مقالة منهجية

نموذج تلقيح لوحة الماوس للقدم لدراسة الاستجابات العصبية المستحثة بالفيروسات

DOI:

10.3791/61121

⸱

يونيو 14, 2020

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Princeton University, 2Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نموذج تلقيح القدمين هو أداة قيمة لتميز الاستجابات العصبية الفيروسية في الجسم الحي. على وجه الخصوص، فإنه يوفر تقييما واضحا للحركيات الفيروسية والعمليات المناعية المرتبطة بها التي بدأت في الجهاز العصبي المحيطي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول نموذج تلقيح الاقدام المستخدم لدراسة بدء وتطوير الاستجابات العصبية خلال عدوى فيروس الفاتس في الفئران. كما alphaherpesviruses هي الغزاة الرئيسيين للجهاز العصبي المحيطي (PNS)، وهذا النموذج هو مناسبة لتوصيف الحركية من تكرار الفيروسية، وانتشاره من PNS إلى CNS، والاستجابات العصبية المرتبطة. يسمح نموذج التطعيم في لوحة القدم لجزيئات الفيروسات بلانتشار من موقع العدوى الأساسي في البشرة في منصة القدم إلى الألياف العصبية الحسية والمتعاطفة التي تُعمّق البشرة والغدد العرقية والأدمة. تنتشر العدوى عبر العصب الوركي إلى جذر الظهر (DRG) وفي نهاية المطاف من خلال الحبل الشوكي إلى الدماغ. هنا ، يتم تلقيح لوحة قدم الماوس مع فيروس pseudorabies (PRV) ، وهو فيروس ألفابروكس وثيق الصلة بفيروس الهربس البسيط (HSV) وفيروس varicella-zoster (VZV). هذا النموذج يدل على أن عدوى PRV يؤدي إلى التهاب حاد, تتميز بتسلل العدلات في مهبط القدم وDG. يتم الكشف عن تركيزات عالية من السيتوكينات الالتهابية في وقت لاحق في الأنسجة المتجانسة بواسطة ELISA. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ وجود ارتباط قوي بين جين PRV والتعبير البروتيني (عبر qPCR و IF تلطيخ) في DRG وإنتاج السيتوكينات الموالية للالتهابات. لذلك، يوفر نموذج التلقيح في الاقدام فهما أفضل للعمليات الكامنة تحت alphaherpes التي يسببها فيروس اعتلال الأعصاب، وقد يؤدي إلى تطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للنموذج توجيه البحوث على الاعتلالات العصبية الطرفية، مثل التصلب المتعدد والأضرار الناجمة عن الفيروسية المرتبطة بها إلى PNS. وفي نهاية المطاف، يمكن أن تكون أداة فعالة من حيث التكلفة في مجال تطوير العقاقير.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الدراسة نموذج تلقيح الاقدام للتحقيق في تكرار وانتشار الفيروسات من PNS إلى CNS والاستجابات العصبية المرتبطة بها. وقد استخدم نموذج التطعيم في الاقدام بشكل مكثف لدراسة عدوى فيروس ألفا هيب في الخلايا العصبية1,2,3. والهدف الرئيسي لهذا النموذج هو السماح للفيروسات العصبية قطع مسافة قصوى من خلال الـ PNS قبل الوصول إلى الجهاز العصبي المركزي. هنا، يستخدم هذا النموذج للحصول على رؤى جديدة في تطوير اعتلال عصبي معين (حكة عصبية) في الفئران المصابة بفيروسات الإيدز (PRV).

PRV هو فيروس ألفاهرب مرتبط بالعديد من مسببات الأمراض المعروفة (أي الهربس البسيط النوع 1 و 2 [HSV1 و HSV2] وفيروسات الزوجة فاريتشيلا [VZV])، التي تسبب القروح الباردة، والآفات التناسلية، وجدري الماء، على التوالي4. هذه الفيروسات هي جميع pantropic وقادرة على إصابة العديد من أنواع الخلايا المختلفة دون إظهار تقارب لنوع أنسجة محددة. ومع ذلك ، فإنها تظهر جميعها عصبية مميزة من خلال غزو PNS (وأحيانا ، CNS) من الأنواع المضيفة. المضيف الطبيعي هو الخنزير ، ولكن PRV يمكن أن تصيب معظم الثدييات. في هذه المضيفين غير الطبيعية، PRV يصيب PNS ويحفز pruritus حاد يسمى "جنون حكة"، تليها الموت peracute5،6. دور استجابة المناعة العصبية في النتيجة السريرية والأمراض من العدوى PRV كان غير مفهومة بشكل جيد.

يسمح نموذج التطعيم في لوحة القدم لـ PRV ببدء العدوى في خلايا البشرة في لوحة القدم. ثم، تنتشر العدوى في الألياف العصبية الحسية والمتعاطفة التي تعم البشرة والغدد العرقية والأدمة. العدوى ينتشر عن طريق جزيئات الفيروس تتحرك عبر العصب الوركي إلى DRG في غضون 60 ساعة تقريبا. تنتشر العدوى عبر الحبل الشوكي، وتصل في نهاية المطاف إلى الـ hindbrain عندما تصبح الحيوانات محتضرة (82 ساعة بعد العدوى). خلال هذه النافذة الزمنية، يمكن جمع عينات الأنسجة ومعالجتها وتحليلها من أجل تكرار الفيروسات وعلامات الاستجابة المناعية. على سبيل المثال، يمكن إجراء الفحص النسيجي وتكميم الحمل الفيروسي في أنسجة مختلفة لإنشاء ارتباط بين بدء وتطوير العمليات السريرية والفيروسية والعصبية في التسبب في الـ PRV.

باستخدام نموذج تلقيح لوحة القدمين ، يمكن التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية من pruritus الناجم عن PRV في الفئران. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يوفر هذا النموذج نظرة جديدة في بدء وتطوير العصبية الناجمة عن الفيروسات خلال التهابات فيروس الهربس. قد يؤدي فهم أفضل للعمليات الكامنة الكامنة في اضطرابات الأعصاب الناجمة عن فيروس ألفا هيريس إلى تطوير استراتيجيات علاجية مبتكرة. على سبيل المثال، هذا النموذج مفيد للتحقيق في آليات حكة الأعصاب في المرضى الذين يعانون من آفات ما بعد الهربس (على سبيل المثال، الهربس، القوباء المنطقية) واختبار الأهداف العلاجية الجديدة في الفئران للأمراض البشرية المقابلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب الحيوانية وفقًا لبروتوكول (رقم 2083-16 و 2083-19) تم استعراضه واعتماده من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) بجامعة برينستون. وقد تم هذا العمل من خلال اتباع صارم متطلبات السلامة البيولوجية -2 (BSL-2)، التي لدينا مختبر مجهز بالكامل معتمد من قبل لجنة السلامة البيولوجية بجامعة برينستون. تم تنفيذ الإجراءات بما في ذلك كشط الماوس ، والتطعيم الفيروسي ، وتشريح الفئران ، وجمع الأنسجة في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) في غرفة مرفق الحيوانات في جامعة برينستون. أولئك الذين يؤدون العملية ارتدوا العباءات القابلة للتخلص، غطاء الرأس، حماية العين، القفازات المعقمة، الأقنعة الجراحية، وأغطية الأحذية.

1. ماوس footpad كشط

  1. تخدير ماوس C57BL/6 (5-7 أسابيع) مع مخدر غاز الأيزوفلوران، الذي يتم تسليمه بجرعات 3% عن طريق نظام تخدير صغير (غرفة).
    1. ضع الفأر في الطائرة الجراحية للتخدير على ظهره ، قبل التطعيم ، في لوحة القدم الخلفية. إرفاق مخروط الأنف مع الحجاب الحاجز (شق الحجم بما فيه الكفاية لتناسب كمامة الحيوان) إلى الماوس وتقديم مخدر غاز isoflurane في جرعة ثابتة من 1.5٪ - 2.0٪.
    2. مراقبة الماوس عن كثب للاستجابة للمحفزات المؤلمة التي أنشأتها معسر قوية من إصبع قدمه مع ملقط.
  2. فهم طفيفة واحدة القدم الخلفية مع ملقط مسطحة.
    1. بلطف abrade الجلد glabrous من القدم الخلفية ما يقرب من 20x، بين كعب ومنصات المشي، مع لوحة emery (100-180 حصى). لا تحفز النزيف عن طريق التآكل في كثير من الأحيان أو تطبيق الكثير من الضغط.
    2. باستخدام ملقط غرامة، قشر ببطء قبالة القرنية الطبقة فصلها عن طريق الكشط لفضح الطبقة basale.

2. تطعيم الاقدام PRV

  1. إعداد الفيروس inoculum المخفف إلى titer المطلوب في وسائل الاعلام DMEM التي تحتوي على 2٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1٪ البنسلين / ستريبتوميسين (جدول المواد).
    1. قم بتكليس عدد وحدات تشكيل البلاك (PFU) في مخزون الفيروس على خلايا PK15 لحساب الجرعة الفيروسية وتوحيدها وتمييع التلقين الفيروسي وفقًا لذلك.
      ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام سلالة خبيثة من PRV (PRV-بيكر) بجرعة 8 × 106 PFU. تم تحسين هذه الجرعة في تجربة أولية سابقة لضمان أن جميع الحيوانات المحقح أظهرت الأعراض السريرية في 82 ساعة بعد التلقيح (hpi).
    2. الحفاظ على الفيروس inoculum على الجليد ومزيج بلطف قبل الاستخدام.
  2. إضافة 20 ميكرولتر قطرات من inoculum الفيروس (8 × 106 PFU) على البادباد (الإدارة الموضعية). تنفيذ التطعيمات الوهمية (متوسطة فقط) في موازاة ذلك.
  3. فرك بلطف 10x مع رمح إبرة لتسهيل الامتزاز من الفيروس. تجنب الخدش مع نقطة إبرة. كرر هذه الخطوة كل 10 دقيقة.
  4. إبقاء الماوس تحت التخدير لمدة 30 دقيقة حتى مهبط القدم الجافة.
  5. بعد إيقاف التخدير، مراقبة الماوس حتى يمكن الحفاظ على حفّر الصدر ووضعها في قفص فردي للمتابعة السريرية وأخذ العينات.

3. تشريح الماوس وجمع الأنسجة

  1. في الأوقات المناسبة بعد العدوى، euthanize الماوس عن طريق طريقة الاختناق (CO2).
    ملاحظة: في هذه الدراسة، نقطة النهاية الإنسانية (عندما تبدأ الحيوانات في إظهار أعراض المحطة الطرفية) للفئران المصابة PRV-Becker هو 82 حصان. القتل الرحيم السيطرة على الحيوانات في موازاة ذلك.
  2. ضع الجانب البطني للماوس الذي يواجه على حصيرة جراحية باستخدام الإبر / الدبابيس. تأمين أطراف الماوس مع دبابيس إلى لوحة رغوة الجراحية. الرطب الجانب البطني من الماوس مع 70٪ الإيثانول للحد من تلوث الفراء.
  3. قرصة الطبقة الخارجية من الفراء والجلد باستخدام ملقط وجعل شق أولي صغير باستخدام مقص غرامة بالقرب من فتح مجرى البول.
    1. من هذا الافتتاح، مواصلة شق على الجانب البطني منتصف حتى الذقن.
    2. تمديد شقين الجانبية نحو الأطراف من الأطراف الأمامية والأطراف الخلفية.
    3. افصل الجلد عن الطبقة العضلية الأساسية واغلقه إلى الجانب.
    4. افتح تجويف البطن و اِن تحُزّر إلى قاعدة الصدر. استكمال فتح تجويف البطن عن طريق إجراء شقين مستعرضين.
    5. افتح التجويف الصدري عن طريق قطع الحجاب الحاجز والأضلاع على الجانبين الجانبيين.
      ملاحظة: قطع جانبي القفص الصدري يمنع خطر قطع القلب.
    6. اجمع الأعضاء المكشوفة، بما في ذلك القلب والرئتين والطحال والبنكرياس والكبد والكلى والمثانة في أنابيب ميكروبلتي 1.5 مل. إبقاء الأنابيب على الجليد.
    7. قطع لوح القدم المشطب بين كعب ومنصات المشي ووضع قطعة من الأنسجة في أنبوب كما هو موضح في الخطوة 3.3.6.
  4. وضع الجانب الظهري الماوس حتى والرطب الفراء مع 70٪ الإيثانول. خفض طبقة الجلد لفضح العمود الفقري.
    1. إجراء شق صغير في منطقة الحوض. اخلع الجلد من الأطراف الخلفية باتجاه الرأس.
    2. إزالة الساقين والذراعين عن طريق قطع مع مقص بالتوازي مع وقريبة من العمود الفقري على كلا الجانبين.
    3. قطع الرأس في قاعدة الجمجمة (C1 - C2 المستوى).
    4. قطع فتح الجمجمة مع مقص من ماغنوم ماغنوم من التجويف إلى العظام الأمامية.
    5. سحب فتح الجمجمة في الاتجاهات الجانبي باستخدام ملقط.
    6. استخرج بلطف من الدماغ باستخدام ملقط والمضي قدما كما هو موضح في الخطوة 3.3.6.
  5. تنظيف العمود الفقري عن طريق قطع العضلات والدهون والأنسجة الرخوة باستخدام مقص المنحني. اقطعي ذيلك ضع العمود الفقري السليم في أنبوب 15 مل يحتوي على محلول ملحي معقم من الجليد البارد (PBS). الحفاظ على أنابيب على الجليد حتى تشريح مزيد من الحبل الشوكي وDG.

4. الحبل الشوكي واستخراج DRG

ملاحظة: استخراج الحبل الشوكي وDDG من العمود الفقرات مباشرة بعد تشريح الماوس. بروتوكول الحبل الشوكي واستخراج DRG تم تكييفها من منشور سابق7.

  1. إزالة العمود الفقرات من أنبوب PBS الجليد الباردة وإزالة الأنسجة الرخوة المتبقية، والتي تصبح أسهل بعد التبريد.
  2. إجراء ثلاثة قطع عرضية في العمود من خلال الفقرات (T1، L1، و S2 المستويات) باستخدام شفرة حلاقة. ضع القطع الثلاث في طبق بيتري 15 ملم يحتوي على PBS الجليد البارد العقيم. تتبع وتحديد أصل الشرائح لتحليل لاحق.
  3. اتخاذ شريحة واحدة وتأمينه بين ملقط، الجانب الظهري تواجه. جعل واحد، وقطع طولية أسفل من خلال خط الوسط باستخدام شفرة الحلاقة، وتقسيم العمود إلى نصفين متساويين.
  4. ضع كلا النصفين في طبق بيتري جديد يحتوي على PBS الجليد الباردة العقيمة الجديدة. تأكد من التوجه الصحيح للشريحة لتكون قادرة على التمييز بين الجانبين الأيمن والأيسر.
  5. تحت مجهر تشريح، قشر بلطف الحبل الشوكي من العمود الفقرات من كل نصف في اتجاه روسترالي إلى السد باستخدام ملقط غرامة.
  6. جمع كل من نصفي الحبل الشوكي في 1.5 مل microtube التي تحتوي على 500 μL من الثلج الباردة العقيمة PBS. إبقاء الأنابيب على الجليد.
  7. قم بإزالة السحايا بلطف من جانب واحد من العمود الفقري إلى الجانب الآخر لفضح DRG.
  8. ازل كل DRG بشكل فردي عن طريق استيعاب العصب الشوكي المكشوف وسحبه بلطف من العمود الفقري. ضع DRG الذي تم جمعه في طبق بيتري عيار 15 مم يحتوي على PBS بارد بالثلج. حصاد كل دراغ ipsilateral و contralateral بشكل منفصل عن الجزء العمود الفقري والمضي قدما على النحو المبين في الخطوة 4.5.
    ملاحظة: يمكن رؤية DRG كهيكل شفاف مستدير على طول العصب الشوكي الأبيض.
  9. كرر الخطوات 4.3-4.7 باستخدام مقطعي العمود الفقري الآخرين خلال 30-45 دقيقة.
  10. أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب بسرعة عالية (17900 × ز)لمدة 3 دقائق في 4 °C.
  11. أنابيب التعرق وفلاش تجميد في النيتروجين السائل. تخزين أنابيب في -80 درجة مئوية لمزيد من التجانس الأنسجة.
  12. بدلا من ذلك، إصلاح وقسم DRG تنظيفها وغيرها من أنسجة الماوس للتحليلات الهستوباتية و / أو تلطيخ المناعة بعد الخطوة 4.9.

5. تجانس الأنسجة

  1. اذيب الأنابيب التي تحتوي على عينات من الأنسجة المجمدة على الجليد.
  2. تزن 100 ملغ من الأنسجة ووضعها في أنبوب 2 مل microcentrifuge التي تحتوي على حبة الصلب المعقم و 500 ميكرولتر من العازلة RIPA التي تحتوي على 0.5 M EDTA (pH = 8.0)، 1 M تريس-HCl (pH = 8.0)، 5 M NaCl، 10٪ SDS، وأقراص حبوب منع الكوكتيلات protease.
  3. تعطيل الأنسجة في درجة حرارة الغرفة (RT) باستخدام التجانس في 20 دورة / ث لمدة 2 دقيقة، تليها فترة انتظار 1 دقيقة، ثم 20 دورة / ث لمدة 2 دقيقة.
  4. جهاز طرد مركزي الأنبوب بسرعة عالية (17900 س ز)لمدة 10 دقيقة في RT.
  5. جمع مُتفَرّع (500 ميكرولتر) في أنبوب جديد وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى أداء ELISA و qPCR لتحديد العلامات الالتهابية والأحمال الفيروسية، على التوالي.
    ملاحظة: بالنسبة لـ qPCR، جمع جميع العينات مع RNase خالية من المواد (أي، الخرز، والأنابيب، الخ) وتعطيل الأنسجة مع تحلل الحمض النووي الريبي العازلة التي تحتوي على 1٪ بيتاميركوتويثينول(جدول المواد).

6. إعداد وتلطيخ المناعة من أقسام DRG المجمدة

  1. معالجة الأنسجة
    1. إصلاح DRG تشريح وتنظيفها في 1٪ شبه شكلي (PFA) لمدة 2 ساعة في RT.
    2. نقل الأنسجة إلى أنبوب 15 مل مع السكروز 10٪ في برنامج تلفزيوني. احتضان ليلة وضحاها في 4 °C.
    3. نقل الأنسجة إلى أنبوب 15 مل مع 20٪ السكروز في برنامج تلفزيوني. احتضان ليلة وضحاها في 4 °C.
    4. نقل الأنسجة إلى أنبوب 15 مل مع 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني. احتضان ليلة وضحاها في 4 °C.
    5. تضمين الأنسجة في أكتوبر باستخدام cryomold ووضع كتل في الجليد الجاف لتجميد سريع.
    6. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. إعداد التكريات
    1. إزالة كتلة المجمدة من -80 درجة مئوية والسماح لها لتكرير في درجة حرارة غرفة التبريد لمدة 30 دقيقة.
    2. قم بالتبريد في DRG بسمك 15 ميكرومتر ثم قم بتحميل الأقسام على الشرائح.
    3. استخدم قلمًا لرسم دائرة مُهدَّبة حول النسيج المُثبَت بالشريحة.
    4. حافظ على الشرائح عند 4 درجة مئوية حتى تلطخ.
  3. صبغ المناعة
    1. غسل أقسام DRG 3x في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT.
    2. احتضان المقاطع مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المطلوبة (على سبيل المثال، الأجسام المضادة الماوس ضد PRV الجليكوبروتين B) ل 1 ساعة في 37 درجة مئوية. تخفيف الجسم المضاد الرئيسي في PBS التي تحتوي على مصل الماعز السلبي بنسبة 10٪.
    3. كرر الخطوة 6.3.1.
    4. احتضان المقاطع مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المطلوبة (الماعز المضادة للفأر اليكسا فلور 488) لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني فقط.
    5. إضافة 100 ميكرولتر من DAPI (4′، 6-diamidino-2-فينيليندول) صبغة مخففة في برنامج تلفزيوني على القسم. مزيد من عينات احتضان 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    6. كرر الخطوة 6.3.1.
    7. قم بتركيب العينات باستخدام الفلوريسنس المتصاعد المتوسط على الشرائح الزجاجية وتأمين وتغطية مع غطاء.

7. إعداد وH & E تلطيخ من أقسام الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ

  1. إصلاح الأنسجة في 10٪ formalin لمدة 24 ساعة في 4 °C.
  2. تنفيذ جدول المعالجة القياسية لالبارافين تضمين والقطع من الأنسجة الثابتة. نقل الأنسجة الثابتة إلى 70٪ الإيثانول وعملية من خلال ترقية الكحول إلى الزيلين تليها البارافين، كما سبق وصفه8.
    ملاحظة: استخدم الإسفنج البوليستر للحفاظ على عينات الأنسجة الصغيرة مثل DRG داخل الكاسيتات.
  3. تنفيذ إزالة الزعنفة القياسية تليها H & E تلطيخ من أقسام الأنسجة، كما سبق وصفها9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نموذج تطعيم القدم الماوس يسمح لتوصيف من التسبب في التكاثر المناعي لعدوى فيروس ألفاهرب في الجسم الحي، بما في ذلك النسخ المتماثل وانتشار العدوى من مهبط القدم المحق إلى الجهاز العصبي وتحريض استجابات عصبية محددة.

في هذه الدراسة ، ونحن أولا abraded القدم الخلفية الماوس وإما وهمية تلقيح أو تلقيح المنطقة مع سلالة خبيثة من PRV بيكر( PRV-بيكر). كان موقع التآكل مرئيًا في لوحة التحكم. تم تشكيل قشرة في موقع التآكل كجزء من عملية الشفاء (الشكل 1، السهم الأسود). في المقابل، أظهر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نموذج تطعيم القدم الموصوف هنا مفيد للتحقيق في بدء وتطوير استجابات الوهن العصبي أثناء عدوى فيروس ألفاهرب. وعلاوة على ذلك، يستخدم هذا في نموذج الجسم الحي لتحديد الحركية من النسخ المتماثل وانتشار فيروس ألفاهرب من PNS إلى CNS. هذا هو بديل لنماذج التلقيح الأخرى، مثل نموذج تلقيح الجلد الجناح، الذي يعتمد على خدش الجلد العميق13،أو الطريق داخل الجمجمة، الذي يدخل الفيروس مباشرة في CNS14،15،16. ونتيجة لذلك، مع نموذج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب الاعتراف تشارلز ريفر مختبرات لدعمها التقني الممتاز تنفيذ التحليلات الهستوبات. تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) (RO1 NS033506 و RO1 NS060699). ولم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو في اتخاذ قرار بنشرها، أو إعدادها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الأجسام المضادة المضادة ل PRV gBصنع من قبل المختبر1/500 تخفيف
Aqua-hold2 قلم عنق الرحم أحمرفيشر العلمي2886909
ألواح الصنفرة المدمجة -24 عد (100/180 مبرد أظافر حصى)Revlon
Complete خالي من EDTA كوكتيل مثبط البروتيازSigma-Aldrich11836170001
C57BL / 6 فئران (5-7 أسابيع)جاكسون مختبرات
محلول DAPI (1 مجم / مل)فيشر العلمي622481/1000
طبق بتري بوليسترين معقم يمكن التخلص منه 100 × 15 ممسيجما ألدريتشP5731500
النسر المعدل من دولبيكو (DMEM)هيكلون ، GE Healthcare Life SciencesSH30022
محلول Phophate Buffer Saline (PBS) من DulbeccoHyclone ، GE Healthcare Life SciencesSH30028
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Hyclone ، GE Healthcare LifeSciences SH30088
مقص منحني ناعم من الفولاذ المقاومFST14095-11
وسائط تركيب Fluoromount-Gفيشر العلمية0100-01
محلول الفورمالين ، مخزن محايد 10٪Sigma-AldrichHT501128
Isothesia IsofluraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
أنبوب الطرد المركزي الدقيق 2 ملDenville Scientific1000945
Microtube 1.5 ملSARSTEDT72692005
مصل الماعز السلبيناقلاتS-1000
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو154022
إبرة الانزلاق الدقيقة 18GBD305196
شفرات الحلاقة الصلبالخلفي Personna9412071
RNA تحلل المخزن المؤقت (RLT)Qiagen79216
حبات الفولاذ المقاوم للصدأ ، 5 ممQiagen69989
Superfrost / بالإضافة إلى شرائح مجهريةفيشر العلمية12-550-15
محلل الأنسجة LTQiagen69980
Tissue-Tek OCTSakura4583
488 (مضاد للفأرTechnologiesA110291/2000 التخفيف
مخفف وسط للصدأ ) Life

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Field, H. J., Hill, T. J. The pathogenesis of pseudorabies in mice following peripheral inoculation. Journal of General Virology. 23 (2), 145-157 (1974).
  2. Engel, J. P., Madigan, T. C., Peterson, G. M. The transneuronal spread phenotype of herpes simplex virus type 1 infection of the mouse hind footpad. Journal of Virology. 71 (3), 2425-2435 (1997).
  3. Guedon, J. M., et al. Neuronal changes induced by Varicella Zoster Virus in a rat model of postherpetic neuralgia. Virology. 482, 167-180 (2015).
  4. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
  5. Wittmann, G., Rziha, H. J. Aujeszky's disease (pseudorabies) in pigs. Herpesvirus diseases of cattle, horses and pigs. Knipe, D. M., Howley, P. M. 9, Kluwer Academic Publishers. Boston, Mass. 230-325 (1989).
  6. Diseases of swine, 6th ed. Leman, A. D., Glock, R. D., Mengeling, W. L., Penny, R. H. C., Scholl, E., Straw, B. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. 209-223 (1986).
  7. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82(2016).
  8. Sands, S. A., Leung-Toung, R., Wang, Y., Connelly, J., LeVine, S. M. Enhanced Histochemical Detection of Iron in Paraffin Sections of Mouse Central Nervous System Tissue: Application in the APP/PS1 Mouse Model of Alzheimer's Disease. ASN Neuro. 8 (5), (2016).
  9. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  10. Koyuncu, O. O., MacGibeny, M. A., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Compartmented neuronal cultures reveal two distinct mechanisms for alpha herpesvirus escape from genome silencing. PLoS pathogens. 13 (10), 1006608(2017).
  11. Laval, K., Vernejoul, J. B., Van Cleemput, J., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Virulent Pseudorabies Virus Infection Induces a Specific and Lethal Systemic Inflammatory Response in Mice. Journal of Virology. 92 (24), 01614-01618 (2018).
  12. Laval, K., Van Cleemput, J., Vernejoul, J. B., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus infection of mice primes PNS neurons to an inflammatory state regulated by TLR2 and type I IFN signaling. PLoS Pathogens. 15 (11), 1008087(2019).
  13. Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
  14. Mancini, M., Vidal, S. M. Insights into the pathogenesis of herpes simplex encephalitis from mouse models. Mammalian Genome: Official Journal of the International Mammalian Genome Society. 29 (7-8), 425-445 (2018).
  15. Kopp, S. J., et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (42), 17916-17920 (2009).
  16. Wang, J. P., et al. Role of specific innate immune responses in herpes simplex virus infection of the central nervous system. Journal of Virology. 86 (4), 2273-2281 (2012).
  17. Haberthur, K., Messaoudi, I. Animal models of varicella zoster virus infection. Pathogens. 2 (2), Basel, Switzerland. 364-382 (2013).
  18. Sarova-Pinhas, I., Achiron, A., Gilad, R., Lampl, Y. Peripheral neuropathy in multiple sclerosis: a clinical and electrophysiologic study. Acta Neurologica Scandinavia. 91 (4), 234-238 (1995).
  19. MacGibeny, M. A., Koyuncu, O. O., Wirblich, C., Schnell, M. J., Enquist, L. W. Retrograde axonal transport of rabies virus is unaffected by interferon treatment but blocked by emetine locally in axons. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007188(2018).
  20. Hunsperger, E. A., Roehrig, J. T. Temporal analyses of the neuropathogenesis of a West Nile virus infection in mice. Journal of Neurovirology. 12 (2), 129-139 (2006).
  21. Swartwout, B. K., et al. Zika Virus Persistently and Productively Infects Primary Adult Sensory Neurons In Vitro. Pathogens. 6 (4), Basel, Switzerland. 49(2017).
  22. Racaniello, V. R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology. 344 (1), 9-16 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ELISA qPCR

مقالات ذات صلة