, A., et al. Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (138), e57980(2018).
  9. Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. Genetics of Mosquito Vector Competence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).
  10. Guo, X. X., et al. Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus. Emerging Microbes & Infections. 5 (9), 102(2016).
  11. Secundino, N. F. C., et al. Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process. Parasites & Vectors. 10 (1), 346(2017).
  12. Smith, D. R., et al. Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis. Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).
  13. Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  14. Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).
  15. Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses. Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).
  16. Rossi, S. L., et al. Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).
  17. Styer, L. M., et al. Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts. PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).
  18. Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission. Emerging Microbes & Infections. 8 (1), 242-244 (2019).
  19. Dzul-Manzanilla, F., et al. Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).
  20. Grard, G., et al. Zika virus in Gabon (Central Africa) – 2007: a new threat from Aedes albopictus. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).
  21. Grubaugh, N. D., et al. Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States. Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).
  22. Guerbois, M., et al. Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America. The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).
  23. Lundstrom, J. O., et al. Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702(2019).
  24. Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector. Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).
  25. Brown, H. E., et al. Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition. Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).
  26. Gorsich, E. E., et al. A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa. Parasites & Vectors. 12 (1), 462(2019).
  27. Azar, S. R., et al. ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques. Viruses. 10 (11), 661(2018).
  28. Azar, S. R., et al. Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).
  29. Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice. Viruses. 11 (11), 1072(2019).
  30. Hart, C. E., et al. Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States. Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).
  31. Karna, A. K., et al. Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti. Viruses. 10 (8), 434(2018).
  32. Roundy, C. M., et al. Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission. Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).
  33. Wilson, A. J., Harrup, L. E. Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies. Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).
  34. Hagan, R. W., et al. Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes. Scientific Reports. 8 (1), 6804(2018).
  35. Guo, X. X., et al. Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China. Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).
  36. Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
  37. Mayilsamy, M. Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition. Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).
  38. Althouse, B. M., et al. Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055(2016).
  39. Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health. Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).
  40. Vasilakis, N., et al. Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge. Virology. 358 (2), 402-412 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة