ويمكن للبروتوكول المقدم أن يحدد كفاءة البعوض Aedes aegypti في حالات الإصابة بفيروس معين، مثل زيكا، في بيئة احتواء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتصف الإجراءات المقدمة منهجية معممة لإصابة بعوض Aedes aegypti بفيروس زيكا في ظل ظروف مختبرية لتحديد معدل العدوى، والعدوى المنتشرة، واحتمال انتقال الفيروس بين البعوض المعني. وتستخدم هذه الإجراءات على نطاق واسع مع تعديلات مختلفة في تقييمات الكفاءة ناقلات على الصعيد العالمي. وهي مهمة في تحديد الدور المحتمل الذي يمكن أن تلعبه بعوضة معينة (أي الأنواع والسكان والأفراد) في انتقال عامل معين.
المقدمة
ويعرف الكفاءة ناقلات القدرة على مستوى الأنواع, السكان, وحتى فرد, من المفصليات معينة مثل البعوض, القراد, أو ذبابة الرمل phlebotomine, للحصول على ونقل عامل بيولوجيا مع تكرار أو تطوير في المفصليات1,2. وفيما يتعلق بالبعوض والفيروسات المنقولة بالمفصليات (أي الفيروسات الأربو)، فإن العامل يتم إصابة العامل من مضيف فيرميا بعوضة أنثى. بعد الابتلاع ، يجب أن يصيب الفيروس بشكل منتج واحدة من مجموعة صغيرة من الخلايا الظهارية المتوسطةالغوت 3، والتغلب على العقبات الفسيولوجية المختلفة مثل التدهور البروتيوليك بواسطة الإنزيمات الهضمية ، ووجود الميكروبات (حاجز العدوى في منتصف الطريق ، أو MIB) ، والمصفوفة ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت جميع الإجراءات التي أجريت في هذه البروتوكولات في امتثال تام للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية للسلامة البيولوجية واللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة للفرع الطبي لجامعة تكساس في غالفستون.
1. تضخيم ZIKV في خلايا فيرو
- تنمو خلايا Vero (CCL-81 أو VeroE6) في تعديل دولبيكو للوسط الأساسي الأدنى للنسر (DMEM) المكمل ب 10٪ v/v مصل بقرة الجنين المعطل حراريا (FBS)، و1٪ (v/v) البنسلين-ستربتوميسين (100 U/mL و 100 ميكروغرام/مل، على التوالي) في حاضنة 37 درجة مئوية مرطبة مع 5٪ CO2 إلى ما بين 80-90٪ التقاء في قارورة زراعة الأنسجة 150 سم2.
- في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) ، قم بإ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ثلاثة سكان من Ae. aegypti من الأمريكتين (سلفادور، تعرضت البرازيل؛ الجمهورية الدومينيكية؛ ووادي ريو غراندي، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية) لسلالة فاشية من ZIKV من الأمريكتين (ZIKV Mex 1-7، ولاية تشياباس، المكسيك، 2015) على مدى مجموعة من تيتر الدم (4 و 5 و 6 سجل10 FFU/mL) المقدمة في الدم الاصطناعي القائم على كريات الدم البشرية المغسولة. في الأيام 2 و4 و7 و10 و14 بعد الإصابة، تم تجهيز مجموعات فرعية من البعوض لتحديد العدوى والنشر ومعدلات انتقال العدوى المحتملة.
في ترجل دقيق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتوفر الأساليب الموصوفة هنا سير عمل معمما لإجراء تحليلات كفاءة النواقل. وك إطار عام، يتم الحفاظ على العديد من هذه المنهجيات في جميع الأدبيات. ومع ذلك ، هناك مجال كبير للتعديلات (استعرضت في عازار ويفر1). ومن المعروف أن الفيروس (مثل النسب الفيروسي، وتخزين فيروس التحدي، وتاريخ المرور الفيروسي)، وعلم الحشرات (مثل الاستعمار المختبري لأعداد البعوض، والمناعة الفطرية، وميكرو بيوم البعوض/فيروم)، والمتغيرات التجريبية (مثل تكوين دقيق الدم، والتغذية المتسلسلة للدم، ودرجة حرارة الحضانة) كلها تؤثر على كفاءة الن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
شكر وتقدير
نعترف بموظفي المركز المرجعي العالمي للفيروسات الناشئة وفيروسات الأربو (WRCEVA): الدكتور روبرت تيش، هيلدا غوزمان، الدكتور كينيث بلانت، الدكتورة جيسيكا بلانت، ديونا شارتن، وديفيا ميرشانداني، لعملهم الدؤوب في تنظيم وتوفير العديد من السلالات الفيروسية المستخدمة لتجارب الكفاءة ناقلات لدينا وغيرها من المجموعات. تم تمويل العمل المقدم من قبل صندوق زمالة ماكلوفلين (SRA) وتمنح المعاهد القومية للصحة AI120942 وAI121452.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3 مل الخزان القياسي | R37P30 | Hemotek Ltd | المعدات الحشرية |
| 7/32 "الفولاذ المقاوم للصدأ 440 كرات الصف C | 4RJH9 | Grainger | طحن وسائل الإعلام |
| الأسيتون ، الصف النسيجي ، فيشر للكيماويات ، زجاجة بولي ، 4 لتر ، 4 / حالة | A16-P4 | فيشر المثبت | |
| العلمي الأدينوزين 5'-ثلاثي فوسبات هيدرات ملح ثنائي الصوديوم ، ميكروبي ، كاشف حيوي ، مناسب للخلية ثقافة | A6419-1G | MilliporeSigma | كاشف |
| الجسم المضاد للمستضد لمجموعة الفيروسات المتذورة ، استنساخ D1-4G2-4-15 | MAB10216 | MilliporeSigma | الجسم المضاد الأساسي لتشكيل الاختبار |
| المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد ، مصل بشري ممتص ومصنف بالبيروكسيداز ، 1.0 مل / زجاجة | 5450-0011 | KPL / Seracare | الجسم المضاد الثانوي لتشكيل التركيز المبيض |
| NC0427256 | FisherScientific | Depollution | |
| Corning ، قوارير معالجة بزراعة الخلايا ، 150 سم 2 ، غطاء تنفيس ، علبة 50 | 10-126-34 | FisherScientific | |
| Cell Cell Cultures القابل للاستهلاك لزراعة خلايا Costar ، 24 بئر ، 5 / كيس ، 100 / علبة ، Corning | 07-200-740 | FisherScientific | |
| Plants Glasgow Cell Plates ، 96 بئر ، 5 / كيس ، 100 / علبة ، Corning | 07-200-91 | FisherScientific | ثقافة الخلية الاستهلاكية |
| كريستال البنفسجي | C0775-100G | MilliporeSigma | وصمة عار |
| Eppendorf المفاجئة كاب الطرد المركزي الدقيق قفل آمن 2 مل أنابيب ، 500 / حالة | 05-402-7 | فيشر العلوم | البلاستيكية الاستهلاكية |
| فالكون 15 مل أنابيب مركزية مخروطية | 14-959-70C | فيشر العلوم البلاستيكية | الاستهلاكية |
| فالكون 50 مل أنابيب مركزية مخروطية | 14-959-49A | فيشر ساتفيونيست | البلاستيك الاستهلاكي |
| فالكون البوليسترين المصلي القابل للتصرف 10 مل ماصات ، 200 / حالة | 13-675-20 | فيشر ساتفيونيست | البلاستيك |
| المستهلك فالكون البوليسترين المصلي القابل للتصرف 1 مل ماصات ، 1000 / حالة | 13-675-15B | فيشر العلوم البلاستيكية | الاستهلاكية |
| فالكون البوليسترين المصلية المتاح 25 مل ماصات ، 200 / حالة | 13-675-30 | فيشر ساتفند | البلاستيك الاستهلاكي |
| فالكون البوليسترين المصلي القابل للتصرف 5 مل ماصات ، 200 / حالة | 13-675-22 | فيشر ساينتيف | البلاستيك المستهلك |
| فالكون أطباق زراعة الأنسجة القياسية | 08-772B | فيشر مصل | الأبقار |
| الجنيني الاستهلاكي للبلاستيك العلمي ، 500 مل | S11150 | أتلانتا بيولوجي | كاشف |
| زراعة الخلاياشرائح مجهر زجاجي عادي من Fisherbrand | Economy 12-550-A3 | Fisher التثبيت العلمي | للبعوض |
| FU1 Feeder | FU1-0 | Hemotek Ltd | المعدات الحشرية ؛ وحدات التغذية |
| Gibco DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم ، زجاجات 10 × 500 مل | 140-040-182 | كاشف ثقافة الخلية | العلمي |
| فيشر جيبكو Fungizone ، أمفوتريسين ب ، 250 & مو ؛ جم / مل ، 50 مل / زجاجة | 15-290-026 | كاشف ثقافة الخلية | |
| فيشر جيبكو بنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) ، 100 مل / زجاجة ، 20 زجاجة / علبة | 15-140-163 | كاشف ثقافة الخلية | فيشر ساتفانتيكال |
| جيبكو ، تريبتسين-EDTA (.25٪) ، فينول أحمر ، 20 × 100 مل زجاجات | 25-200-114 | كاشف ثقافة الخلية | فيشر ساتفانتیک |
| جيبكوم DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، زجاجات 10 × 500 مل | 11-965-118 | كاشف ثقافة الخلايا | العلمي فيشر |
| الدم البشري ، جنس غير محدد ، Na-citrate ، 1 وحدة | 7203706 | Lampire | تحضير دقيق الدم |
| InsectaVac Aspirator | 2809B | Bioquip | معدات الحشرات |
| الميثانول ، ACS المعتمد ، فيشر كيماويات ، زجاجة زجاجية كهرمانية ، 4 لتر ، 4 / حالة | A412-4 | فيشر المثبت العلمي | |
| ميثيل السليلوز ، اللزوجة: 3،500-5،600 cP ، 2٪ في الماء (20 درجة ؛ ج) ، 250 جم / زجاجة | M0512-250G | MilliporeSigma | كاشف ثقافة الخلية |
| Micro-chem Plus منظف مطهر | C849T34 | توماس ساينتيك | ديفال ؛ تخفيف العمل لزيت الأمونيوم المعدني الرباعي |
| المزدوج ، الكاشف الحيوي ، للبيولوجيا الجزيئية | M5904-5X5ML | MilliporeSigma | تثبيت البعوض |
| يا الحلقات | OR37-25 | Hemotek Ltd | معدات الحشرات |
| المقابس البلاستيكية | PP5-250 | Hemotek Ltd | المعدات الحشرية |
| وحدة الطاقة PS6 (110-120 فولت) | PS6120 | Hemotek Ltd | المعدات الحشرية ؛ مصدر الطاقة |
| ملقط روبيس ، شفرات الأوفست ، نقاط فائقة الدقة | 4525 | Bioquip | معدات الحشرات |
| Sarstedt Inc ، أنبوب صغير بغطاء لولبي 2 مل ، قاع مخروطي ، غطاء دائري ، معقم ، 1000 / حالة | 50-809-242 | الاستهلاكي للبلاستيك | من FisherScientific |
| ، BioUltra ، للبيولوجيا الجزيئية | 84097-250G | Milliporeكاشف سيجما | |
| ThermoScientific ، حاجز ART احتفاظ منخفض 1000 & mu ؛ L أطراف الماصة ، 100 طرف / رف ، 8 رفوف / حزمة ، 4 عبوات / علبة | 21-402-487 | FisherScientific | البلاستيك الاستهلاكي |
| الحراري العلمي ، حاجز ART احتفاظ منخفض 200 مو ؛ L نصائح الماصة ، 96 طرف / رف ، 10 رفوف / حزمة ، 5 عبوات / علبة | 21-402-486 | FisherScientific | البلاستيك الاستهلاكي |
| ThermoScientific ، حاجز ART احتفاظ منخفض 20 & L أطراف الماصة ، 96 طرف / رف ، 10 رفوف / حزمة ، 5 عبوات / علبة | 21-402-484 | FisherScientific | البلاستيك الاستهلاكي |
| ThermoScientific ، ART Barrier منخفض الاحتفاظ ، الوصول الممتد 10 & mu ؛ L أطراف الماصة ، 96 طرف / رف ، 10 رفوف / عبوة ، 5 عبوات / علبة | 21-402-482 | FisherScientific | |
| البلاستيك القابل للاستهلاك المناديلLyser II | 85300 | QIAGEN | Homogen |
| TrueBlue Peroxidase Substrate Kit ، 200 مل | 5510-0030 | Seracare | تطوير حل لتشكيل التركيز |
| Vero | CCL-81 | مجموعة | الثقافة من النوع الأمريكيخط خلايا الثدييات لتضخيم الفيروس وإجراء الفحص المعدي |
| Vero C1008 [Vero 76 ، استنساخ E6 ، Vero E6] | CRL-1586 | مجموعة ثقافة النوع الأمريكي | خط خلايا الثدييات لتضخيم الفيروس وإجراء الفحص المعدي |
المراجع
- Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us. Viruses. 11 (9), 867(2019).
- Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. Aedes aegypti vector competence studies: A review. Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).
- ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
