مقالة منهجية

الفحص الفلوري القائم على كيمياء النقر ل Apolipoprotein N-acyltransferase من توصيف الإنزيم إلى الفحص عالي الإنتاجية

2.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61146

⸱

مايو 13, 2020

 ,  , 
1Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France

في هذه المقالة

ملخص

يظهر هنا مقايسة مضان حساسة لمراقبة نشاط البروتين الشحمي N-acyltransferase باستخدام ببتيد ثنائي أسيل جليسريل وألكاين فوسفوليبيدات كركائز مع كيمياء النقر.

الملخص

يتم تعديل البروتينات الدهنية من البكتيريا البروتينية بعد الترجمة بواسطة الأحماض الدهنية المشتقة من الدهون الفوسفاتية الغشائية عن طريق عمل ثلاثة إنزيمات غشائية متكاملة ، مما ينتج عنه بروتينات ثلاثية الأسيلات. تتضمن الخطوة الأولى في مسار تعديل البروتين الدهني نقل مجموعة دياسيل جليسريل من فوسفاتيديل جليسرول إلى البروتين البروتيني ، مما ينتج عنه بروتين بروليبوبروتين ثنائي الغليسيريل. في الخطوة الثانية ، يتم شق ببتيد إشارة البروتين البروتيني ، مكونا بروتين شحمي ، والذي بدوره يتم تعديله بواسطة حمض دهني ثالث مشتق من الفوسفوليبيد. يتم تحفيز هذه الخطوة الأخيرة بواسطة صميم البروتين الشحمي N-acyltransferase (Lnt). يعد مسار تعديل البروتين الدهني ضروريا في معظم البكتيريا البروتينية γ ، مما يجعله هدفا محتملا لتطوير عوامل مضادة للبكتيريا جديدة. الموصوف هنا هو اختبار حساس ل Lnt متوافق مع الفحص عالي الإنتاجية للجزيئات المثبطة الصغيرة. الإنزيم والركائز هي جزيئات مدمجة في الغشاء. لذلك ، فإن تطوير اختبار في المختبر ليس بالأمر السهل. وهذا يشمل تنقية الإنزيم النشط في وجود المنظفات ، وتوافر الألكاين الفوسفوليبيد وركائز الببتيد ثنائي الغليسيريل ، وظروف التفاعل في المذيلات المختلطة. علاوة على ذلك ، من أجل استخدام اختبار النشاط في إعداد فحص عالي الإنتاجية (HTS) ، تفضل القراءة المباشرة لمنتج التفاعل على التفاعلات الأنزيمية المقترنة. في مقايسة الإنزيم الفلورومترية هذه ، يتم تحويل منتج الببتيد ثلاثي الكيلات إلى الفلورسنت من خلال تفاعل كيمياء النقر ويتم اكتشافه في شكل لوحة متعددة الآبار. تنطبق هذه الطريقة على أسيلترانسفيراز الأخرى التي تستخدم ركائز تحتوي على الأحماض الدهنية ، بما في ذلك الدهون الفوسفاتية وأسيل-CoA.

المقدمة

تتميز البروتينات الدهنية البكتيرية بالأحماض الدهنية المرتبطة تساهميا في أمينو تيرميني والتي يتم من خلالها تثبيتها في الأغشية 1,2. الجزء الناضج من البروتين متنوع للغاية في البنية والوظيفة ، مما يفسر دور البروتينات الدهنية في العمليات البيولوجية المختلفة في غلاف الخلية البكتيرية.

يتم تعديل البروتينات الدهنية بواسطة الأحماض الدهنية المشتقة من الفوسفوليبيد بعد إدخالها في الغشاء السيتوبلازمي. تحتوي البروتينات البروليبوبروتينية على شكل مميز ، وهو lipobox ، والذي يحتوي على بقايا سيستين ثابتة تصبح أسيلية وأول حمض أميني في البروتين الناضج. يتم تحفيز الخطوة الأولى من هذا المسار بواسطة البروتين البروليبوبروتين فوسفاتيديل جليسرول: :d iacylglyceryl transferase (Lgt) ، الذي ينقل مجموعة diacylglyceryl من phosphatidylglycerol إلى البروتين البروليبوبروتين عبر رابط ثيوثير بين دياسيل جليسريل والسيستين. إشارة الببتيداز II (Lsp) تشق ببتيد الإشارة من البروتين البروليبوبروتين ثنائي الأسيل غليسيريل ، مما ينتج عنه بروتين شحمي مثبت في الغشاء من خلال مجموعة دياسيل جليسيريل. يتم تحفيز الخطوة الثالثة والأخيرة بواسطة صميم البروتين الشحمي N-acyltransferase (Lnt) ، والذي يضيف حمضا دهنيا من موضع sn-1 من الفوسفوليبيد على صميم البروتين الشحمي ، مما ينتج عنه بروتين دهني ناضج ثلاثي الأضلاع (الشكل 1) 3. تفاعل Lnt هو تفاعل بينج بونج من خطوتين حيث يتم تكوين وسيط إنزيم أسيل ثيوستر مستقر. يتحرر الناتج الثانوي لليسوفوفوسفوليبيد قبل تسيل ركيزة البروتين الشحمي في الخطوة الثانية من التفاعل.

يتم تحديد خصوصية ركيزة الفوسفوليبيد في مقايسة Lnt بناء على التحول الحركي لببتيد N-acyl diacylglyceryl على نسبة عالية من Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. كانت الفوسفوليبيدات ذات مجموعات الرأس القطبية الصغيرة ، المشبعة [sn-1] وغير المشبعة [sn-2] ، ركائز مفضلة 4. مقايسة إزاحة الهلام ليست مناسبة للدراسات الحركية المكثفة للبروتين الشحمي N-acyltransferase ولا ل HTS لتحديد الجزيئات المثبطة. تم استخدام كيمياء النقر باستخدام أحماض الألكين الدهنية بنجاح لدراسة تعديل البروتين الدهني في البكتيريا5 واستقلاب الأحماض الدهنية في حقيقيات النوى6. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن مقايسة في المختبر من رأس palmitoylation لتحديد مثبطات7.

في الطريقة الموضحة هنا ، يتم تحضين Lnt النشط المنقى في المنظفات مع ركائز في مذيلات مختلطة لتشكيل الببتيد ثلاثي الأسيل الألكاين الذي يتم اكتشافه لاحقا بواسطة مطياف التألق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الانزيم والركيزة

  1. تنقية الانزيم
    1. إنتاج وتنقية إنزيم Lnt من الأغشية القابلة للذوبان في المنظفات كما هو موضح سابقا 4,8. باختصار ، حث التعبير عن جين lnt-strep ، وترميز Lnt بعلامة Strep C-terminal ، عند OD600 من 0.6 مع التتراسيكلين اللامائي (200 نانوغرام / مل) عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    2. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 4000 × غرام لمدة 10 دقائق والتخلص من المادة الطافية.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت WA (20 mM Tris-HCl pH 8 ، 150 mM NaCl ، 0.5 mM EDTA) إلى 100 OD600 وحدة لكل مل.
    4. كسر الخلايا عن طريق ممرين من خلال مكبس خلية الضغط الفرنسية عند 10000 رطل / بوصة مربعة.
    5. قم بإزالة الخلايا غير المنقطعة والحطام عن طريق الطرد المركزي بمعدل 13000 × جم لمدة 20 دقيقة. الحفاظ على طافت وتجاهل بيليه.
    6. جهاز طرد مركزي للطافي بسرعة 120000 × جم لمدة 60 دقيقة وجمع الحويصلات الغشائية (حبيبات بنية شفافة اللون). تخلص من المادة الطافية.
    7. إذابة البروتينات الغشائية المتكاملة من الحبيبات الغشائية باستخدام 1٪ (وزن / حجم) n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) في المخزن المؤقت WA لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). أجهزة الطرد المركزي وإزالة المواد غير القابلة للذوبان بمعدل 120000 × جم لمدة 30 دقيقة. استخدم الجزء الطافي للتنقية.
    8. تنقية Lnt-strep على عمود كروماتوغرافيا التقارب (انظر جدول المواد) وعمود ترشيح هلام S400 (انظر جدول المواد) كما هو موضح من قبل Nozeret et al.8.
    9. قم بتخزين الإنزيم المنقى في محلول WA يحتوي على 0.05٪ DDM و 10٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: الإنزيم مستقر لأكثر من 5 سنوات.
  2. تحضير ركائز ألكاين فوسفوليبيد وليجند تحفيز الخلايا الليفية البيوتينية (FSL-1-biotin)
    1. القسمة 100 ميكرولتر من ألكاين-بوب المركب حسب الطلب (1-هيكساديك-15-ينويل-2-أوليويل-سن-جليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين، انظر جدول المواد) قابل للذوبان في الكلوروفورم في أنابيب 1.5 مل.
    2. اخترق الأنابيب بحقنة وتبخر الكلوروفورم في فراغ سريع في RT لمدة 2 ساعة. قم بتخزين عينات الفوسفوليبيد الجافة في -20 درجة مئوية.
    3. قم بإذابة الألكاين-بوب في 0.1٪ Triton X-100 عند 500 ميكرومتر قبل الاستخدام. أضف خطوة صوتنة لمدة 3 دقائق في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية في RT لإذابة الألكاين-بوب إذا لزم الأمر.
    4. إعادة تعليق FSL-1-البيوتين في الماء عند 445 ميكرومتر.
      ملاحظة: يمكن تخزين كلا الحلين في -20 درجة مئوية لمدة شهرين على الأقل.

2. فحص الأنبوب

ملاحظة: في اليوم الأول ، قم بإعداد تفاعل Lnt في أنابيب سعة 1.5 مل (الخطوة 2.1) وقم بتغطية 96 لوحة بئر بالستربتافيدين (الخطوة 2.2).

  1. تحضير خليط الكاشف والتفاعل الأنزيمي
    1. للحصول على اختبار Lnt قياسي ، امزج alkyne-POPE (نهائي 50 ميكرومتر من مخزون 500 ميكرومتر) و FSL-1-biotin (التركيز النهائي 50 ميكرومتر من مخزون 445 ميكرومتر) في مخزن تفاعل Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2 ، 150 mM NaCl ، 0.1٪ Triton X-100 يحتوي على 1٪ BSA) بحجم نهائي يبلغ 18 ميكرولتر في أنابيب 1.5 مل. أداء جميع الشروط في ثلاث نسخ.
    2. قم بتسخين خليط الركيزة (المحضر في الخطوة 2.1.1) لمدة 3 دقائق في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل إضافة إنزيم Lnt (الخطوة 2.1.3).
      ملاحظة: MTSES (الصوديوم (2-سلفوناتو إيثيل) ميثانيثيوسلفونات) ، كاشف خاص بالثيول ، يثبط Lnt8. أضف 10 mM MTSES (محلول مخزون 100 mM في DMSO 100٪) إلى أنابيب التفاعل (الخطوة 2.1.1) لاستخدامها كعينات تحكم سلبية. اضبط حجم المخزن المؤقت لتفاعل Lnt بحيث يكون الحجم الكلي 18 ميكرولتر.
    3. أضف نشطا (1 نانوغرام / ميكرولتر ، الموافق 17.2 نانومتر) أو غير نشط Lnt (C387S) (2 ميكرولتر من مخزون 10 نانوغرام / ميكرولتر في المخزن المؤقت WA الذي يحتوي على 0.05٪ DDM) واخلطه مع الركائز (الخطوة 2.1.2) عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
    4. احتضان التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في خلاط حراري بغطاء ساخن.
  2. طلاء ستربتافيدين من 96 لوحة بئر
    1. تحضير محلول مخزون من الستربتافيدين عند 2 ملغم / مل في H2O.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذا المحلول في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. من محلول المخزون ، قم بإعداد 10 ميكروغرام / مل من الستربتافيدين في الماء كمحلول عملي. أضف 100 ميكرولتر من المحلول إلى كل بئر من لوحة البئر 96. اربط الستربتافيدين بالطبق عن طريق التحضين عند 37 درجة مئوية طوال الليل بدون غطاء لتجفيف الآبار بالهواء.

ملاحظة: في اليوم الثاني ، قم بإجراء كيمياء النقر (الخطوة 2.3) ، واربط خليط تفاعل Lnt بألواح مغلفة بالستربتافيدين (الخطوة 2.4) ، واكتشف التألق وحلل النتائج (الخطوة 2.5).

  1. تفاعل كيمياء النقر
    1. تحضير محاليل مخزون من Azido-FAM (5 mM في DMSO) ، TCEP (Tris (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد ؛ 50 mM محضر في الماء) ، TBTA (Tris [(1-benzyl-1H-1،2،3-triazol-4-yl) methyl] أمين ؛ 2 mM في ثلاثي البيوتانول: DMSO (4: 1)) ، و CuSO4∙5H 2 O (50 mM طازجا في H2O).
    2. في الأنابيب سعة 1.5 مل التي تحتوي على خليط تفاعل Lnt المحضر في الخطوة 2.1.4 ، قم بإجراء كيمياء النقر عن طريق إضافة الكواشف بالترتيب التالي: 0.2 ميكرولتر من المخزون Azido-FAM (التركيز النهائي 50 ميكرومتر) ، 0.4 ميكرولتر من المخزون TCEP (التركيز النهائي 1 mM) ، 0.2 ميكرولتر من المخزون TBTA (التركيز النهائي 0.02 mM).
    3. دوامة الحل لمدة 5 ثوان. ثم أضف 0.4 ميكرولتر من المخزون CuSO4 (التركيز النهائي 1 mM). دوامة مرة أخرى لمدة 5 ثوان. احتضان العينات في الظلام في RT لمدة 1 ساعة.
  2. ربط خليط تفاعل Lnt بألواح مغلفة بالستربتافيدين
    1. اغسل آبار الألواح المطلية بالستربتافيدين بعد الحضانة الليلية من الخطوة 2.2.2 3x مع 200 ميكرولتر من PBS-T1 (PBS يحتوي على 0.05٪ Tween-20).
      ملاحظة: يمكن استخدام ألواح الستربتافيدين على الفور أو تخزينها جافة عند 4 درجات مئوية.
    2. انقل 18 ميكرولتر من خليط كيمياء النقر من الخطوة 2.3.3 إلى بئر في صفيحة 96 بئر مطلية بالستربتافيدين وأضف 100 ميكرولتر من PBS-T1 لربط منتج N-acyl-FSL-1-biotin-FAM بألواح الستربتافيدين.
    3. استخدم البيوتين-فلوريسئين (0.26 ميكرومتر من مخزون 3.1 مللي مول في DMSO) كعنصر تحكم إيجابي لربط الستربتافيدين وقراءات مضانة.
    4. احتضان الألواح في RT لمدة 1 ساعة في الظلام في خلاط حراري ، يهتز عند 300 دورة في الدقيقة.
    5. قم بإجراء خطوات غسيل يدوية لألواح البئر ال 96 باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات على النحو التالي: ست غسلات مع 200 ميكرولتر من PBS-T2 (PBS تحتوي على 1٪ Tween-20) ، وثلاث هبات مع ماصة ، وثلاث غسلات مع 200 ميكرولتر من PBS ، وثلاث هبات مع ماصة.
  3. الكشف عن التألق وتحليله
    1. أضف 200 ميكرولتر من PBS وسجل التألق عند 520 نانومتر في قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية. حفظ النتائج في برنامج جداول البيانات.
      ملاحظة: يستخدم البيوتين-فلوريسئين كعنصر تحكم إيجابي لربط الستربتافيدين والكشف عن التألق عند 520 نانومتر. من المتوقع قراءة قابلة للتكرار من 30,000-40,000 A.U. مع 0.26 ميكرومتر من البيوتين فلوريسين. يتم تحليل جميع العينات في ثلاث نسخ ، بما في ذلك الضوابط.
    2. احسب الانحراف المعياري لكل تفاعل وحساب قيم P للعناصر الضابطة السلبية والعينات الإيجابية باستخدام اختبار t غير المزاوج باستخدام برنامج إحصائي.

3. فحص لوحة متعددة الآبار

ملاحظة: في اليوم الأول ، قم بإعداد تفاعل Lnt في 384 لوحة بئر (الخطوة 3.1) وتغطية 384 لوحة بئر بالستربتافيدين (الخطوة 3.2).

  1. تحضير خليط الكاشف والتفاعل الأنزيمي
    ملاحظة: يتم تقليل كمية الكواشف والإنزيم مقارنة بمقايسة الأنبوب ويتم إجراء تفاعل Lnt مباشرة في 384 لوحة بئر. هذا يسمح باستخدام مواد أقل وتقليل الخطوات التي يمكن أن تكون أكثر آلية.
    1. امزج الركائز على النحو التالي: ألكين-بوب (التركيز النهائي 50 ميكرومتر من مخزون 500 ميكرومتر) و FSL-1-biotin (50 ميكرومتر نهائي من مخزون 500 ميكرومتر) في مخزن تفاعل Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2 ، 150 mM NaCl ، 0.1٪ Triton X-100 يحتوي على 1٪ BSA) بحجم 13.5 ميكرولتر لكل تفاعل لكل بئر في شكل لوحة بئر 384. أداء جميع الشروط في ثلاث نسخ. احسب الكمية الإجمالية للكواشف المطلوبة لعدد التفاعلات التي سيتم إجراؤها (أي 5184 ميكرولتر للوحة بئر واحدة 384).
    2. سونيك خليط الركيزة لمدة 3 دقائق في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية.
    3. حصة 13.5 ميكرولتر من خليط الركيزة لكل بئر في لوحة بئر 384.
      ملاحظة: كعنصر تحكم سلبي ، يمكن إضافة 10 مللي متر من MTSES (محلول مخزون 625 مللي متر في DMSO بنسبة 100٪) لكل بئر. اضبط حجم المخزن المؤقت Lnt (الخطوة 3.1.1) للوصول إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 13.5 ميكرولتر.
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل إضافة إنزيم Lnt (الخطوة 3.1.5).
    5. أضف 0.5 نانوغرام / ميكرولتر (الموافق 8.6 نانومتر) إنزيم Lnt نشط ، أو متغير غير نشط (C387S) (1.5 ميكرولتر من مخزون 5 نانوغرام / ميكرولتر في المخزن المؤقت WA الذي يحتوي على 0.05٪ DDM) في مخزن تفاعل Lnt (50 mM Tris-HCl pH 7.2 ، 150 mM NaCl ، 0.1٪ Triton X-100 ، 1٪ BSA) إلى كل بئر يحتوي على خليط التفاعل من الخطوة 3.1.3. خلط الكواشف عن طريق ماصة لأعلى ولأسفل. إجمالي حجم التفاعل هو 15 ميكرولتر.
    6. ختم اللوحة بورق بلاستيكي لألواح متعددة الآبار.
    7. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في خلاط حراري بغطاء ساخن.
  2. ستربتافيدين طلاء 384 لوحة بئر
    1. استخدم 75 ميكرولتر من الستربتافيدين (10 ميكروغرام / مل في H 2 O) من الخطوة2.2.2 لطلاء الآبار من لوحة بئر 384. دع الستربتافيدين يلتصق بالطبق عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية طوال الليل دون غطاء لتجفيف الآبار بالهواء.

ملاحظة: في اليوم 2 ، قم بإجراء كيمياء النقر (الخطوة 3.3) ، واربط خليط تفاعل Lnt بألواح مغلفة بالستربتافيدين (الخطوة 3.4) ، واكتشف التألق ، وحلل النتائج (الخطوة 3.5).

  1. تفاعل كيمياء النقر
    1. تحضير محاليل مخزون من Azido-FAM (1.2 mM في DMSO) ، TCEP (تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين هيدروكلوريد ؛ 24 مللي مول محضر في H 2 O) ، TBTA (Tris[(1-benzyl-1H-1،2،3-triazol-4-yl) methyl] أمين ؛ 0.48 mM في ثلاثي البيوتانول: DMSO (4: 1)) و CuSO4∙5H 2 O (24 mM طازجا في H2O).
    2. اجمع بين الكواشف الثلاثة لكيمياء النقر: خليط من Azido-FAM (التركيز النهائي 50 ميكرومتر) ، TCEP (1 mM النهائي) ، و TBTA (0.02 mM النهائي) ، كل منها عند 0.75 ميكرولتر في الحجم النهائي 2.25 ميكرولتر لكل بئر. احسب الحجم المطلوب لكل 384 لوحة بئر (أي استخدم 864 ميكرولتر عند استخدام جميع آبار لوحة البئر 384). تخلط بقوة.
    3. أضف 2.25 ميكرولتر من محلول الكاشف لكل بئر مباشرة إلى تفاعل Lnt المكتمل في لوحة البئر 384 من الخطوة 3.1.7.
    4. امزج عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات.
    5. أضف CuSO4 (0.75 ميكرولتر من مخزون 24 مللي مول لتركيز نهائي 1 مللي مول) واخلطه عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات.
    6. احتضان في RT لمدة 1 ساعة في الظلام.
  2. ربط خليط تفاعل Lnt بألواح البئر 384 المطلية بالستربتافيدين
    1. اغسل آبار الألواح المطلية بالستربتافيدين بعد الحضانة الليلية من الخطوة 3.2.1 1x مع 85 ميكرولتر PBS-T1.
    2. نقل 11 ميكرولتر من تفاعل كيمياء النقر من كل بئر من صفيحة الحضانة من الخطوة 3.3.6 إلى الصفيحة المطلية بالستربتافيدين من الخطوة 3.4.1 لربط منتج N-acyl-FSL-1-biotin-FAM بألواح الستربتافيدين .
    3. أضف 64 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS-T1.
    4. قم بتضمين البيوتين فلوريسئين (0.19 ميكرومتر من مخزون 3.1 mM في DMSO) كعنصر تحكم للارتباط بالآبار المغلفة بالستربتافيدين.
    5. احتضان 384 لوحة بئر في RT لمدة 1 ساعة في الظلام في خلاط حراري ، يهتز عند 300 دورة في الدقيقة.
    6. اغسل الألواح باستخدام غسالة الألواح الآلية على النحو التالي: 10 غسلات مع 85 ميكرولتر PBS-T2 ، تهتز الألواح بين الغسالات ؛ 5 يغسل مع 85 ميكرولتر PBS ، تهتز لوحات بين يغسل.
  3. الكشف عن التألق وتحليله
    1. أضف PBS (85 ميكرولتر) وسجل التألق في قارئ الصفيحة الدقيقة الفلورية عند 535 نانومتر.
    2. تحليل البيانات كما هو موضح (الخطوة 2.5.2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في تفاعل Lnt ، يتم نقل الأحماض الدهنية sn-1 من الدهون الفوسفاتية إلى ببتيد ثنائي الغليسيريل ، مما ينتج عنه ببتيد ثلاثي الأسيلناضج 8. تم تصميم مقايسة Lnt في المختبر الموصوفة هنا لاستخدام الدهون الفوسفاتية التي تحتوي على حمض دهني ألكين (ألكين-POPE) و FSL-1-بيوتين كركائز ، مما يؤدي إلى تكوين ألكين-FSL-1-بيوتين. عند تفاعل كيمياء النقر مع azido-FAM ، يجب أن يصبح هذا المنتج موسوما بالفلورسنت ويتم اكتشافه بواسطة قياس الطيف الفلوري (الشكل 2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول اختبار Lnt الموصوف هنا ، بناء على الكشف عن مضان المنتج ثلاثي الأسيل ، حساس وقابل للتكرار. يعد الارتباط المحدد والفعال للبيوتين بالستربتافيدين عنصرا أساسيا في الفحص. يتم أيضا تمييز ركيزة Alkyne-POPE المتبقية بعد الانتهاء من تفاعل Lnt بالفلورسنت باستخدام FAM ولكن يتم إزالتها بكفاءة بعد الارتباط بألواح الستربتافيدين بخطوات غسيل متعددة. علاوة على ذلك ، لا تؤثر إضافة DMSO على نشاط Lnt وليس لها أي تأثير على الفحص. كل من الركيزة والإنزيم محبة للدهون بدرجة عالية وتتطلب ظروف تفاعل في المذيلات المختلطة. التقنيات التي تعتم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر فابريس أغو وأليكس بوشارلات من منصة الفحص الكيميائي والبيولوجي ، مركز الموارد التكنولوجية والبحوث (C2RT) في معهد باستور باريس على الاقتراحات المفيدة حول البروتوكول ، وجميع أعضاء وحدة BGPB على الدعم والمناقشات العلمية ، وسيمون ليجود على القراءة النقدية للمخطوطة. تم تمويل العمل من قبل مبادرات الرعاية العالمية لمعهد كارنو للأمراض المعدية ومعهد كارنو للميكروبات والصحة (15 CARN 0017-01 و 16 CARN 0023-01).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Ä نظام تنقية kta نظامFPLC GE HealthcareNAنقاء: NA
Lnt تنقية
الألكين-بوبوبأفانتي الدهون القطبية900414Pالنقاء: >99٪
Lnt الركيزة
Azido-FAMLumiprobeA4130النقاء: 100٪ (نقي)
انقر فوق كاشف
BioPhotometer PlusEppendorfN / Aنقاء: NA
OD 600 نانومتر
BioTek ELX 405 حدد غسالة الألواحBioTekN & deg ؛ سلسلة 115800 ، n & deg ؛ المواد 405 حددالنقاء: NA
خطوات غسل
البيوتين والفلورسينSigma53608النقاء: & ge ؛ 90٪
التحكم في التألق
كبريتات النحاس (II) خماسي هيدراتSigmaC3036النقاء: & ge ؛ 98٪
انقر فوق الكاشف
DDMAnatraceD310Aنقاء: > 99٪ > +α; < 15٪ α
منظف لتنقية Lnt
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)InvitrogenD12435النقاء: اللامائي
الذوبان انقر فوق الكاشف
الماصة الإلكترونية Voyager 8 قنوات 0.5-12.5 uLINTEGRA4721النقاء: NA
مناولة الكواشف
خلية الضغط الفرنسيةN / AN / Aالنقاء: NA
خلية اضطراب
FSL-1-biotinالمجموعات الدقيقة EMCL7030النقاء: NA
Lnt الركيزة
Greiner Bio-One 384 جيدا قياسية CELLSTAR البوليسترين ميكرولويتGreiner781091النقاء: NA
أسود مع قاع شفاف (قراءة لأعلى أو أسفل)
Greiner Bio-One 96-well لوحة بوليسترين معقمة ، رقائقGreiner655097الجلد: NA
أسود مع قاع شفاف (قراءة لأعلى أو أسفل)
قارئ Microplate Infinite M1000 proTecanN / Aالنقاء: NA
الكشف عن التألق
MTSES (الصوديوم (2-سلفوناتوإيثيل) ميثانيثيوسلفونات)AnatraceS110MTالنقاء: ~ 100٪
مثبط خاص بالثيول
صفائح ختم لاصقة شفافةبصريا Thermo ScientificAB-1170نقاء: NA
احباط لإغلاق لوحة متعددة الآبار
Sephacryl S400 HR 16/60 هلام عمود الترشيحGE HealthcareGE28-9356-04النقاء: NA
Lnt تنقية
StrepTactin Sepharose 50٪IBA التكنولوجيا الحيوية2-1201-010النقاء: NA
Lnt تنقية
ستربتافيدينسيجماS4762-1MGنقاء: & ge ؛ 13 وحدة / ملغ بروتين
ربط البيوتين
TBTA (تريس [(1-بنزيل -1 ساعة -1،2،3-تريازول -4-يل) ميثيل] أمينسيجما678937نقاء: 97٪ < br / > انقر فوق الكاشف
TCEP (تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين هيدروكلوريدسيجما75259نقاء: & ge ؛ 98٪
انقر فوق الكاشف
TECAN Infinite F500TecanN / Aالنقاء: NA
الكشف عن التألق
TECAN Infinite M1000 proTecanN / Aالنقاء: NA
كشف التألق
خلاط حراري CEppendorf5382000015نقاء: NA
غطاء ساخن
Triton X-100Sigma93443: 10٪ في H2O
عازلة تفاعل Lnt
جهاز طرد مركزي فائقBeckman LCN / Aنقاء: NA
تجزئة الخلية
عالية نقاء

المراجع

  1. Buddelmeijer, N. The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why. FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).
  2. Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).
  4. Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).
  5. Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters. Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).
  6. Thiele, C., et al. Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry. ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).
  7. Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation. Science Reports. 7, 41147(2017).
  8. Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). Science Reports. 9 (1), 15978(2019).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  10. Mao, G., et al. Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase. Nature Communication. 7, 10198(2016).
  11. Vogeley, L., et al. Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin. Science. 351 (6275), 876-880 (2016).
  12. Wiktor, M., et al. Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis. Nature Communication. 8, 15952(2017).
  13. Noland, C. L., et al. Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).
  14. Lu, G., et al. Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase. Nature Communication. 8, 15948(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FAM Z prime

مقالات ذات صلة