يقدم هنا بروتوكول للتوضيح الأولي لثقافة خلية CHO باستخدام فاصل صوتي. يمكن استخدام هذا البروتوكول للتوضيح الأولي لثقافات قارورة الاهتزاز أو محاصيل المفاعل الحيوي ولديه التطبيق المحتمل للتوضيح المستمر لمواد نزيف الخلية أثناء عمليات المفاعل الحيوي للتشويش.
مقالة منهجية
التوضيح الأولي لسائل زراعة الخلايا المقطوعة CHO باستخدام فاصل صوتي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التوضيح الأولي هو خطوة أساسية في عملية تصنيع الكتلة الحيوية لإزالة الخلايا الأولية من المنتجات العلاجية داخل سائل زراعة الخلايا المحصود. في حين أن الأساليب التقليدية مثل الطرد المركزي أو الترشيح يتم تنفيذها على نطاق واسع لإزالة الخلايا ، فإن معدات هذه العمليات لها آثار أقدام كبيرة ويمكن أن تنطوي العملية على مخاطر التلوث وتصفية قاذورات. وبالإضافة إلى ذلك، قد لا تكون الأساليب التقليدية مثالية لمخططات المعالجة البيولوجية المستمرة للتوضيح الأولي. وهكذا، تم التحقيق في تطبيق بديل باستخدام الموجات الصوتية (الصوتية) لفصل الخلايا باستمرار عن سائل زراعة الخلايا. يقدم في هذه الدراسة بروتوكول مفصل لاستخدام فاصل الموجات الصوتية على نطاق مقاعد البدلاء (AWS) للفصل الأساسي بين سائل الثقافة الذي يحتوي على جسم مضاد IgG1 أحادي النسيلة من حصاد المفاعل الحيوي لخلايا CHO. يتم تقديم بيانات تمثيلية من AWS وتوضح كيفية تحقيق توضيح فعال للخلية واستعادة المنتج. وأخيرا، تناقش التطبيقات المحتملة ل AWS في المعالجة الحيوية المستمرة. عموما، توفر هذه الدراسة بروتوكولا عمليا وعاما لتنفيذ AWS في التوضيح الأولي لثقافات خلايا CHO وتصف كذلك إمكانات تطبيقها في المعالجة الحيوية المستمرة.
المقدمة
خطوة حاسمة في عملية تصنيع الكتلة الحيوية التي تنطوي على البروتينات العلاجية المفرزة هي إزالة الكتلة الحيوية من سائل زراعة الخلايا المحصودة (HCCF). تقليديا، اعتمدت الأجهزة الحيوية الطرد المركزي تليها الترشيح العمق كطرق التوضيح الأولية في إنتاج الأجسام المضادة أحادية النسيلة1. ومع ذلك، قد يؤدي الطرد المركزي إلى إجهاد القص العالي على الخلايا، مما يؤدي إلى زيادة الحطام الخلوي في HCCF. وهذا يمكن أن يؤدي إلى تصفية قاذورات أثناء الترشيح ويؤدي إلى ملوثات إضافية بعد الترشيح التي يمكن أن تقلل في وقت لاحق كفاءة الكروماتوغرافيا المصب1،2،3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون تخصيص أجهزة الطرد المركزي لعملية معينة مكلفا وقد يتطلب اتصالات إضافية بنظم نظيفة في المكان وتعقيم في المكان قد تكون أيضا عاملا مقيدا للتوسع. استخدام مرشحات العمق يمكن أن تعوض عن القيود المفروضة على الطرد المركزي وأيضا الاستفادة من تكنولوجيا الاستخدام الواحد4. ومع ذلك، يتم استخدام عوامل تصفية العمق بشكل أساسي والتوضيح الثانوي لأنها لا تستطيع تحمل الكثافات عالية زراعة الخلايا5. بدلا من ذلك، تم استخدام أجهزة الترشيح العرضي للتدفق (TFF) للاحتفاظ بالخلايا للتخفيف من إجهاد القص ولكنها قد تواجه تحديات مثل الاستقطاب الغشائي وضعف غلة الحصاد6. 10- إن المسائل المذكورة أعلاه الناشئة عن استخدام الطرد المركزي بالإضافة إلى الترشيح العميق أو TFF تهيئ فرصة لتحسين عملية التوضيح الأولية لقوة تثبيت الطبيعة.
تم تقديم الفصل الصوتي كتكنولوجيا يمكن استخدامها لحصاد البروتينات المفرزة من ثقافات الخلايا مع منتجات البروتين عالية الجودة7،8. يتم تحقيق الفصل الصوتي من خلال انتشار وانعكاس موجات دائمة متعددة الأبعاد تتفاعل مع السوائل المعلقة والجسيمات المحتفظ بها9،10. هذه الجسيمات تجربة ثلاث قوى: سحب السوائل، والجاذبية، والإشعاع الصوتي. عندما تعارض كل من القوى على قدم المساواة مع بعضها البعض، والوصول إلى التوازن، يتم تعليق الجسيمات والمحاصرين داخل الموجات فوق الصوتية الدائمة10. في تعليق ثقافة الخلية ، يتم عقد الخلايا داخل هذه الطائرة عقدة الضغط من الموجات الدائمة ، وتنمو العقدة مع تجمع الخلايا ، وفي نهاية المطاف تقع هذه المجموعات من العقد الخلوية من قوة الجاذبية9. ثم تتم إزالة هذه الخلايا المترسبة من الوسائط، مما يسمح بضخ الوسائط الموضحة لمزيد من المعالجة في المصب. وقد بدأ استخدام الموجات فوق الصوتية كوسيلة فصل لترجمة إلى تطبيقات بيولوجية تتراوح بين فصل جزيئات الدهون وخلايا الدم الحمراء11 إلى الثدييات خلية التروية الثقافة12. مع قدراتها النسبية على خفض التكاليف والعمالة والإجهاد الخلوي من خلال تجنب الطرد المركزي ، والترشيح العمق ، أو TFF ، تقوم وحدات تصنيع الكتلة الحيوية باستكشاف التطبيقات المحتملة لاستخدام الفصل الصوتي.
توفر هذه الدراسة بروتوكولا عاما لتشغيل فاصل موجة صوتية على سطح المقعد (AWS) لتوضيح ثقافة خلايا CHO ، وتقدم بيانات تمثيلية ، وتوضح كيفية تحقيق توضيح فعال للخلية واستعادة المنتج.
البروتوكول
1. إعداد AWS
ملاحظة: تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام غرفة نظائر واحدة. ومع ذلك ، فإن AWS على نطاق مقاعد البدلاء لديها خمسة تحقيقات العكر التي يمكن أن تعمل 4 غرف acoustophoretic في سلسلة إذا لزم الأمر.
- توصيل الكابلات العكر في المنافذ الخاصة بهم المسمى F، 1، 2، 3، 4 (على سبيل المثال، العكر التحقيق 1 في الشكل 1c والمنفذ 1 في الشكل 2a)والكابلات BNC السلطة الغرفة إلى الجزء الخلفي من نظام AWS المسمى 1، 2، 3، 4 (الشكل 2ب).
ملاحظة: لا تربط الطرف الآخر من كابل BNC طاقة الغرفة (الشكل 3c) إلى الجزء الخلفي من غرفة acoustophoretic (الشكل 3D) حتى الخطوة 2.6 عندما يتم تعبئة الغرفة مع السوائل. إذا تم تشغيل قوة الغرفة مع عدم وجود سائل في الغرفة ، فإنه سيتم إتلاف محول بيزو في الغرفة ولم يعد يعمل. - إدراج المجسات العكر في متر العكر والإسكان ميزان الحرارة وتشديد مسامير(الشكل 1C والشكل 3).
- توصيل أنابيب تغذية إلى مدخلات ميناء عكر تغذية (الشكل 4a) عن طريق مضخة تغذية (الشكل 1ب إلى 1C).
- توصيل أنابيب y من إخراج منفذ عكر التغذية (الشكل 4b) إلى منافذ مدخل الغرفة acoustophoretic (الشكل 4c).
- توصيل المرحلة1 أنابيب من ميناء النفايات من غرفة acoustophoretic (الشكل 4D) عن طريق مضخة stage1 إلى وعاء جمع الخلية (الشكل 1د عبر 1e إلى 1f).
- توصيل الأنابيب من منفذ تتخلل الغرفة acoustophoretic (الشكل 4e) إلى مدخلات منفذ probe1 العكر (الشكل 4f).
- توصيل أنابيب الحصاد من خارج منفذ التعكر probe1 (الشكل 4G) إلى وعاء جمع المنتجات (الشكل 1ج إلى 1G).
2. رئيس النظام مع HCCF
ملاحظة: تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام خلايا CHO-K1 المستزرعة في وسيطة محددة كيميائيا (ActiCHO P مع 6 mM L-glutamine) إنتاج نموذج IgG1 الأجسام المضادة أحادية النسيلة VRC0113 وقد تحتاج إلى تعديل لخطوط الخلايا الأخرى والمنتجات. تم الحصول على HCCF المستخدمة في هذا البروتوكول في نهاية 7-8 أيام من ثقافات CHO-K1 من قارورة تهتز أو عملية المفاعل الحيوي.
- قم بتشغيل AWS عن طريق تشغيل مفاتيح الطاقة في الجزء الخلفي والجبهة من AWS.
- قم بتشغيل الكمبيوتر وانقر نقرا مزدوجا فوق رمز المكتب للبرنامج المقترن (راجع جدول المواد). من"قراءات"لوحة، اضغط على"بدء اختبار"زر لبدء تسجيل البيانات (الشكل 5). بمجرد بدء تسجيل البيانات، سيتم تسجيل جميع البيانات التي تم جمعها في جدول بيانات قابل للتصدير حتى يتم إيقاف الاختبار.
- ربط نهاية أنابيب الأعلاف في السفينة HCCF يجري تحريكها.
- بدء ضخ تغذية عن طريق إدخال معدل المضخة على"ضوابط"الشاشة داخل"تغذية مضخة صورة"واضغط على "أدخل" على لوحة المفاتيح. تأكد من أن"مضخة اتجاه السهم أيقونة"(في اتجاه عقارب الساعة أو عكس عقارب الساعة) يتم تحديدها بشكل صحيح في المربع الرمادي إلى يمين صورة مضخة تغذية لضخ HCCF من السفينة في غرفة acoustophoretic. انقر على"مثلث أيقونة"بجانب عبارة"تشغيل"داخل مربع رمادي تحت تغذية مضخة الصورة إلى "بدء" المضخة (الشكل 6a).
ملاحظة: الحد الأقصى لمعدل المضخة هو 10 لتر / ساعة (167 مل / دقيقة) ، ولكن من المستحسن أن معدل التدفق الاسمي ، 60 مل / دقيقة ، يمكن استخدامه لهذه الخطوة لملء الأنابيب والغرفة بسرعة دون المخاطرة بملء الغرفة قبل بدء الفصل. - مراقبة قياسات عكر التغذية من خلال مراقبة"لوحة الحد من النسبة المئوية"(الشكل 5c) أثناء ملء غرفة acoustophoretic. وستظل قيم العكر متسقة أثناء تحميل الغرفة إذا كان ال HCCF يخلط بما فيه الكفاية في سفينة HCCF.
- مرة واحدة السائل هو فوق محول بيزو في الجزء الخلفي من غرفة acoustophoretic، اضغط على"إيقاف"داخل مربع رمادي تحت صورة مضخة تغذية لوقف المضخة. توصيل كابل الطاقة BNC (الشكل 3c) إلى غرفة acoustophoretic (الشكل 3D).
ملاحظة: حجم الانتظار لكل غرفة acoustophoretic حوالي 190 مل.
3. تشغيل AWS
- بمجرد تعبئة غرفة acoustophoretic وتوصيل كابل الطاقة BNC إلى الجزء الخلفي من غرفة acoustophoretic، تغيير معدل مضخة تغذية لمعدل التشغيل المطلوب (الشكل 6a والجدول 1). وينبغي اختبار عدة معدلات مضخة تغذية لتحديد المعلمات التشغيل المثالي لعملية معينة.
- بدوره على السلطة فطيرة stage1 عن طريق انزلاق شريط في وحدة الطاقة إلى 10 واط (الشكل 6D) والضغطعلى "تشغيل"أيقونة على الجانب الأيمن من مربع المرحلة 1 (الشكل 6C). كما اقترح من قبل الشركة المصنعة، استخدم 10 واط، إعداد الطاقة الموصى بها لخلايا CHO. وهذا يولد تردد ثابت من 2 ميغاهرتز للتشغيل. بعد عدة ثوان، ستبدأ الخلايا في التكتل بشكل واضح عند عقد الموجة في غرفة الموجات(الشكل 7أ).
- بمجرد أن تبدأ الخلايا في الاستقرار في الجزء السفلي من غرفة acoustophoretic (الشكل 7b)، بدء مضخة stage1 بمعدل مناسب على أساس كثافة الخلية ومعدل مضخة التغذية (الشكل 6ب). استنادا إلى جدول بيانات التشغيل الأمثل والثابت للشركة المصنعة ، يمكن حساب معدل مضخة stage1 استنادا إلى كتلة الخلية المعبأة ومعدل تدفق التغذية باستخدام المعادلة التالية
- لحساب كتلة الخلية المعبأة، قم بتدبيس مقياس مع أنبوب فارغ سعة 15 مل (أو أنبوب آخر متوافق مع الطرد المركزي). ملء أنبوب مع المواد تغذية وتسجيل الوزن الإجمالي للأنبوب مع تغذية. الطرد المركزي أنبوب لمدة 10 دقيقة في 3700 × ز. يزيل الناتسخ في حاوية منفصلة. قياس وزن الأنبوب مع بيليه الخلية. نسبة كتلة الخلية المعبأة من مواد التغذية = (وزن الأنبوب المفكك / وزن الأنبوب المملوء) × 100٪.
- رصد ملف العكر من التعكر stage1 كما تجاوز من غرفة acoustophoretic يدخل probe1 العكر(الشكل 8).
- ومع استمرار فصل الخلية، ستزيد كفاءة إزالة
الخلية. - بالإضافة إلى ذلك، رصد الفرق في درجة الحرارة بين التغذية و stage1 كما أنها سوف تزيد مع استمرار فصل الخلية(الشكل 9). قد ترتفع درجة الحرارة عند استخدام تغذية كثافة الخلايا الأعلى ولكن يمكن تقليلها بشكل عام عن طريق تغيير معدل تدفق التغذية.
ملاحظة: عند استخدام غرف acoustophoretic متعددة، يمكن للمرء أن يربط الأنابيب من الغرفة acoustophoretic السابقة عن طريق مسابير العكر إلى مدخلات الغرفة acoustophoretic الحالية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء توصيل مرحلة أنابيب من الجزء السفلي من الغرف acoustophoretic عن طريق مضخات المرحلة إلى الأوعية جمع الخلية. يمكن توصيل ما مجموعه أربع غرف acoustophoretic في سلسلة لتحقيق الكفاءة المثلى لإزالة الخلايا إذا لزم الأمر.
4. إنهاء AWS
- عند الهروب، أوقف مضخة التغذية والمرحلة1 بالضغط على إيقاف التشغيل داخل الصندوق الرمادي أسفل مضخة التغذية وصور مضخة stage1، على التوالي، لإيقاف المضخات.
- قم بإيقاف تشغيل الطاقة إلى الغرفة عن طريق الضغط على إيقاف تشغيل على الجانب الأيمن من مربع المرحلة 1 وقطع كابل الطاقة BNC.
- خذ مواد حصاد المنتج التي تم جمعها لمزيد من التوضيح وإجراءات التطهير ، مثل ترشيح العمق وطرق الكروماتوغرافيا. تجاهل مادة حصاد الخلية.
- استنزاف السائل المتبقي في غرفة acoustophoretic عن طريق وضع أنابيب النفايات في وعاء فارغ، وفصل الأنابيب من مدخل غرفة acoustophoretic وتتغلغل في الموانئ والإفراج عن أنابيب النفايات من رأس المضخة.
- إعادة توصيل الأنابيب، ووضع أنابيب النفايات مرة أخرى في رأس المضخة، وتدفق من خلال المياه DI من نهاية أنابيب الأعلاف باستخدام معدل مضخة تغذية من 60 مل / دقيقة ومعدل مضخة stage1 من 60 مل / دقيقة. استمر لمدة 15-20 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
- مضخة 70٪ الكحول isopropyl (IPA) من خلال الأنابيب والغرفة باستخدام مضخة تغذية لمدة 15-20 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
- كرر إجراء التنظيف مع مياه DI لمسح الأنابيب والغرفة باستخدام مضخة التغذية لمدة 15-20 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
- تفكيك الأنابيب من تحقيقات العكر والغرف acoustophoretic وتنظيف المنطقة مع 70٪ IPA.
- تفكيك تحقيقات العكر ونظيفة داخل تحقيقات العكر مع 70٪ IPA. السماح لجميع أجزاء الهواء الجاف ومن ثم إعادة تجميع للاستخدام المقبل.
ملاحظة: يتم تصنيع الغرف acoustophoretic للاستخدام واحد ولكن يمكن إعادة استخدامها إذا تمت معالجتها وتنظيفها بشكل صحيح كما هو موضح في هذا البروتوكول.
النتائج
وكما هو موضح في البروتوكول، استخدمت AWS لتوضيح HCCF بكثافة 12.4 × 106 خلايا/مل، كما هو موضح في الشكل 1. تم تعيين مضخة التغذية إلى 3.5 مل /دقيقة (5 لتر / يوم) ، مما يمثل معدل نزيف الخلية ضمن النطاق المناسب المفترض لثقافة 10-20 L. ومع دخول HCCF إلى غرفة AWS، ظلت قياسات العكر من مسبار عكر التغذية متسقة، حوالي 1000-1100 وحدة حرارية بريطانية، وظلت القياسات من مسبار التعكر probe1 حوالي 40-50 NTU(الشكل 8). باستخدام القياسين، وكفاءة إزالة الخلايا
تم حسابها وبلغ متوسطها 95٪. ووجد أن قياس العكر من 40-50 NTU كان الحد الأدنى من مستوى العكر يمكن تحقيقه، وبالتالي لم يكن من الممكن فصل آخر من غرفة AWS إضافية في سلسلة.
في حين أن AWS يمكن فصل مع كفاءة عالية بمعدلات تدفق أقل، والحفاظ على HCCF لفترة أطول داخل الغرفة تسبب في زيادات في درجة الحرارة، والتي ينبغي أن تكون الاعتبار عند اختيار انخفاض معدلات التدفق. الشكل 9 هو مثال على الفرق في درجة الحرارة من HCCF قبل دخول غرفة acoustophoretic وبعد الفصل الصوتي بمعدل تدفق تغذية من 3.5 مل / دقيقة، والتي أظهرت زيادة >6 درجة مئوية في درجة الحرارة بسبب طول الوقت داخل الغرفة الصوتية.
وثمة اعتبار هام آخر عند تشغيل المحاصيل كثافة الخلايا العالية (أي >20 × 106 خلايا / مل) هو تشبع المسابير العكرة. أصبحت قياسات العكر للمسبار عكر التغذية مشبعة أكثر من 4400 NTU (الشكل 10)، مما قد يؤدي إلى التقليل من شأن في حساب كفاءة إزالة الخلية.
لاختبار تأثير معدلات التغذية المختلفة على توضيح الخلية، تم قياس كفاءة إزالة الخلية بمعدلات تغذية مختلفة. كما هو مبين في الشكل 11، انخفضت كفاءة إزالة الخلايا بشكل كبير من ~ 100٪ إلى 57٪ مع زيادة معدل مضخة التغذية. بشكل عام، أبطأ معدل مضخة تغذية، كلما كان ذلك أفضل توضيح الخلية. ومع ذلك، ينصح بتحسين معدل التغذية لكل تطبيق.
الشكل 1: إعداد AWS. مرة واحدة تم تشغيل مضخات مع البرنامج (أ)، تم توجيه HCCF في عن طريق مضخة تغذية (ب) من خلال تغذية العكر التحقيق (ج) ثم إلى غرفة AWS (د). داخل الغرفة، حاصرت القوى الصوتية الخلايا من التدفق في عقد الأمواج وتسببت في تكتل. تسبب انخفاض الطفو في انخفاض الخلايا من خلال قوة الجاذبية ، وتم إزالة الخلايا من ميناء النفايات في الغرفة acoustophoretic عبر مضخة stage1 (e) إلى زجاجة حصاد الخلية (و) في حين خرجت المواد الموضحة إلى مسبار التعكر probe1 (ج) من خلال منفذ تتخلل الغرفة إلى زجاجة حصاد المنتج (ز). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ظهر نظام AWS. يتم توصيل المجسات العكر والغرف إلى الموانئ الخاصة بهم في الجزء الخلفي من نظام AWS عبر العكر التحقيق إيثرنت (أ) وغرفة السلطة BNC (ب) الكابلات. أيضا، يتم توصيل الكمبيوتر عبر كابل إيثرنت PC (ج). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحقيقات العكر والإسكان. يجب إدخال كل مسبار عكر(أ)بشكل صحيح إلى متر العكر المعني وميزان الحرارة(ب)وتشديده مع البراغي. يجب توصيل كابل BNC طاقة الغرفة(ج)إلى الجزء الخلفي من الغرفة acoustophoretic (د) فقط بعد أن يتم تعبئة محول بيزو في الغرفة مع السوائل. يشار إلى المسابير على النحو التالي: F = عكر التغذية، 1 = تعكر probe1، و 2 و 3 و 4 هي مسابير غير مستخدمة (أو يمكن استخدامها لتسلسل الإجراء). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الصلة بين السكن العكر والغرفة التعكر. يتم توصيل أنابيب الأعلاف إلى مدخلات ميناء عكر الأعلاف (أ) عن طريق مضخة التغذية. يتم توصيل إخراج ميناء عكر التغذية(ب)إلى منافذ مدخل الغرفة acoustophoretic (ج) عن طريق أنابيب y. يتم توصيل أنابيب stage1 من ميناء النفايات في الغرفة acoustophoretic (د) عبر مضخة stage1 إلى وعاء جمع الخلية. يتم توصيل منفذ تتخلل الغرفة acoustophoretic (ه) إلى مدخلات منفذ التعكر probe1 (و). يتم توصيل أنابيب الحصاد من خارج منفذ التعكر probe1 (ز) إلى وعاء جمع المنتجات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: لوحة قراءات في برنامج الفاصل الصوتي. يحتوي البرنامج على لوحتين ،"قراءات"و "ضوابط". ضمن"قراءات"لوحة، يتم رصد العكر ( أ )،ودرجة الحرارة(ب)،والحد من النسبة المئوية(ج). لبدء تسجيل البيانات،"بدء اختبار"زر(د)يحتاج إلى النقر، والتي سوف تغير لون الزر إلى اللون الأخضر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: لوحة التحكم في البرنامج. داخل لوحة"عناصر التحكم"،يمكن تشغيل المضخات أو إيقاف تشغيلها، ويمكن تغيير معدل الضخ للتغذية (أ) والمراحل الأخرى (ب). أيضا، يمكن تشغيل قوة الغرفة على محول بيزو أو إيقاف (ج) وتغييرها مع شريط الشرائح (د). استخدمت التجارب 10 W، لأنه إعداد الطاقة الموصى به لخلايا CHO كما أوصت الشركة المصنعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: غرفة AWS. وبمجرد دخول الخلايا إلى الحجرة، حاصرت القوى الصوتية الخلايا في عقد الأمواج وتسببت في تجمع الخلايا (أ). وازداد حجم هذه المجموعات الخلوية إلى أن فقدت طفوها واستقرت في نهاية المطاف بقوة الجاذبية (ب). بعد ذلك ، تمت إزالة الخلايا المستقرة من ميناء النفايات في الغرفة المتجانسة عبر مضخة stage1 إلى زجاجة حصاد الخلية (ج). خرج المنتج من الغرفة من خلال منفذ تتخلل (د) في حين HCCF شغل باستمرار الغرفة عن طريق منافذ مدخل (ه). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: قياسات العكر ل12 × 106 خلية / مل CHO ثقافة الخلية مع معدل مضخة تغذية من 3.5 مل / دقيقة. كان عكر الأعلاف (الأزرق) حوالي 1000 وحدة حرارية بريطانية ويتخلل الخروج من المرحلة 1 متر العكر (البرتقالي) كان 40-60 NTU. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: قياسات درجة الحرارة ل12 × 106 خلية / مل CHO ثقافة الخلية مع معدل مضخة تغذية من 3.5 مل / دقيقة. درجة حرارة التغذية (الأزرق) كان حوالي 21 درجة مئوية وتخلل الخروج من المرحلة 1 متر العكر (البرتقالي) كان حوالي 27 درجة مئوية.
الشكل 10: مثال قياس التعكر لعينة عالية الكثافة الخلوية. عندما كانت كثافة الخلية >20 × 106 خلايا / مل ، تم تشبع قياس عكر التغذية بالقيمة القصوى 4400 NTU ، مما أدى إلى التقليل من كفاءة إزالة الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: مقارنة كفاءة إزالة الخلية. ومع زيادة معدل التغذية، انخفض فصل الخلية. وبالتالي، ومع زيادة معدل التغذية، انخفضت كفاءة توضيح الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| البارامتر | مواصفات |
| معدل التدفق | 0 – 10 لتر/ ساعة |
| نطاق الضغط | 0 – 2 بار (0 – 30 psi) |
| تغذية درجة حرارة السائل | 0 – 40 درجة مئوية (32 – 104 درجة فهرنهايت) |
| درجة حرارة التشغيل | 0 – 40 درجة مئوية (32 – 104 درجة فهرنهايت) |
الجدول 1: شروط التشغيل. ظروف التشغيل الموصى بها من الشركة المصنعة AWS لمعدل التدفق، ونطاق الضغط، والسوائل تغذية، ودرجة حرارة التشغيل.
المناقشة
وصف هو بروتوكول خطوة بخطوة لتنفيذ AWS على نطاق مقاعد البدلاء في التوضيح الأولي للأجسام المضادة أحادية النسيلة نموذج من HCCF من خط الخلية CHO. وكما هو مبين في النتائج التمثيلية، أدى استخدام AWS في التوضيح الأولي إلى توضيح فعال للخلية واستعادة المنتج. وعلاوة على ذلك، فإن انخفاض مستوى الصيانة والاحتياجات التشغيلية والقدرة على توسيع نطاقها يتيح إمكانية تطبيق أوسع نطاقا في التوضيح الأولي.
الأهم من ذلك، تشير النتائج التمثيلية إلى أن معدل مضخة التغذية أمر بالغ الأهمية لفصل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، بسبب القيود المفروضة على الكشف عن كثافة الخلايا العالية في قياس العكر ، فإن كثافة الخلايا العاملة هي عامل آخر يجب مراعاته عند استخدام نظام AWS. لأن المسبار العكر سوف تكون مشبعة عند تشغيل مواد تغذية كثافة الخلية العالية، قد يكون من الأفضل لحساب كفاءة فصل الخلية عن طريق قياس كثافات الخلية من المواد تغذية وأوضح السائل ثقافة الخلية حاليا. مع قياس دقيق حاليا من التوضيح ، واحدة استراتيجية العملية التي يمكن النظر فيها في حل هذه المشاكل هو استخدام غرف متعددة في سلسلة. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز في المقام الأول على استخدام غرفة واحدة، يمكن لهذا النظام تشغيل ثلاث غرف إضافية لتوضيح تسلسلي للخلايا التي يمكن أن تؤثر على الحد الأدنى من حالة الخلايا ويؤدي إلى استرداد المنتج عالية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تحسين المعلمات الأخرى، مثل الطاقة ل AWS ومعدلات تدفق إزالة الخلايا، لأنواع خلايا محددة أو طريقة التشغيل. بشكل عام، يوصى بتحسين معلمات التشغيل والاستراتيجية باستخدام هذه الاعتبارات قبل تنفيذ AWS.
ومن بين العديد من إمكانات التطبيق، يعد استخدام AWS في المعالجة الحيوية المستمرة واعدا. لأن AWS يمكن أن تحل محل الطرد المركزي والحد بشكل كبير من مساحة سطح المرشح14، فإن استخدام AWS سيمكن من تدفق مستمر من المواد الخالية من الخلايا لعمليات الترشيح والترشيح اللوني اللاحقة التي تتوافق مع الكتلة الحيوية المستمرة. بسبب هذا التوافق وتوافر تقنية التشوه لكثافة الخلايا العالية (على سبيل المثال، >50 × 106 خلايا / مل) ومدة الثقافة الأطول (على سبيل المثال، >14 يوما)، لدى AWS القدرة على تطوير استراتيجية جديدة نزيف الخلايا المستمرة بالإضافة إلى التوضيح الأولي.
في بعض الحالات، تتم إزالة ما يصل إلى 30٪ من البروتين العلاجي المنتج أثناء عملية ثابتة الحالة في الخلية تنزف المادة15،16. وبالإضافة إلى ذلك، لكي تجمع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المزالة مع المادة الموحدة المحصودة، يجب الوفاء بسمات نوعية معينة. عندما لا يتم استيفاء هذه المواصفات، قد تكون النتيجة رفض المواد التي يمكن أن تؤثر على إنتاج المنتج. للتعويض عن فقدان المنتج هذا ، يمكن تنفيذ توضيح مستمر لمواد نزيف الخلية باستخدام AWS في حالة ثابتة أثناء عملية التشوه طويلة الأجل17. هذه الاستراتيجية قد تقلل من فقدان المنتج في المواد تنزف والاستفادة من أكثر من البروتين المنتجة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة الخلايا بعد التوضيح المستمر باستخدام AWS مرة أخرى إلى المفاعل الحيوي إذا رغبت في زيادة كثافة الخلايا وإنتاجيتها. وبالتالي، قد يوفر التوضيح المستمر للمواد نزيف الخلية مع AWS فرصة لزيادة العائد و / أو تقليل مساحة سطح مرشح الثانوية في عملية معينة.
وباختصار، فإن فائدة AWS لا تقتصر على التوضيح الأولي البسيط ولكن قد يكون لها فائدة للتطبيقات في المعالجة الحيوية المستمرة التي قد تحسن معدل التصنيع والمرونة التشغيلية.
الإفصاحات
ليس للمؤلفين أي مصالح مالية في المنتجات الموصوفة في هذه المخطوطة وليس لديهم أي شيء آخر للكشف عنه.
شكر وتقدير
ويود المؤلفان أن يعترفا بنيلو سارة أردن وزاونغ جاو لمراجعتهما البناءة لهذه المخطوطة. كما يود المؤلفون أن يشكروا ليندسي براون على المدخلات الأساسية خلال هذا المشروع. تم توفير التمويل الداخلي الجزئي والدعم لهذا العمل من خلال برنامج المسار الحرج CDER (CA # 1-13) وبرنامج علوم التصنيع والابتكار في CDER (Berilla-CoE-19-49). وقد تم دعم هذا المشروع جزئيا من خلال برنامج التدريب الداخلي / المشاركة في البحوث في مكتب منتجات التكنولوجيا الحيوية، إدارة الغذاء والدواء الأمريكية، الذي يديره معهد أوك ريدج للعلوم والتعليم من خلال اتفاق مشترك بين الوكالات بين وزارة الطاقة الأميركية وهيئة الغذاء والدواء الأمريكية.
يعكس هذا المنشور آراء المؤلف ولا ينبغي تفسيره على أنه يمثل وجهات نظر أو سياسات إدارة الأغذية والعقاقير.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مجموعة الغرفة الصوتية Acoustophorectic | Pall | CAS-AC-K1 مجموعة الغرفة | |
| ActiCHO P | GE | SH31025.01 | مسحوق متوسط |
| AWS | Pall | CAS-SYS (60500101-SP) | |
| برنامج فاصل الإيقاع الصوتي | Pall | Cadence Acoustic Separator Interface الإصدار 1.0.4 | |
| خلايا CHO-K1 | VRC | VRC01 | |
| الكمبيوتر | Dell | Latitude 3470 | Windows 7 ، نظام التشغيل 64 بت |
| Isopropanol (70٪) | LabChem | LC157605 | 20L أعدد 70٪ IPA |
| L-glutamine | Corning | 25-005-CV | 200 mM حل الأسهم |
| Masterflex L / S 14 أنابيب | Cole-Parmer | 96400-14 | سيليكون معالجة بالبيروكسيد ، أنبوب 25 |
| قدما Masterflex L / S 16 | Cole-Parmer | 96400-16 | أنابيب سيليكون معالجة بالبيروكسيد ، مجموعة أنابيب 25 قدما |
| مجموعة أنابيب Pall | CAS-FP-K1 | ||
| مسبار التعكر | Pall | CAS-TS-S1 (60500106) |
المراجع
- Roush, D. J., Lu, Y. Advances in primary recovery: centrifugation and membrane technology. Biotechnology Progress. 24 (3), 488-495 (2008).
- Hutchinson, N., Bingham, N., Murrell, N., Farid, S., Hoare, M. Shear stress analysis of mammalian cell suspensions for prediction of industrial centrifugation and its verification. Biotechnology and Bioengineering. 95 (3), 483-491 (2006).
- Shukla, A. A., Suda, E. Harvest and recovery of monoclonal antibodies: cell removal and clarification. Second ed. 2, Wiley. 55-79 (2017).
- Felo, M., Christensen, B., Higgins, J. Process cost and facility considerations in the selection of primary cell culture clarification technology. Biotechnology Progress. 29 (5), 1239-1245 (2013).
- Singh, N., et al. Clarification of recombinant proteins from high cell density mammalian cell culture systems using new improved depth filters. Biotechnology and Bioengineering. 110 (7), 1964-1972 (2013).
- Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs. 2 (5), 480-499 (2010).
- Ryll, T., et al. Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality. Biotechnology and Bioengineering. 69 (4), 440-449 (2000).
- Gorenflo, V. M., Smith, L., Dedinsky, B., Persson, B., Piret, J. M. Scale-up and optimization of an acoustic filter for 200 L/day perfusion of a CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 80 (4), 438-444 (2002).
- Chitale, K., Lipkens, B., Presz, W., Desjardins, O. Understanding the fluid dynamics associated with macro scale ultrasonic separtors. 169th Meeting of the Acoustical Society in America. , (2015).
- Dionne, J., McCarthy, B., Ross-Johnsrud, B., Masi, L., Lipkens, B. Large volume flow rate acoustophoretic phase separator for oil water emulsion splitting. The Journal of the Acoustical Society of America. 133 (5), 3237(2013).
- Dutra, B., et al. A Novel Macroscale Acoustic Device for Blood Filtration. Journal of Medical Device. 12 (1), 0110081-0110087 (2018).
- Lipkens, B. E. M., Ross-Johnsrud, B., Presz, W. M., Chitale, K., Kennedy, T. J., Winiarski, L. Acoustic perfusion devices. US patent. , 9738866 (2017).
- Wu, X., et al. Rational design of envelope identifies broadly neutralizing human monoclonal antibodies to HIV-1. Science. 329 (5993), 856-861 (2010).
- Shirgaonkar, I. Z., Lanthier, S., Kamen, A. Acoustic cell filter: a proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures. Biotechnology Advances. 22 (6), 433-444 (2004).
- Wolf, M. K. F., et al. Improved Performance in Mammalian Cell Perfusion Cultures by Growth Inhibition. Biotechnology Journal. 14 (2), 1700722(2019).
- Lin, H., Leighty, R. W., Godfrey, S., Wang, S. B. Principles and approach to developing mammalian cell culture media for high cell density perfusion process leveraging established fed-batch media. Biotechnology Progress. 33 (4), 891-901 (2017).
- Emily, B., et al. Primary clarification of very high cell density cell culture harvest by enhanced cell settling. BioProcess International. 8, 32-39 (2010).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
