دودة الانحياز Worm_CP، خطين أنابيب مفتوحة المصدر لتقويم و كمية بيانات صورة الفلوريسنس التي تم الحصول عليها من Elegans Caenorhabditis

ملخص

دودة محاذاة / Worm_CP هو سير عمل فيجي / CellProfiler بسيطة التي يمكن استخدامها لتصويب ومواءمة Caenorhabditis elegans عينات وتسجيل كامل دودة تستند إلى صورة المقايسات دون الحاجة إلى خطوات التدريب المسبق. لقد طبقنا دودة محاذاة / Worm_CP إلى الكم من الحرارة الناجمة عن التعبير في الحيوانات الحية أو قطرات الدهون في عينات ثابتة.

الملخص

مشكلة غالبا ما تواجه عند الحصول على بيانات الصورة من ثابت أو تخدير C. elegans هو أن الديدان عبر وتكتل مع جيرانهم. وتتفاقم هذه المشكلة مع زيادة كثافة الديدان وتخلق تحديات للتصوير والتحديد الكمي. قمنا بتطوير سير العمل القائم على FIJI ، دودة الانحياز ، التي يمكن استخدامها لتوليد المونتاج واحد أو متعدد القنوات من المستخدم المحدد ، تقويم ومحاذاة الديدان من بيانات الصورة الخام من C. elegans. محاذاة الفيروس المتنقل هو سير عمل بسيط وسهل الاستخدام لا يتطلب تدريب مسبق من المستخدم أو خوارزمية التحليل. يمكن للمونتاجات التي تم إنشاؤها مع دودة الانحياز مساعدة التفتيش البصرية من الديدان، وتصنيفها والتمثيل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مخرجات محاذاة الدودة في القياس الكمي اللاحق لكثافة الفلور في الديدان المفردة، إما في فيجي مباشرة، أو في منصات برامجيات تحليل الصور الأخرى. نحن نبرهن على ذلك عن طريق استيراد إخراج Worm-محاذاة إلى Worm_CP، خط أنابيب يستخدم برنامج CellProfiler مفتوح المصدر. تمكن مرونة CellProfiler من دمج وحدات إضافية للفحص عالي المحتوى. وكمثال عملي، استخدمنا خط الأنابيب على مجموعتي بيانات: مجموعة البيانات الأولى هي صور ديدان مراسل الصدمات الحرارية التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) تحت سيطرة مروج صدمة الحرارة الجين hsp-70، ومجموعة البيانات الثانية هي الصور التي تم الحصول عليها من الديدان الثابتة ، الملطخة لمخازن الدهون مع صبغة الفلورسنت.

المقدمة

كائن بسيط نسبيا، والنيماتودا C. elegans، هو نظام نموذج مفيد للغاية لدراسة الأمراض البشرية. حوالي 38٪ من الجينات في الجينوم C. elegans لديها نظراء وظيفية في البشر^1,2. واحدة من الخصائص الفريدة لـ C. elegans هي أنها شفافة بصرياً، مما يتيح سهولة الوصول إلى المعلومات الحية في ما يتعلق بالتعبير الخلوي (الفرعي) لمراسلي الفلورسنت عبر الأنسجة. وهذا يجعل C. elegans كائن حي نموذج رئيس لشاشات عالية المحتوى باستخدام منصات الصور القائمة³. ومع ذلك ، فإن إحدى القضايا التي غالبا ما تعقد هذه الدراسات هو أنه عند تصوير مجموعات كثيفة من الديدان ، فإنها تميل إلى العبور والتجميع ، مما يجعل المقارنات عبر الديدان الفردية صعبة ، وتخيم على تحليل الصور في المصب والكمية.

الحلول القائمة التي تتغلب على هذه المسألة تعتمد عادة على تحسين الاستزراع و بروتوكول التصوير ، مثل استخدام الاجهزة micro-fluidics⁴، والسماح للدود واحد ليتم التقاطها في صور منفصلة^5،6. وقد طبّق آخرون خوارزميات للتعلم الآلي تسمح بالاعتراف بالدودية الفردية، حتى في مجموعات سكانية متكتلة. مثال ممتاز لهذا الأخير هو WormToolbox، وهو امتداد وحدات من منصة تحليل الصور مفتوحة المصدر، CellProfiler⁷. WormToolbox يقدم عالية الإنتاجية وعالية المحتوى الحل لتحليل C. elegans، وتستفيد بوضوح من إدراجها في CellProfiler ، كما يمكن بسهولة وحدات تحليل إضافية يمكن تضمينها. على الرغم من أن WormToolbox يأتي مزوداً بنموذج مسبق التدريب (DefaultWormModel.xml)، فإن إعادة تدريب خوارزمية التعلم الآلي مطلوبة عادةً لكل تطبيق جديد. الدروس على الانترنت حول كيفية القيام بذلك متوفرة على Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). على الرغم من هذا ، يتطلب تثبيت WormToolbox واستخدامه استثمارًا كبيرًا للوقت للمستخدمين المبتدئين.

هنا ، ونحن وصف بروتوكول بسيط والتكلفة وفعالة من حيث الوقت للثقافة ، وصورة السكان من C. elegans. للسماح لتقييم الديدان الفردية في الصور المكتسبة قمنا بتطوير سير عمل بسيط مفتوح المصدر يستند إلى FIJI ، واسمه محاذاة الدودة. يمكن استخدام محاذاة الفيروس المتنقل لإنشاء المونتاجات أحادية أو متعددة القنوات من الديدان المُستقيمة والمحاذية. أولاً، يجب على المستخدم اختيار الديدان الفردية يدويًا للتحليل عن طريق رسم خط من الرأس إلى الذيل. سيستخدم Worm-align هذا التحديد لاحصد الديدان المحددة من صورة النظرة العامة، وتوليد مونتاج يتم فيه تقويم الديدان المحددة ومحاذاتها لتسهيل المقارنة البصرية والعرض.

وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مخرجات محاذاة الدودة في القياس الكمي اللاحق لكثافة الفلور في الديدان المفردة، إما في فيجي مباشرة، أو في منصات برامجيات تحليل الصور الأخرى. نحن نبرهن على ذلك عن طريق استيراد إخراج Worm-محاذاة إلى Worm_CP، خط أنابيب يستخدم برنامج CellProfiler مفتوح المصدر. تمكن مرونة CellProfiler من دمج وحدات إضافية للفحص عالي المحتوى. لقد استخدمنا خط أنابيب Worm_CP لتحديد استجابة الصدمة الحرارية ، وهي آلية وقائية محفوظة بشكل جيد تعيد تخزين البروتينات التي تم طيها بشكل خاطئ بسبب الضغوطات مثل ارتفاع درجة الحرارة^8. على وجه التحديد، قمنا بتطبيق خط الأنابيب على الديدان التي تحمل transgene متعددة النسخ المتكاملة، حيث المروج من صدمة الحرارة الجينات غير قابل للدمج، hsp-70 (C12C8.1)، يدفع البروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)⁹. كما استخدمنا خط أنابيب Worm_CP على الحيوانات الثابتة التي تم وضع علامة عليها بصبغة فلورية تصور قطرات الدهون (LDs) ، وهي العضوات الرئيسية لتخزين الدهون في C. elegans^10. في حين أن هذا العمل لا يملك الإنتاجية التي تقدمها WormToolBox ، بل هو بديل سهل الاستعمال وبسيطة للعرض البصري وتحليل الصور القائمة على التجارب ج. elegans.

البروتوكول

1. تثبيت الديدان لمحتوى الدهون التصوير باستخدام صبغة الفلورسنت لقطرات الدهون (BODIPY)¹⁰

1. إعداد مجموعة سكان متزامنة من C. elegans عن طريق التبييض وفقا للإجراءات القياسية². لوحة حوالي 1000 L1 المرحلة الديدان على 9 سم نمو النيماتودا وسائل الإعلام (NGM) لوحة لكل حالة.
   ملاحظة: يتم إعداد المزيد من الديدان من الكمية في النهاية فعليًا، بسبب فقدان الديدان عند المناولة.
2. لتصوير الحيوانات في مرحلة الشباب الكبار (حوالي 50 ساعة بعد L1 الطلاء في 20 درجة مئوية)، وغسل كل لوحة 9 سم مع 15 مل من M9 في أنبوب مخروطي، والطرد المركزي في 252 × ز لمدة 1 دقيقة، وإزالة عظمى.
3. كرر غسل وترك 1 مل من M9 على بيليه من الديدان.
4. نقل 1 مل من M9 تحتوي على الديدان في 2 مل منخفضة البروتين ملزمة microcentrifuge أنبوب، وذلك باستخدام نصائح الاحتفاظ منخفضة.
5. تدور أسفل في 252 × ز في microcentrifuge لمدة 1 دقيقة وإزالة supernatant، مع الحرص على عدم لمس بيليه دودة في الجزء السفلي من الأنبوب.
6. لمراقبة محتوى الدهون باستخدام 4،4-difluoro-1،3،5،7،8-Pentamethyl-4-بورا-3a،4a-diaza-s-indacene (BODIPY) تلطيخ¹⁰ (جدول المواد)، إصلاح الديدان إما عن طريق إضافة 0.5 مل من 60٪ isopropanol إلى بيليه دودة لمدة 3 دقائق¹¹، أو عن طريق إضافة 2 مل من الميثانول الجليد الباردة لمدة 10 دقيقة. لكلا الإجراءين، عكس الأنبوب كل 30 s.
   تنبيه: إذا كان الميثانول هو كاشف التثبيت المختار ، فيجب القيام بهذه الخطوة في غطاء الدخان بسبب سميته.
7. إزالة أكبر قدر ممكن من التثبيت دون لمس بيليه دودة وإضافة 1 مل من M9. دع الديدان تستقر في قاع الأنبوب لمدة 3−5 دقائق.
8. غسل مرة أخرى مع 1 مل من M9، والسماح للدودة تسوية وإزالة ناظر، وترك حوالي 50 ميكرولتر في الأنبوب. تأمين أنبوب باستخدام المشبك.
9. تجميد الكراك الديدان عن طريق الغطس أنبوب مغلق بشكل آمن في النيتروجين السائل ومن ثم في حمام الماء الدافئ في ~ 40 درجة مئوية.
10. كرر الخطوة 1.9 مرة أخرى.
11. إضافة 0.5 مل من BODIPY المخفف في M9 في تركيز نهائي من 1 ميكروغرام / ميكرولتر ووضعها على دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
12. بعد 1 ساعة، دع الديدان تستقر في الجزء السفلي من الأنبوب لمدة 3−5 دقائق.
13. إزالة فائقة وإضافة 1 مل من M9.
14. دع الديدان تستقر في الأسفل وتزيل الـ(سوبرنات)
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، من الممكن أن تدور في 252 x ز لمدة 1 دقيقة، لأن هذا لا يبدو أن تؤثر على مورفولوجيا.
15. إضافة 0.5 مل من M9.
    ملاحظة: إذا كان المثبت هو 60٪ isopropanol، لا يمكن استخدام الديدان إلا في غضون 48 ساعة. إذا كان المثبت هو الميثانول، ينبغي استخدام الديدان في غضون 24h.

2. إعداد منصات agarose لتركيب الديدان

ملاحظة: الخطوة الحاسمة أثناء إعداد لوحة agarose هو الحصول على وسادة من سمك العادية. خلاف ذلك ، فإن الديدان عبر الوسادة تكون في طائرات محورية مختلفة ، مما يجعل من الصعب الحصول على صورة مركزة لمجال أوسع من الرؤية.

1. إعداد 2٪ منصات agarose بإضافة 0.2 غرام من agarose إلى 10 مل من معقمة H₂O في الكأس أو قارورة مخروطية. سخني في الميكروويف لمدة 30 s حتى يبدأ الأاغروز في الغليان.
   ملاحظة: لا ترتفع درجة الحرارة وتوقف بمجرد ظهور الفقاعات؛ وإلا فإنه يزيد من اللزوجة من agarose مما يجعل من الصعب تحقيق سمك وسادة المطلوب.
2. مرة واحدة في agarose هو ذاب، الاستغناء عن قطرة من agarose ذاب في وسط شريحة زجاجية المجهر باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر مع قطع نهاية جدا. على الفور، ولكن بدقة، عقد شريحة زجاجية أخرى قريبة جدا من قطرة agarose والإفراج عنه على agarose لتشكيل لوحة من سمك العادية للحصول على أفضل نتائج المجهر.
   ملاحظة: إن تحرير الشريحة العلوية من الارتفاع لن يشكل فقاعات فقط، بل سينتج عنه لوحة غير مستوية. بدلا من ذلك، من الممكن أيضا استخدام اثنين من الشرائح الزجاجية التي تحيط الشريحة مع لوحة، مع طبقة رقيقة من الشريط على كل شريحة.
3. بعد 2−3 دقيقة كحد أدنى، قم بإزالة الشريحة العلوية برفق. باستخدام جانب الشريحة العلوية، تقليم لوحة لجعله مربع الشكل. جبل الديدان في غضون 5 دقائق، لمنع لوحة من التجفيف قبل الاستخدام.

3. تركيب الديدان الثابتة للتصوير

1. إنشاء الفم micropipette عن طريق تمديد شعرية زجاجية رقيقة في شعلة بونسن الموقد (الشكل 1A). بعد التمديد في اللهب، وكسر شعري إلى قطعتين (الشكل 1B). اختيار الأكثر كفاية، وعادة ما تكون أطول، واختبار ما إذا كانت نهاية الشعرية مفتوحة من خلال محاولة لpirate المياه.
   ملاحظة: إذا لم يدخل السائل إلى الشعيرات الدموية، فهو رقيق جداً أو مسدود. قطع بلطف نهاية الشعرية مع زوج من مقص، وتجنب قطع الكثير كما سيتم يستنشق الديدان إذا كان الثقب كبير جدا.
2. سد الشعرية الزجاجية من الخطوة 3.1 في محول الشعيرات الدموية (الشكل 1C) ، مرتبطة أنبوب السيليكون 6 مم وسد الطرف الآخر من أنبوب السيليكون 6 مم في مرشح 0.2 ميكرومتر ، تعلق على أنبوب سيليكون 3 مم على الطرف الآخر(الشكل 1C). قم بتوصيل طرف مرشح 1 مل(الشكل 1C) في النهاية الحرة من أنبوب السيليكون 3 ملم لpirate السائل.
   ملاحظة: يتم إضافة مرشح 0.2 ميكرومتر بين فم المجرب والشعيير، لضمان أقصى قدر من السلامة للمجرب. ويستخدم حل مماثل لميكروبيبيبتس الفم المستخدمة في التعامل مع أجنة الماوس¹². تغيير مرشح (عادة كل بضعة أشهر) إذا كان الفم micropipette ليست التعرق السائل بعد الآن.
3. باستخدام الفم micropipette تحت مجهر تشريح، وإزالة أكبر قدر ممكن من السائل حول بيليه دودة من الديدان الثابتة(الشكل 2).
   ملاحظة: يمكن استخدام الأنابيب الفائقة باستخدام ميكروبيبت يدوي كبديل للماصات الفم في الخطوات من 3.1 إلى 3.3 لإزالة أكبر قدر ممكن من المصات. إضافة 6 ميكرولتر من متوسطة التركيب. ومع ذلك، نجد أن هذه الطريقة لا تعمل بكفاءة لأن السائل الزائد في الوسادات يخلق كثافة دودة متفرقة، مما يجعل التصوير أكثر استهلاكًا للوقت. استئناف الخطوة 3.6. ننظر في الجزء السفلي من الأنبوب وتأكد من أن ماصة لا تتبخر الديدان.
4. إضافة بسرعة 10 μL من تركيب المتوسطة(جدول المواد)إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
5. شطف طرف 10 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني مع آثار المنظفات (0.01٪ تريتون)، لمنع الديدان من التمسك الجانبين من طرف الماصات البلاستيكية. قطع نهاية الحافة مع زوج من مقص.
6. نقل 8 ميكرولتر من تركيب المتوسطة التي تحتوي على الديدان على لوحة agarose المعدة في الخطوة 2.3. تحت المجهر، يهز بلطف الشريحة، لتجنب تداخل الديدان.
7. تغطية قطرة من تصاعد المتوسطة على لوحة agarose مع 18 مم × 18 مم coverlip (الشكل 3).
   ملاحظة: يفضل الأغطية الصغيرة لأنها تمارس ضغطاً أقل على الديدان. امسك الغطاء مع زوج من الملاقط واطبق حافة واحدة من الغطاء على لوحة agarose، قبل إيداع الغطاء بلطف مع الملاقط.

4. تركيب الديدان الحية للتصوير

ملاحظة: لصورة الديدان الحية، يجب أن تكون معطلة على لوحة. طريقة واحدة لتحقيق ذلك هو شل لهم مع ناهض مستقبلات النيكوتين: levamisole (جدول المواد).

1. الماصات 3−4 ميكرولتر من 3 mM levamisole حل في M9 على لوحة agarose التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.3.
   ملاحظة: يجب أن يكون هناك حجم سائل كافية أن الديدان ليست فوق بعضها البعض ولكن ليس الكثير من السائل أن الديدان هي متناثرة جداً على لوحة. يمكن لمقارس الدودة ذوي الخبرة استخدام 3 ميكرولتر من levamisole. قد يحتاج جامعي أقل خبرة إلى إضافة حجم أكبر من levamisole ، بحيث لا يتبخر levamisole تمامًا.
2. اختر 30−50 ديدان لكل حالة في قطرة ليفاميسول.
3. تغطية قطرة levamisole على لوحة agarose مع 18 مم × 18 مم الأغطية. الديدان الصورة داخل 1 ساعة، كما أن العامل المشلّل يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الديدان.

5. الشرائح التصوير مع مجهر epifluorescence

1. مع لوحة agarose من سمك موحد، صورة جميع الديدان على الشريحة في وقت واحد باستخدام صورة كبيرة 6 × 6 أو 7 × 7 على سبيل المثال مع الهدف 20x من المجهر الفلورسنت. إذا كان سمك لوحة ليست حتى، والحصول على عدة أصغر 3 × 3 أو 4 × 4 صور من نفس الشريحة.
2. استخدم نفس الإعدادات لشدة الفلوريسنس ووقت التعرض لجميع الحالات. اضبط كل إعداد ليطابق الشريحة التي تتميز بأعلى كثافة، مع التأكد من عدم وجود تشبع بالبكسل. للحصول على إرشادات محددة حول الحصول على الصور، اتبع تعليمات الشركة المصنعة للمجهر.

6. إنشاء صور المونتاج من الديدان واحد الانحياز باستخدام خط أنابيب دودة محاذاة فيجي

1. تثبيت برنامج تحليل الصور مفتوحة المصدر فيجي¹³/ImageJ¹⁴ من https://imagej.net/Fiji. إذا كان التثبيت المسبق فيجي متاح، تأكد من تحديثه إلى الإصدار 1.52a أو أحدث، كما تتطلب ذلك بعض الوظائف المستخدمة في الماكرو (مثل وظائف الجدول). تنزيل الماكرو المتنقل محاذاة من Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
2. فتح FIJI وتشغيل الماكرو محاذاة الفيروس المتنقل. تنفيذ محاذاة الدودة بالنقر فوق الإضافات | | وحدات الماكرو تشغيل في شريط القوائم الرئيسي فيجي (الشكل S1). الآن حدد موقع البرنامج النصي Worm-align.ijm على الكمبيوتر.
3. تهيئة الماكرو عن طريق طلب موقع الصور. وسوف تعمل على خط أنابيب على حد سواء قناة واحدة ومتعددة القنوات الصور الفلوريسنس(الشكل S2). حدد مجلد إدخال وسينشئ الماكرو مجلد إخراج تلقائياً حيث سيتم حفظ كافة النتائج(الشكل S3).
   ملاحظة: من المهم أن المجلد المحدد يحتوي على ملفات الصور فقط كما سيؤدي وجود تنسيقات الملفات الأخرى إلى حدوث عطل في الماكرو. من الناحية المثالية ، تجمع فقط الصور التي تم التقاطها مع نفس إعدادات المجهر. سوف دودة محاذاة قبول العديد من تنسيقات الملفات المختلفة، بما في ذلك nd2، czi، tif، rgb، jpg و png. سيكون اسم مجلد الإخراج هو نفسه مجلد الإدخال، مع إضافة "_output" كـ postfix، أي إذا كان مجلد الإدخال هو "الصور"، سيتم العثور على الإخراج في "images_output". مجلد الإخراج سوف يحتوي على أربعة مجلدات فرعية، حيث سيتم حفظ البيانات.
4. السماح الماكرو للمتابعة لفتح الصورة الأولى في مجلد الإدخال واستخدامه كصورة تمثيلية لاستخراج إعداد لإنشاء المونتاج.
   ملاحظة: سيتم تلقائياً تحديد محاذاة Worm الصورة الأولى في مجلد الإدخال لإنشاء الإعدادات التي سيتم تطبيقها على كافة الصور الأخرى في المجلد. إذا كانت هناك صورة أخرى تعتبر أكثر تمثيلاً لمجموعة البيانات، تأكد من تحديد هذه الصورة عن طريق حفظ نسخة من الصورة في مجلد الإدخال، وتغيير الاسم بحيث يتم الآن سرده في أعلى القائمة (على سبيل المثال، "0_RepresentativeImage").
5. باستخدام أداة الرسم في خط مستقيم، ارسم خطًا عبر عرض الفيروس المتنقل(الشكل S4)واستخدم طول هذا الخط لتحديد ارتفاع المناطق المزروعة للدودة المفردة. لكل قناة، حدد الاسم، جدول البحث (LUT)، إعدادات الكثافة (B&C) وما إذا كان يجب تضمينها في المونتاج(الشكل S4).
   ملاحظة: يتم تسجيل هذه المعلمات وحفظها في ملف إعدادات إعدادات .csv، الموجود في المجلد الفرعي CellProfiler من مجلد الإخراج.
6. مرة واحدة وقد تم التقاط جميع الإعدادات، يتم عرض المستخدم ما ستبدو الصور بعد تطبيق الإعدادات المطبقة (الشكل S5). ضع علامة على المربع العلوي إذا كانت الإعدادات كافية. حدد خيارات لتوليد المونتاج (إزالة القراد، إن لم يكن مطلوبا): 1. توليد المونتاج من الديدان المحددة لكل صورة واحدة، أو 2. توليد المونتاج مجتمعة التي سيتم دمج جميع الديدان المحددة على جميع الصور في مجلد الإدخال في مونتاج واحد. انقر فوق موافق لتنفيذ باقي الماكرو.
   ملاحظة: إذا لم يتم تحديد المربع العلوي قبل النقر فوق 'موافق' الماكرو سيتم إعادة تشغيل الإعداد، لذلك يمكن تحسين إعدادات الصورة.
7. ينتقل خط أنابيب محاذاة الفيروس الآن إلى فتح كافة الصور في مجلد الإدخال. لكل صورة، رسم خطوط على محور طولي من جميع الديدان التي يتعين تضمينها في المونتاج و / أو كمي(الشكل 4 والشكل S6)باستخدام أداة 'خط مجزأة' (على شريط القائمة الرئيسي فيجي). لضمان محاذاة السليم من دودة، ورسم خطوط باستمرار من الرأس إلى الذيل نهاية (أو العكس بالعكس)، وعلى طول كامل من الدودة (انظر أمثلة على رسم خط "جيد" و "سيئة" في الشكل 4B).
8. إضافة كل سطر إلى مدير ROI، عن طريق النقر على Ctrl + T. يستخدم دودة محاذاة خطوط إضافة إلى مدير ROI ، في تركيبة مع المعلمة عرض الفيروس المتنقل (مجموعة في الخطوة 6.4) لتوليد الصور المقصوصة من الديدان واحد مختارة. يتم حفظ مجموعة ROIs السطر في المجلد الفرعي 'البيانات'. يحتوي هذا المجلد أيضا على نسخة من الصورة الأصلية التي تعرض الخطوط، بالإضافة إلى عدد الفيروس المتنقل. يتم ترميز الخطوط بالألوان باستخدام جدول البحث Glasbey_on_dark. يتم حفظ صور الفيروسات المتنقلة في المجلد الفرعي single_worms لمجلد الإخراج. بالإضافة إلى ذلك، إذا تم تحديدها في الخطوة 6.6 من هذا البروتوكول، تنتج محاذاة الفيروس المتنقل المونتاجات من كافة الديدان المحددة في صورة النظرة العامة و/أو لكافة الصور في مجلد الإدخال (انظر الشكل 4C وS7 الشكل). يمكن العثور على هذه المونتاج في المجلد الفرعي 'الانحياز' من مجلد الإخراج.

7. تحليل كثافة الفلورانس أحادي الدودة باستخدام الإخراج من محاذاة Worm في خط أنابيب CellProfiler الآلي

1. لمعالجة البيانات المصبّة وتحليل إخراج محاذاة الفيروس المتنقل، قم بتنزيل وتثبيت حزمة برامج تحليل الصور مفتوحة المصدر 'CellProfiler^15،16 من https://cellprofiler.org/. تحميل خط أنابيب Worm_CP.cpproj من GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
   ملاحظة: تم إنشاء خط أنابيب المثال الموضح هنا باستخدام CellProfiler2.2.0 وقد لا يتم تشغيل في الإصدارات اللاحقة من CellProfiler.
2. قبل بدء تشغيل خط أنابيب Worms_CP.cpproj، تأكد من وجود كافة صور الإخراج المتوقعة في المجلد الفرعي CellProfiler لمجلد الإخراج المتنقل محاذاة: نسخة معالجة من الصورة الأصلية (المسمى: Original_)، وقناع صورة ثنائي من مجموعة الفيروس المتنقل (المسمى: Mask_)، قناع خط من الخطوط المرسومة على دودة محددة (المسمى: Lines_)، وصورة واحدة تمثل كل من القنوات الموجودة في الصورة الأصلية (المسمى حسب رقم القناة).
3. لتحديد كثافة الفلوريسين في الديدان واحدة، انقر على وحدة الإدخال الصور وببساطة سحب مجلد الإخراج CellProfiler في النافذة التي تقول إسقاط الملفات والمجلدات هنا. إذا كانت قائمة الصور موجودة من التحليل السابق، قم أولاً بإزالة هذه بواسطة النقر بزر الماوس الأيمن في النافذة وتحديد "مسح قائمة الملفات". لاستثناء ملف "الإعدادات.csv" من قائمة الصور، حدد إما "الصور فقط" أو "مخصص" مع 'Extension is tif أو tiff أو ome.tif أو ome.tiff' لإعدادات التصفية(الشكل S8).
4. انقر على وحدة إدخال بيانات التعريف. في أسلوب الاستخراج الثاني، انقر فوق المجلد الأصفر، وحدد موقع المجلد الفرعي CellProfiler في مجلد إخراج WormAlign (الشكل S9). حدد الإعدادات.csv الملف وربط الإعدادات في الملف إلى إخراج CellProfiler عن طريق مطابقة البيانات الأولية في ملفات CSV مع تلك الموجودة في الصور (بيانات تعريف القناة).
5. انقر فوق وحدة الإدخال NamesAndTypes وإدراج صورة جديدة لكل قناة من الصورة الأصلية التي سيتم قياسها كمياً.
   ملاحظة: موجودة بالفعل في خط أنابيب المثال قناع دودة الصور لون اثنين قناع الخط والصورة الأصلية و صور مقياس الرمادية الثلاثة (الأخضر و القناة الحمراء). يجب تعديل القائمة في هذه الوحدة إذا كانت الصور الأصلية تحتوي على قنوات أكثر أو أقل من الصور المثال.
6. تحقق من صحة اسم الصور في كل تسمية عمود/ قناع/ديدان.
   ملاحظة: يجب أن تتوافق أسماء الصور على سطر واحد مع نفس الصورة الأولية لتحليلها. إذا تم ارتكاب خطأ أثناء عملية تحليل الصور، فإن بعض صور الإخراج ستكون مفقودة ولن تتوافق الأسماء تحت تسمية الأعمدة الثلاثة/قناع/ديدان مع نفس الصورة الأولية لكل سطر. إذا كان هذا هو الحال، العثور على حيث الخطأ.
7. اضغط على إعداد الإخراج عرض لتحديد المجلد لحفظ الإخراج من Cellprofiler.
8. انقر فوق بدء اختبار الوضع. مرة واحدة في وضع الاختبار، راجع إعدادات خط الأنابيب من خلال تطبيقها على الصورة الأولى في مجموعة البيانات، عن طريق النقر فوق تشغيل (الذي سيتم تشغيله من خلال كافة الوحدات النشطة في خط الأنابيب)، أو الخطوة (التي سيتم تشغيلها من خلال خط أنابيب وحدة نمطية واحدة في كل مرة).
   ملاحظة: أثناء في وضع الاختبار، لن يتم تصدير القياسات المستخرجة حتى إذا كانت الوحدة النمطية ExportToSpreadsheet موجودة (ونشطة) في خط الأنابيب.
9. بمجرد أن ينفذ خط الأنابيب الطريقة التي يجب أن يقوم بها، انقر فوق إنهاء وضع الاختبار ثم اضغط على تحليل الصور. كما تم تكوينه حالياً، فإن Worms_CP (1) سوف تستخدم صورة Mask_ لتجزئة قناع دودة خشنة وصورة Lines_ (الشكل S10A)لإفراد الديدان المختارة وإنتاج أقنعة دودة واحدة(الشكل S10C)( 2) قياس شدة الفلوريسنس لجميع القنوات الموجودة في صور الإدخال في تلك الديدان التي تم تحديدها ومقنعة. ويمكن أيضا لقياس خط أنابيب كثافة الخلفية (الشكل S10B) وتصحيح جميع الصور وفقا لذلك (المشار إليها من قبل عتبة الكلمة في اسم المعلمة تقاس على سبيل المثال: Intensity_MeanIntensity_green_threshold)، (3) قياس حجم الديدان المحددة، و (4) تصدير جميع المعلمات المقاسة (الشكل S10D).
10. افتح إخراج Worm_CP يتكون من ملفين csv وdدان.csv وخطوط.csv يتم حفظها في مجلد الإخراج المحدد (انظر الشكل S11). يمكن فتح هذه الملفات في Excel أو R (Studio) للمعالجة اللاحقة وإعداد التقارير. إذا كان هناك حاجة إلى إخراج إضافي، على سبيل المثال لكل صورة بيانات، يمكن تحديد هذا في الوحدة النمطية ExportToSpreadsheet في خط الانابيب.

النتائج

زراعة وتصوير C. elegans وفقا للطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول تنتج صور كبيرة نظرة عامة من مجموعات الديدان. لتسهيل التفتيش البصري وتصنيف الديدان من هذه الصور وضعنا دودة الانحياز. دودة محاذاة هو نصي فيجي بسيطة وسهلة الاستخدام التي يمكن استخدامها لإنشاء المونتاج من الديدان استقامة ومحاذية. يتم تحديد الديدان من صور عامة برسم خط على طول المحور الطولي للدود. يتم تعيين كل دودة مختارة رقمًا، واقتصاصها وتقويمها، وإضافته إلى المونتاج. يمكن إنشاء المونتاج لكل صورة أو الجمع بين جميع الصور من مجلد الإدخال الأصلي.

كما هو متوقع، يعتمد إنتاج خط الأنابيب إلى حد كبير على جودة الخطوط المرسومة فوق الصور. لتوضيح هذه النقطة، يظهر الشكل 4 عدة أمثلة سطر وإخراجها من محاذاة Worm. خط كامل من الرأس إلى طرف الذيل ينتج دودة محاذاة بشكل صحيح (المسمى "جيد"). كما يوضح الشكل 4 كيف تؤثر أخطاء التتبع أثناء تنفيذ محاذاة Worm على إخراج المحاذاة. من المونتاج المشروح المدرجة في الشكل 4C، ينبغي توخي الحذر لتجنب الأخطاء التالية ، لأنها تعيق المحاذاة السليمة للدودة:

• عدم اتساق تتبع الدودة من الرأس إلى الذيل (المسمى "الذيل إلى الرأس"). وينتج عن ذلك أن تكون الديدان موجهة في اتجاهات مختلفة (أي من الذيل إلى الرأس مقابل الرأس إلى الذيل) في المحاذاة.
• عدم اكتمال التتبع (المسمى "غير مكتمل"). وهذا يؤدي فقط إلى جزء من الدودة التي تم تتبعها ليتم اقتصاص للمونتاج.
• بما في ذلك الديدان المتعددة في أثر واحد (المسمى "دودة برأسين"). هذا ينتج في ديدان [إيندسدسّكد/ جزأدسّرزد منّيّاوّيّاّونتّيّاّونتّيّونتّيّاّونتّيّا].
• إضافة خطوط عشوائية إلى الصورة (المسمى "عشوائي"). وهذا يؤدي إلى إدخال لوحات عشوائية في المونتاج.

لإنشاء المونتاج ليست مشكلة إذا تقاطع خطين فرديين (المسمى "تقاطع") أو يتم ضمهما في نهاية الدودة (المسمى "انضم") ، طالما أن كل خط يتتبع طول دودة فردية: يقوم Script -Worm-align بشكل فردي وتسلسلي باختيار كل سطر ROIs ، والمحاصيل وتقويمها ، بحيث تمثل كل لوحة في المونتاج النهائي تتبع خط واحد. في حالة الديدان المتقاطعة ومع ذلك، على الرغم من طول كامل الديدان تقويم تظهر للدودة "intersect1" والدودة "intersect2" في المونتاج (انظر الشكل 5A-B)،ومن الواضح أن هذه الديدان عبر بعضها البعض في صورة نظرة عامة الأصلي. لذلك، يمكن استنتاج أن التحديد البصري للخطوط المتقاطعة ممكن من صورة التراكب الموجودة في المجلد الفرعي "البيانات"(الشكل 5A)،وكذلك من لوحات الديدان الفردية في المونتاج (الشكل 5B). بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد أي تداخل بين الديدان/الخطوط من جدول التحكم في الجودة (QC) الذي تم إنشاؤه لكل صورة تمت معالجتها بواسطة محاذاة الفيروس المتنقل، وحفظه في المجلد الفرعي للبيانات. يسجل هذا الجدول ثلاث معلمات لكل خط من ROIs رسمها في الصورة (انظر الشكل 5C) : من هذه, طول يشير إلى طول خط ROI, وهو مؤشر جيد لحجم الدودة; ويشير رقم الفيروس المتنقل إلى الترتيب الذي تم رسم الخطوط به على صورة النظرة العامة. وأخيراً، يشير العمود الأخير إلى ما إذا كان هناك تداخل بين الفيروس المتنقل/الخط المعني وأي من الديدان/الخطوط الأخرى المحددة في الصورة. في حالة التداخل، سيكون الرقم في هذا العمود مختلفاً عن الرقم المدرج في عمود رقم الفيروس المتنقل. في تركيبة مع صورة تراكب، ينبغي أن يساعد الجدول QC الباحث لاتخاذ القرارات المستفادة التي ينبغي استبعاد الديدان من المونتاج و / أو الكم.

ويمكن استخدام الناتج من محاذاة دودة للكمية اللاحقة من كثافة الفلوريسين في الديدان واحدة. في فيجي، يمكن استخدام خط ROIs لقياس كثافة الفلوريس في بيانات الصورة الأصلية، على سبيل المثال عن طريق تنفيذ السيناريو الفيجي البسيط 'Worm-quant.ijm'، والذي يمكن العثور عليه أيضًا في مستودع محاذاة الدودة على Github. بدلاً من ذلك، يمكن استيراد إخراج محاذاة المتنقل إلى برنامج تحليل الصور من جهة خارجية. نحن نبرهن على ذلك عن طريق استيراد إخراج Worm-align من مجموعتي مجموعات البيانات إلى Worm_CP، خط أنابيب قمنا بتوليدها في CellProfiler. Worm_CP يستخدم الملفات في المجلد الفرعي 'CellProfiler' المجلد إخراج محاذاة الفيروسة لضبط أقنعة تجزئة تلك المتنقلين الفردية المحددة أثناء تنفيذ الماكرو محاذاة المتنقل. وبوجه خاص، فإنه يستخدم قناع الخط (المسمى: Lines_) لعزل الديدان المحددة من السكان المتنقلين ينظر في قناع ثنائي (المسمى: Mask_). وتجدر الإشارة إلى أن الخطوط التي تتقاطع على صورة النظرة العامة(الشكل 5A)،على الرغم من أنها ليست مشكلة لتوليد المونتاج، هي إشكالية لخط أنابيب Worm_CP. لماذا هذا هو الحال، ويتضح في الشكل 5 D-E. Worm_CP يستخدم قناع الخط (الشكل 5D)، وليس ROIs الفردية للمساعدة في تحديد الديدان الفردية. الخط المتقاطع الذي تم رسمه في المرتبة الثانية أثناء تنفيذ محاذاة الدودة يتم فرضه على الخط الأول وبالتالي فإن الكثافة على طول هذا الخط ستكون من ROI2 بما في ذلك في بت حيث يتداخل الخط 1 و 2. كـ نتيجة لذلك، سيقطع CellProfiler line2 ككائن واحد، ولكن line1 ككائنين مفصولين حيث يتقاطع مع line2. وهذا يعني أن CellProfiler سوف تنتج اثنين (نصف) أقنعة دودة للدودة 'intersect1' (الشكل 5E). أسهل طريقة لاستبعاد هذه الأحداث من التحليل النهائي (إذا لزم الأمر) ، هو تحديد عدد worm من worm intersecting من جدول QC (مجلد البيانات الفرعية) ، وإزالة القياسات لهذه الفيروسات المتنقلة من ملفات الإخراج CellProfiler. الرجاء ملاحظة أن الفيروسات المتنقلة لن بالضرورة أن يتم تخصيص نفس العدد في FIJI و CellProfiler: لتعريف رقم الفيروس المتنقل في FIJI في ملف إخراج CellProfiler في القيم Intensity_Max_Intensity في ملف الإخراج "خطوط.csv". أي قيمة Intensity_Max_Intensity تظهر في جدول "خطوط.csv" أكثر من مرة واحدة لكل صورة هو إشارة إلى ذلك العائد على الاستثمار الخط مما يؤدي إلى قناع دودة مكسورة.

بمجرد أن يتم تقسيم أقنعة الدودة الفردية، يمكن Worm_CP قياس شدة الفلوريس في الديدان المختارة لجميع القنوات المسجلة. يتم أخذ كافة القياسات من بيانات الصورة الأصلية (الخام) ، على الرغم من أنه يجب ملاحظة أن CellProfiler تلقائياً rescales كثافة بكسل على مقياس من 0-1. ويتحقق ذلك عن طريق تقسيم قيمة كثافة البكسل الخام على أقصى قدر ممكن من كثافة البكسل للصورة. في حالة الصور 8 بت هذه القيمة هي 255، وفي حالة الصور 16 بت هو 65535. قيم كثافة CellProfiler لذلك تحتاج إلى ضرب بواسطة أقصى قيمة كثافة ممكنة لاستعادة القيم المكافئة لبيانات الصورة الأولية. يتكون الإخراج Worm_CP من ملفين csv، 'worms.csv' و 'lines.csv' التي يتم حفظها في مجلد الإخراج المحدد. أثناء فحص هذه الملفات، من الواضح أن CellProfiler يسجل عدد كبير من المعلمات المتعلقة كثافة الفلوريسين. ومن هذه الوفيات، فإن Intensity_IntegratedIntensity يقابل الفلوراي الكلي لكل دودة (أي مجموع كثافة الفلوريسنس داخل جميع وحدات البكسل التي تفسر قناع الدودة الفردية). المعلمة Intensity_MeanIntensity يشير إلى متوسط كثافة الفلوريسنس داخل دودة فردية (أي متوسط كثافة الفلوريسين لكل بكسل لجميع وحدات البكسل الموجودة داخل دودة فردية). بسبب حدوث عرضية من الأخطاء (الصغيرة) في تجزئة أقنعة دودة فمن المستحسن أن تستخدم قياسات MeanIntensity عند مقارنة قياسات الفلورنس من الديدان الفردية بين شرطين. إذا كنت ترغب في اِنْتِرْج الفلورية الخلفية من القياسات الكمية، استخدم القياسات المسماة MeanIntensity_Threshold.

لقد استخدمنا خط أنابيب Worm_CP لقياس كثافة الفلوريسنس من الحيوانات الثابتة التي تم وضع علامة عليها بصبغة فلورية تدمج في قطرات الدهون (LDs) (الشكل 6). من أجل التحقق من تقدير الفلورانس من خط أنابيب الدود - محاذاة / Worm_CP ، قمنا بتحديد كثافة الفلورانس في نفس المجموعة من الديدان من مجموعة البيانات BODIPY إما بواسطة خط أنابيب Worm-align/Worm_CP أو القياس الكمي اليدوي في FIJI / ImageJ. تم إجراء القياس الكمي اليدوي في FIJI/ImageJ من خلال الدوران حول كل دودة بالإضافة إلى منطقة خلفية داكنة في كل صورة. تم قياس كثافة الفلوريسنس في مدير عائد الاستثمار وتم طرح القيمة التي تم قياسها لخلفية الصورة من قياس الفلورسنس الدودة لكل دودة ، كما هو موضح¹⁷. قارنا نوع البرية (WT) N2 الديدان إلى dbl-1 (nk3) المسوخ، الذي يعرض انخفاض محتوى قطرات الدهون¹⁸. كما هو متوقع، يتم تقليل كثافة الفلورسين الخضراء بشكل كبير بين WT والديدان dbl-1 (nk3) مع كلا الأسلوبين (الشكل 6A, B). ويمكن ملاحظة أمثلة على الديدان الانحياز في الشكل 6C, D. وينخفض محتوى قطرات الدهون بنسبة 17٪ (p-value< 0.0001، اختبار t غير المدفوعة) بين WT و dbl-1 (nk3) باستخدام القياس الكمي اليدوي، و 14٪ (p-value= 0.0051 اختبار t غير مُجزئ) باستخدام خط أنابيب Worm_CP. انخفاض في محتوى قطرات الدهون لوحظ هنا في dbl-1 (nk3) مع كل من طرق القياس الكمي وفقا للأدب¹⁸. وهذا يدل على أن القياس الكمي لصور الفلورسنس المكتسبة مع خط أنابيب CellProfiler Worm_CP يماثل القياس الكمي اليدوي.

كما استخدمنا Worm_CP لقياس استجابة الصدمة الحرارية في الديدان الحية التي تعبر عن GFP تحت السيطرة على الصدمة الحرارية الجين hsp-70 (C12C8.1)⁹. ويبين الشكل 7 صورا تمثيلية لـ C. elegans يحمل hsp-70 (C12C8.1) p::مراسل GFP. في غياب الإجهاد الحراري، والديدان لا تحفز GFP التعبير (الشكل 7A, B). ومع ذلك، عندما تتعرض الديدان لصدمة الحرارة قصيرة من 30 دقيقة في 34 درجة مئوية، فإنها تحفز GFP التعبير(الشكل 7C، D). يتم قياس مستويات التعبير GFP مع وبدون صدمة الحرارة في الشكل 7E.

كما هو الحال، Worm_CP هو خط أنابيب أساسي جدا. ومع ذلك، فإن هذا النهج يتيح تقسيم أكثر دقة لأقنعة دودة الفردية، مما يسمح بتحديد كمي أكثر دقة لشدة الفلوريس في تلك الديدان المختارة من الصورة. ولهذا السبب، نفضل هذا النهج على التقدير الكمي التقريبي في فيجي، باستخدام أقنعة الخطوط فقط. بالإضافة إلى ذلك، يوفر CellProfiler ميزة أن وحدات التحليل إضافية يمكن بسهولة تضمين في خط الأنابيب. على سبيل المثال، بالنسبة لمجموعة البيانات التي تنظر في محتوى قطرات الدهون، يمكن لإدراج وحدات إضافية في خط أنابيب Worm_CP أن تحقق في أرقام قطرات الدهون وكثافة الفلوري من قطرات فردية في تلك الديدان المحددة في الصور نظرة عامة.

الشكل 1: توليد فم micropipette. يتم تمديد الشعيرات الدموية الزجاجية في شعلة ناسخ بونسن (A) ، حتى يوفر أطرافًا ممدوده رفيع (B). ثم يتم توصيل الشعيرات الدموية الزجاجية الممتدة إلى قطعة محول من micropipette الفم. (C) التخطيطي من فم micropipette. تم تجميع الفم micropipette مع شعري زجاجي موصول محول. A أنبوب سيليكون 6 مم يربط محول إلى 0.2 μm محاكة الحقن، وتستخدم للسلامة. يتم إرفاق الطرف الآخر من المرشح إلى أنبوب سيليكون 3 مم تنتهي مع طرف مرشح 1mL. يمكن للمجرب أن يتبخر عبر طرف التصفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: طموح السائل المحيط بيليه دودة، وذلك باستخدام micropipette الفم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: إضافة الغطاء على الديدان التي تم وضعها على لوحة agarose الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: أمثلة من استقامة دودة باستخدام دودة محاذاة على الصور الفلوريسنس المكتسبة من الحيوانات الحية تحمل مراسل النسخي الدهون-7p::GFP في الأمعاء وعلامة حقن مشارك الأحمر في البلعوم(ميو-2p::tdtomato). (أ) لقطة شاشة لصورة مركبة تم الحصول عليها على المجهر الفلوري للدودة الحية في اليوم الثالث من مرحلة البلوغ. تم فتح الصورة مع Worm_align ورسمت خطوط على طول المحور الطولي من الديدان باستخدام محاذاة دودة. (B) لقطة شاشة لنفس الصورة كما في (A) ، مع أمثلة على رسم جيد وسيء للخطوط على طول محور الديدان ، باستخدام محاذاة الدودة. (C) أمثلة على خطوط مرسومة على أعلى من الديدان التي يمكن أن ترتفع إلى الديدان الانحياز بشكل غير صحيح. دودة محاذاة الإخراج من الديدان المحددة في B. أخذت الصور مع الهدف 20x على المجهر واسعة مقلوب (انظر جدول المواد) مع كثافة الفلورانس الأخضر = 1، والتعرض = 60 مللي ثانية وكثافة الفلورنسي الأحمر = 8، التعرض = 60 مللي ثانية الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: أمثلة على استقامة الدودة باستخدام محاذاة الدودة على الديدان المتقاطعة. (A) لقطة شاشة لصورة مركبة المكتسبة على المجهر الفلورسنت من الديدان الحية في اليوم 3 من الحيوانات مرحلة البلوغ تحمل مراسل النسخ الدهون -7p:: GFP في الأمعاء وعلامة حقن مشارك الأحمر في البلعوم(ميو -2p::tdtomato). وتوصف الديدان المتقاطعة بأنها "تقاطع1" و "تقاطع2"، بينما تسمى الديدان غير المتداخلة "good3" و "good4". (B) المونتاج التي تم إنشاؤها بواسطة دودة محاذاة تمثل الديدان استقامة المحدد في (A). ومن الملاحظ في المونتاج أن الديدان 1 و 2 كانت تتقاطع على الصورة الأصلية (الديدان وصفت بأنها "intersect1" و "intersect2"). (C) لقطة شاشة لجدول مراقبة الجودة من محاذاة الدودة التي تسمح لاكتشاف الحالات التي تتقاطع فيها الديدان. الطول: طول خط العائد على الاستثمار؛ عدد دودة: الترتيب الذي تم رسم الخطوط؛ يشير العمود الأخير إلى ما إذا كان هناك تداخل بين الفيروس المتنقل/خط الاهتمام وأي دودة أخرى. في هذا المثال، دودة في الأول الخام (الفيروس المتنقل رقم1) يتداخل مع الفيروس المتنقل رقم 2، كما هو مشار إليه من قبل الرقم "2" في العمود الأخير. (D) لقطة شاشة للخطوط المرسومة مع محاذاة Worm على الديدان الأربعة المحددة في A. (E) لقطة شاشة للأقنعة التي تم إنشاؤها بواسطة Worm-align على الديدان الأربعة المحددة في A ، توضح كيفية تقديم الأقنعة للدود المتقاطعين. في هذه الحالة، قناعين بدلاً من واحد هي الآن المقابلة للدودة "intersecting1". تم التقاط الصور مع هدف 20x على مجهر واسع مقلوب (انظر جدول المواد) مع كثافة الفلورانس الأخضر = 1، التعرض = 60ms وشدة الفلورنسية الحمراء = 8، التعرض = 60 مللي ثانية الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: Worm_CP خط أنابيب قياس الفلوري بدقة كما يمكن أن يكون القياس الكمي اليدوي. مقارنة بين القياس الكمي للفلوريسنس للدود البالغ الصغير الثابت والملطخ لمحتوى قطرات الدهون مع صبغة الفلورسنت الخضراء BODIPY، وذلك باستخدام إما خط أنابيب Worm_CP (A) أو القياس اليدوي (B). تم رصد محتوى قطرات الدهون من WT وdbl-1 (nk3) عن طريق تحديد وتلطيخ الحيوانات مع BODIPY، التي تتشابك في الأحماض الدهنية من قطرات الدهون (انظر البروتوكول A). تم إصلاح الحيوانات الشباب الكبار مع 60٪ isopropanol وملطخة مع BODIPY لمدة 1h. وتم تحديد كمية نفس المجموعة من الحيوانات إما باستخدام خط أنابيب Worm_CP (انظر الخطوة 7) أو عن طريق القياس الكمي اليدوي وفقا للإجراءات القياسية¹⁷. (أ)القياس الكمي للفلورس باستخدام خط أنابيب Worm_CP. WT: n = 22 حيوان، متوسط الفلورس= 1.016 (A.U) ± 0.206 SD؛ dbl-1(nk3):n = 25 حيوانات، متوسط الفلوريسين= 0.8714 (A.U) ± 0.126 SD. غير مُجَدّت t-test. (ب) القياس الكمي اليدوي للفلور. WT: n = 22 الحيوانات، متوسط الفلورس = 1.048 ± 0.153 SD؛ dbl-1(nk3):n = 25 الحيوانات، متوسط الفلوريسين = 0.8632 ± 0.109 SD. غير مُجَد t-test. (C, D) مثال تمثيلي أو دودة محاذاة الإخراج لWT(C)و dbl-1(nk3) (D)الحيوانات تقويمها مع خط أنابيب محاذاة دودة. تم التقاط الصور مع هدف 20x على مجهر واسع مقلوب (انظر جدول المواد) مع كثافة الفلورانس الأخضر = 2، التعرض = 60ms. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: مثال على القياس الكمي للفلوريسنس ومحاذاة الديدان الحية من صور الفلوريسنس للدودة الحية التي تحمل المراسل النسخي hsp-70(C12C8.1) p:: GFP بعد الصدمة الحرارية. (A) على الحرارة قصيرة صدمة (30 دقيقة في 34 درجة مئوية)، تم استرداد الديدان الكبار الشباب في درجة حرارة زراعتها (25 درجة مئوية) وشنت ثم صورة 3.5h بعد الصدمة الحرارية. تم تحديد كمية حوالي 30 ديدان في أعقاب الصدمة الحرارية باستخدام خط أنابيب محاذاة الدودة. (أ - ب) أمثلة على الديدان المحاذية التي لم تتعرض لصدمة حرارية. (C-D) أمثلة من الديدان صدمت الحرارة تحمل hsp-70 (C12C8.1) p:: GFP باستخدام محاذاة دودة. (E)يظهر متوسط كثافة GFP (Worm_CP المعلمة: MeanIntensity_Threshold) من WT الشباب والديدان الكبار نمت، دون صدمة الحرارة أو عند التعرض لصدمة الحرارة (34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة). تم التقاط الصور مع هدف 20x على مجهر واسع مقلوب (انظر جدول المواد) مع كثافة الفلورانس الأخضر = 1، التعرض = 60ms؛ لا HS: n = 12، HS: n = 32. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: الموقع في فيجي حيث يمكن العثور على ماكرو محاذاة دودة، بمجرد تركيبها. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: اختيار المجلد الذي يحتوي على جميع الصور التي تم التقاطها بنفس الإعدادات. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: إنشاء 4 مجلدات فرعية في مجلد الإخراج في فيجي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: رسم خط عبر عرض الدودة وإعدادات القناة للمونتاج. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: معاينة الصورة مع الإعدادات التطبيقية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 6: رسم خط على طول المحور الطولي للديدان ذات الأهمية لإدراجها في المونتاج و/أو القياس الكمي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 7: المونتاج من الفيروسات المحددة في مجلد الإخراج، تحت مجلد "محاذاة". الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 8: مسح الصور السابقة من التحليل السابق في محلل ملفات التعريف الخلوية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 9: استيراد بيانات التعريف إلى CellProfiler من المجلد إخراج المتنقل محاذاة بتحديد المجلد الفرعي الإعدادات.csv. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 10: يستخدم خط أنابيب CellProfiler Worm_CP.cpproj صور Lines_ إلى واحد من الديدان المحددة (A) ، وتنتج أقنعة دودة واحدة من الديدان من الفائدة (C). ويقيس خط الأنابيب أيضا كثافة الخلفية (باء). توقعات جميع المعلمات التي تقاس بواسطة خط أنابيب Worm_CP.ccproj التي يتم تصديرها في ملف csv (D). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 11: اختيار ملفات الإخراج في "ExportToSpreadsheet في خط أنابيب Worm_CP.cpproj. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

محاذاة الفيروس المتنقل هي خط أنابيب معالجة الصور القائم على فيجي الذي يولد بسهولة المونتاج من الديدان التي يختارها المستخدم، حيث يتم تقويم الديدان ومحاذيتها للمساعدة في المقارنة البصرية والتصنيف والتمثيل. على الرغم من أن هذه الميزة هي أيضا التي تقدمها بعض الأدوات الموجودة ، لا سيما وحدة WormToolbox في CellProfiler⁷، دودة محاذاة يتطلب القليل نسبيا من تجربة تحليل الصور السابقة : المستخدمين بحاجة فقط لتتبع تلك الديدان التي ترغب في تحديد للمونتاج (والتحليل). على الرغم من أن تتبع الديدان على بيانات الصورة الخام هو عملية سهلة - خاصة عندما يتوفر جهاز كمبيوتر أو قرص يعمل باللمس - ، فمن الأهمية بمكان ، أن يتم رسم الخطوط بشكل صحيح على طول المحور الطولي للدودة. خطوط غير مكتملة، التي تتبع سوى جزء من الدودة، سوف يؤدي إلى الديدان الجزئية في المونتاج (أي، الديدان في عداد المفقودين رؤساء من ينتهي الذيل) وأقنعة التجزئة الجزئية أثناء تحليل CellProfiler. أيضا، إذا خطوط من اثنين من الديدان الفردية عبر، لن تتم معالجة الديدان بشكل صحيح في المونتاج محاذاة دودة وكذلك لتكميم الفلوريسين. لمراقبة الجودة يتم حفظ صورة تراكب من التحديدات الخط على الصورة الأصلية في مجلد البيانات، جنبا إلى جنب مع جدول QC. من هذه الخطوط الإشكالية التي ستؤدي إلى ديدان مجزأة بشكل غير صحيح يمكن بسهولة تحديدها واستبعادها من مونتاج و/ أو تحليل لاحق.

على الرغم من أن المدخلات المباشرة من المجرب في اختيار الديدان ربما يبدو قليلا مضيعة للوقت ، فإنه يقدم ميزة واضحة من سير العمل على الآخرين في التجارب حيث الديدان من مراحل النمو المختلفة موجودة في نفس الصورة : الديدان يمكن اختيارها خلال "خطوة التتبع" ، من خلال تحديد فقط تلك الديدان التي هي في مرحلة النمو الصحيح. بدلاً من ذلك، يمكن تصفية الديدان باستخدام الإخراج من Worm_CP استناداً إما إلى طول خط التتبع، أو منطقة قناع التجزئة، وكلاهما مؤشرات موثوقة لطول/حجم الديدان. يمكن القول إن خوارزميات التعلم الآلي قد تكافح من أجل التعرف على الديدان من مراحل نمو مختلفة ، حيث أن حجمها ومظهرها في صور DIC مختلفان جدًا.

ويمكن استخدام ناتج محاذاة الدودة في القياس الكمي اللاحق لكثافة الفلوريس في الديدان المفردة، إما في فيجي مباشرة، أو في منصات برامج تحليل الصور الأخرى. وقد أثبتنا ذلك من خلال استيراد إخراج Worm-align في خط أنابيب CellProfiler بسيط (Worm_CP)، والذي يسمح بالتكميم الكمي لكثافة الفلورانس متعدد القنوات في تلك الديدان الفردية التي تم اختيارها أثناء تشغيل خط أنابيب محاذاة الدودة. اخترنا هذا النهج بسبب مرونة برنامج CellProfiler: من السهل دمج وحدات إضافية في خط الأنابيب لتحليل ميزات إضافية في الديدان الفردية (على سبيل المثال قياس حجم قطرات الدهون ، أو حبيبات الإجهاد ، النوى ، الميتوكوندريا). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من المحتمل أن تستخدم أقنعة دودة واحدة لتدريب نموذج جديد ل WormToolbox⁷.

المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب هي أنه سريع ويتطلب تركيب دودة بسيطة. هذه الطريقة هي أسرع لأنها لا تتطلب قضاء الوقت في عملية برنامج التعلم ولا تشغيل مجموعات التدريب من خلال خوارزمية الجهاز⁷. وعلاوة على ذلك، يعمل هذا الأسلوب مع إما الديدان الحية أو الثابتة شنت ببساطة على منصات agarose العادية. ليست هناك حاجة لاستخدام غرف microfluidic معقدة، كما وضعت في أساليب أخرى^5،6.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنبوب شفاط Agarose	MeLford Biolaboratories Ltd	MB1200
	Sigma-Aldrich	A5177	لإنشاء ماصة دقيقة للفم (انظر خطوة البروتوكول)
محلول مخزون Beaker
BODIPY 493/593	Invitrogen	D3922	المحضر في DMSO عند 1 مجم / مل
لجهاز طرد مركزي	MSE MISTRAL 1000
قارورة
منزلقة	VWR	631-0120
فلتر 0.2 & م لمرشح حقنة	Sartrius	16534-K	، لإنشاء ماصة دقيقة للفم (انظر خطوة البروتوكول)
الأيزوبروبانول
ليفاميسول هيدروكلوريد	سيجما-ألدريتش	BP212	3mM المحضر عن طريق إذابة الليفاميزول في
منشأة النيتروجين السائل النيتروجين
احتفاظ منخفض 1000 وميكرو ؛ L	Starlab	S1182-1830
كيماويات	الميثانول	20847.307
شرائح المجهر ، MENZEL GLASSER	Thermo Scientific	BS7011 / 2
مجهر	نيكون		Eclipse Ti
فرن الميكروويف	Delongi
M9			المحضر في المختبر وفقا لمعيار 15< / supألواح
		NGM >9 سم	محضرة في المختبر وفقا ل15< / sup>
PBS			المحضرة في المختبر
أنبوب البروتين LoBind 2 مل	Eppendorf	22431102
Triton	SIGMA	T9284-500ML
Ring Caps	SIGMA-ALDRICH	Z611247-250EA	أنابيب زجاجية دقيقة شعرية لإنشاء الفم ماصة دقيقة (انظر خطوة البروتوكول)
موردي المختبرات	الشفافة
		TSR0600200P	6.0 مم × 2.0 مم جدار - لإنشاء ماصة صغيرة للفم (انظر خطوة البروتوكول)
H2O			MilliQ المعقمة في المختبر
10 & micro ؛ L نصائح	Starlab	S1120-3810
200 & micro; L نصائح	Starlab	S1120-8810
1000 & micro ؛ L نصائح	Starlab	S1122-1830
أنبوب الطرد المركزي 15 مل	CORNING	430791
Vecta Shield	VECTOR	94010	وسيط تركيب مضاد للبهتان (H-1000) بدون DAPI