الطولية في التصوير فيفو و الكم من تطعيم جزيرة البنكرياس الإنسان والخلايا المضيفة المساهمة في غرفة العين الأمامية

ملخص

والهدف من هذا البروتوكول هو رصد مستمر لديناميات عملية صيد الجزر البنكرياسية البشرية والبلدان المضيفة المساهمة مقابل الخلايا المانحة. ويتم ذلك عن طريق زرع الجزر البشرية في الغرفة الأمامية للعين (ACE) من NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-المتلقي الماوس تليها تكرار 2-فوتون التصوير.

الملخص

تصوير خلايا بيتا هو خطوة رئيسية نحو فهم زرع جزيرة. على الرغم من أن منصات التصوير المختلفة لتسجيل بيولوجيا خلايا بيتا قد تم تطويرها واستخدامها في الجسم الحي، إلا أنها محدودة من حيث السماح بدقة الخلية الواحدة والتسجيلات الطولية المستمرة. بسبب شفافية القرنية ، فإن الغرفة الأمامية للعين (ACE) في الفئران مناسبة تمامًا لدراسة بيولوجيا خلايا البنكرياس في البنكرياس البشري والفأر. هنا هو وصف لكيفية هذا النهج يمكن استخدامها لأداء التسجيلات الطولية المستمرة من التطعيم وإعادة الزرع من الطعوم الجزيرة البشرية الفردية. يتم إدخال الطعوم الجزرية البشرية في ACE، وذلك باستخدام NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-الفئران كمستلمين. وهذا يسمح للتحقيق في توسيع الخلايا المتلقية مقابل المانحة ومساهمة الخلايا المتلقية في تعزيز تغليف الأوعية الدموية من الكسب غير المشروع. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد نهج خطوة بخطوة لتحليل الصور وتحديد كمية حجم جزيرة أو الأوعية الدموية مجزأة وكبسولات جزيرة تشكيل الخلايا المتلقية.

المقدمة

يصف مرض السكري مجموعة من الأمراض الأيضية التي تتميز بمستويات مرتفعة من جلوكوز الدم كنتاج غير كافٍ للأنسولين من فقدان أو خلل في خلايا بيتا في البنكرياس، وغالبًا ما تكون مصحوبةً بمقاومة الأنسولين. النوع 1 (T1D) وداء السكري من النوع 2 (T2D) هي الأمراض المعقدة التي الخلل التدريجي للخلايا بيتا يسبب تطور المرض. يتم تعجيل T1D من قبل هجوم المناعة الذاتية على خلايا بيتا، في حين يعتبر T2D أن تكون مدفوعة بعوامل التمثيل الغذائي، وإن كان مع أدلة متزايدة من التهاب النظامية منخفضة الدرجة¹. زرع الجزر البشرية المانحة، وخاصة لمرضى T1D، ويوفر إمكانية لتوفير السيطرة الفسيولوجية نسبة السكر في الدم. ومع ذلك، فإن نقص المتبرعين بالأنسجة وضعف زراعة الجزر منعا من زراعة الجزر لتصبح خيارا علاجيا سائدة. يتم فقدان نسبة كبيرة من الكسب غير المشروع في جزيرة وظيفية في فترة ما بعد الزراعة مباشرة (24-48 ساعة) بسبب نقص الأكسجة، والتهابات، والبيئة المضيفة المناعية^2،3. لتقييم كفاءة أساليب التدخل لتحسين بقاء الجزر، من الضروري الرصد المستمر لعمليات الزرع هذه.

في تقنيات الجسم الحي لتصوير وتتبع مصير الجزر البنكرياسية البشرية المزروعة بعد زرع لا يزال تحديا لأبحاث السكري^4,5. حتى الآن، تقنيات التصوير غير الباضع، بما في ذلك التصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية (PET)، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، أو الموجات فوق الصوتية (الولايات المتحدة) تظهر إمكانية القياس الكمي والتقييم الوظيفي الجزر المزروعة في الظروف التجريبية⁵. بيد أنه نظرا لصغر حجم الجزر، فإن القياسات الكمية التي تُقاس بتلك الطرائق لا تكفي. الغرفة الأمامية للعين (ACE) كموقع زرع للمراقبة هو حل التصوير غير الباضع الواعدة التي تقدم دقة مكانية أعلى بشكل فعال والرصد المتكرر على مدى فترات زمنية طويلة⁶. وقد تم استغلال هذه الطريقة بنجاح لدراسة علم الأحياء جزيرة الماوس (استعرضت في يانغ وآخرون^7)،المناعة الذاتية الاستجابات^{المناعية 8}، وكذلك الجزرة البشرية تطعيم^9،10.

هنا يتم الجمع بين طريقة زرع ACE مع نهج التصوير 2-فوتون للتحقيق في ديناميات عملية engraftment جزر البنكرياس الإنسان عن طريق التسجيلات المستمرة والمكررة على الطعوم الجزيرة الفردية لمدة تصل إلى 10 أشهر بعد زرع. خصائص التصوير متعددة الصور من أعماق التصوير أكبر وخفض حجم التصوير الكلي وتلف الصورة التغلب على قيود التصوير من المجهر^{confocal 11}. وينطوي القياس الكمي للتصوير الفلوري على عدة مراحل، بما في ذلك إعداد عينة الجزر، وزرع الجزر، وحيازة الصور، وتصفية الصور لإزالة ضوضاء الجزر أو خلفيتها، والتجزئة، والتكديس الكمي، وتحليل البيانات. الخطوة الأكثر تحديا عادة تقسيم أو تقسيم صورة إلى أجزاء أو مناطق متعددة. ويمكن أن ينطوي ذلك على فصل الإشارة عن الضوضاء في الخلفية، أو تجميع المناطق من voxels على أساس أوجه التشابه في اللون أو الشكل للكشف عن وتسمية voxels من حجم 3D الذي يمثل الأوعية الدموية جزيرة، على سبيل المثال. بمجرد تقسيمها، إحصاءات مثل أحجام وحدة تخزين الكائن عادةً مباشرة لاستخراج. توفير طريقة لتكميم واستخراج بيانات التصوير، مثل تجزئة وتصور البيانات. ويولى اهتمام خاص لإزالة الفلورا في الجزر البشرية والتمييز بين الأوعية الدموية في جزيرة وكبسولات الجزر تشكيل الخلايا المتلقية.

البروتوكول

ووافقت اللجنة الإقليمية للأخلاقيات في لوند، السويد، على الدراسة وفقاً لقانون الاستعراض الأخلاقي للبحوث التي تشمل البشر. أجريت التجارب على الحيوانات في توافق صارم مع أخلاقيات التجارب الحيوانية السويدية ووافقت عليها لجان الأخلاقيات في مالمو ولوند. 6 إلى 8 أسابيع من العمر إيماءة المناعة. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/- (NOD. روزا -الطماطم. Rag2^-/-تم استخدام الفئران المتلقية كمستلمين لزرع الجزر البشرية¹⁰.

1- إعداد جزيرة جزيرة زرع

1. الجزر البشرية ثقافة في CMRL 1066 تكملها 10 MM HEPES، 2 M L-الجلوتامين، 50 ميكروغرام/مل جينتامايسين، 0.25 ميكروغرام/مل اسيسون، 20 ميكروغرام/مل سيبروكسلوكساسين، 10 mM نيكوتيناميد (NIC)، و 10٪ مصل الإنسان المعطل للحرارة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ ورطوبة الهواء حتى زرع، كما هو موضح سابقا¹².
   ملاحظة: يجب أن تكون الجزر خالية من الأنسجة الواثقة ولا تلمس بعضها البعض في الثقافة. تظهر أنسجة الإكروكرين شفافة.
2. في يوم زرع، نقل وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على الجزر إلى طبق بيتري جديد باستخدام تجميع أنبوب الpirator متصلة الشعرية الزجاجية المسحوبة.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدم ماصة 200 ميكرولتر. يساعد تلوين الجزء الخلفي من طبق بيتري على جعل الجزر أكثر سهولة يمكن تمييزها تحت المجهر الاستريو.
3. باستخدام مجهر ستيريو، واختيار ~ 20-40 الجزر في زرع ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل. ملء أنبوب إلى الأعلى مع وسائل الإعلام الثقافة من الحاضنة.
4. قم بختم الأنابيب باستخدام فيلم البارافين وتخزينها على الجليد حتى الزراعة. إعداد مبلغ مناسب لعدد عمليات الزرع التي أجريت.
5. بدلاً من ذلك، تأكد من توفر حاضنة CO₂ في غرفة الجراحة للحفاظ على الجزر في الثقافة واختيارها قبل كل عملية زرع مباشرة.

2. إعداد معدات زرع وطاولة الجراحة

ملاحظة: يجب أن تكون جميع الأدوات الجراحية autoclaved، وطاولة الجراحة والأدوات تطهيرها مع 70٪ الكحول.

1. قم بتوصيل حامل رأس مجسم إلى التخدير عن طريق قناع الأنف وتشغيل وسادة التدفئة.
2. ربط حقنة هاملتون الغازية إلى أنابيب البولي إيثيلين وقنية العين نهاية حادة.
   ملاحظة: من المستحسن لملء كافة الأجزاء مع برنامج تلفزيوني قبل التجميع. تحقق من فقاعات الهواء المحاصرين وإزالة إذا كان موجودا.
3. إرفاق حقنة هاملتون بإحكام إلى الجدول (الشكل 1a) أو قاعدة منقولة (الشكل 1e) وإرفاق الأنابيب إلى المجهر الاستريو ، مع القنية المعلقة (أي موقف الانتظار).
   ملاحظة: استخدم الشريط الجراحي، لأنه من السهل إزالته وإعادة ربطه.
4. إعداد حقنة 1 مل متصلة بإبرة 30 G مليئة بمحلول البوبرينورفين 0.1 ملغم/كغ.
5. إعداد حقنة مع برنامج تلفزيوني عقيم. بدلا من ذلك، استخدمي ماصة.
6. يُترك جانبًا قفصًا نظيفًا للاستيقاظ مع مصباح تدفئة.

3. التخدير وتحديد المواقع من الفئران المتلقية لعملية جراحية

ملاحظة: تم تربية جميع الحيوانات وصيانتها في بيئة خالية من مسببات الأمراض في مرافق الحيوانات في جامعة لوند.

1. تخدير الماوس في غرفة مليئة 40٪ O₂/60٪ N₂/ 3٪ isoflurane ونقل الماوس تخدير إلى منصة حامل الرأس على وسادة التدفئة الدافئة (الشكل 1a). تحقق من عدم وجود ردود فعل دواسة.
   ملاحظة: التخدير الأيزوفلوران هو الطريقة المفضلة للتخدير للشفاء السريع بعد الجراحة. يجب أن تكون غرفة المجهر تهوية بشكل صحيح لاستخدام ايزوفلوران.
2. ضع خطم الماوس في قناع التخدير المتصل بـ 40% O₂/60% N₂/0.9%-1.5% جهاز تخدير الأيزوفلوران. استخدام الإبهام والاصبع لرفع الرأس حتى قليلا وربطه باستخدام القطع المعدنية على الجانبين. تأكد من أن سماعات الأذن تصلح الرأس مباشرةً أسفل الأذنين. حقن 0.1 ملغ / كغ buprenorphine حل تحت الجلد على الجزء الخلفي من الماوس.
   ملاحظة: يتم استخدام البوبرينورفين كمستد.
3. إمالة الرأس بحيث تكون العين التي سيتم إجراء عملية جراحية عليها تواجه صعوداً وتكون قريبة من الباحث.
4. تراجع بلطف جفون العين ليتم زرعها باستخدام ملقط حادة، البوب العين، وإصلاح فضفاضة مع زوج من الملاقط. تأكد من أن يتم تغطية نصائح من ملاقط مع أنبوب البوليثين تعلق على منصة حامل الرأس(الشكل 1a، إدراج).
5. دائما إبقاء العينين الرطب عن طريق تطبيق قطرة من برنامج تلفزيوني عقيم على العين.
6. نقل الجزر البشرية من أنبوب مختوم 1.5 مل (القسم 1) إلى طبق بيتري مع برنامج تلفزيوني معقمة والتأكد من أن الجزر قريبة من بعضها البعض لتقليل كمية وسائل الإعلام ثقافة الخلية المنقولة (الشكل 1c).
7. التقاط ~ 20-30 الجزر في قنية العين متصلة عن طريق أنابيب البوليثين إلى حقنة هاملتون.
   ملاحظة: تناول أقل قدر ممكن من السوائل مع الجزر.
8. شنق الأنابيب رأسا على عقب وإرفاق إلى المجهر ستيريو(الشكل 1d). الشريط الأنابيب بعناية للسماح الجزر بالوعة إلى نهاية الأنبوب نحو القنية.

4. إجراء الزرع

ملاحظة: تم وصف هذه الطريقة مسبقاً لزراعة الجزر الماوس^6. يتم تقديم إجراء معدل قليلاً هنا.

1. قرصة منصات على الساقين الخلفي للتأكد من أن الماوس هو نائم.
2. تشديد ملقط تقييد العين دون تعطيل تدفق الدم وتطبيق قطرة من برنامج تلفزيوني عقيم على العين.
3. باستخدام إبرة 25 G كمشرط، مشط الحواف إلى الأعلى، تخترق بعناية فقط نصف الطرف في القرنية وتجعل شقًا واحدًا من شقًا اتّميًا. جعل ثقب في زاوية أعلى؛ وسوف ختم ثقب بسهولة أكبر بعد عملية الزرع (الشكل 1F).
4. رفع بعناية حتى القرنية مع كانية محملة مسبقا مع الجزر وطبق ببطء الجزر في العين. تجنب إدخال القنية في الغرفة الأمامية لمنع تلف القزحية ، ولكن بدلاً من ذلك ادفع بعناية ضد فتحة القرنية (الشكل 1g).  تراجع ببطء القنية من ACE.
   ملاحظة: الهدف للحصول على حجم حقن من 3-8 μL. إذا كان حجم كبير جدا، فإنه يعرض العين لضغط العين عالية دون داع، ويمكن أن يؤدي إلى ارتجاع الجزر حقن من الغرفة الأمامية.
5. عندما تواجه صعوبات مع إدخال الجزر بسبب زيادة الضغط في غرفة العين، تكبير موقع شق عن طريق تعزيز شق جانبي الموقع والجزر reapply.
   ملاحظة: في بعض الأحيان، يمكن استخدام فقاعات الهواء المقدمة كأصحاب مساحة.
6. تطبيق جل العين على العين، وتخفيف ملقط العين التقييد وترك الماوس على isoflurane في نفس الموقف لمدة 8-10 دقيقة للسماح تعيين الجزر.
7. اخلع الملبابات التي تحمل الجفن وارجع الجفن إلى وضعه الطبيعي.
8. إزالة الماوس من حامل الرأس ونقله إلى قفص الاستيقاظ.
9. عندما يكون الماوس مستيقظا وتتحرك، ونقلها مرة أخرى إلى القفص الأصلي والاحتفاظ بها في السكن الحيواني حتى المسح الضوئي (ينصح على الأقل 5 أيام).

5. التصوير من الجزر البشرية المزروعة عن طريق 2-فوتون المجهرية

ملاحظة: يوصى بأخذ صور عامة للعين باستخدام مجهر مجسم(الشكل 2a–c) بعد 4-5 أيام من الزرع قبل التصوير بـ 2 فوتون لتوطين الجزر ذات الأهمية. تجنب تقييد العين بإحكام شديد في هذا الوقت المبكر بعد الزرع. استخدام التصوير 2-فوتون 6-7 أيام بعد الزراعة.

1. بدء تشغيل برنامج الحصول على الصور (راجع جدول المواد). في"ليزر"القائمة تفعيل ماي تاي ليزر (السلطة "ON") وفي"ضوء المسار"القائمة تعيين الطول الموجي إلى 900 نانومتر وتطبيق الحد الأدنى من قوة الليزر انتقال بدءا من 5٪ - 10٪ قوة الليزر (استخدام المتزلجون).
   ملاحظة: أثناء المسح الضوئي، قم بضبط طاقة الليزر حسب الحاجة.
2. تعيين القنوات الخضراء والبرتقالية والأحمر. جمع الضوء الانبعاثات في وقت واحد على ثلاثة كاشفات غير مُفرَض (NDD) باستخدام مرآة 11000(LBF 760) ومعلومات عن مرشح الانبعاثات على النحو التالي: Red/Angiosense 680, 690-730 نانومتر; الأخضر / الفلوروس، 500-550 نانومتر؛ والبرتقال / الطماطم، 565-610nm (الشكل 2d).
3. ضع مسرح حامل الرأس على مرحلة المجهر الآلية وربط قناع الغاز بمواني أنابيب آلة التخدير والأنابيب المتصلة بنظام التهوية. تشغيل لوحة التدفئة.
4. تخدير الماوس المتلقي، ونقل إلى منصة حامل الرأس، وكبح العين للتصوير، وإدارة حل البوبرينورفين كما هو موضح أعلاه (الخطوات 3.1-3.5).
5. ضبط أبخرة ايزوفلوران حسب الحاجة. يشير معدل التنفس من ~ 55-65 أنفاس في الدقيقة (bpm) إلى التخدير الأمثل. إذا كان التخدير عميقًا جدًا ، فسيكون المعدل < 50 bpm مع التنفس أو اللهاث؛ إذا كان خفيف جدا، فإن معدل يكون > 70 bpm مع التنفس سطحي. مراقبة الفئران بعناية أثناء التخدير عن طريق الفحص البصري كل 15 دقيقة.
   ملاحظة: التخدير يختلف من الماوس إلى الفأرة، بين سلالات الماوس، وكما الوقت تحت التخدير تقدم^13.
6. إدارة ما يكفي من هلام العين على العين كسائل الغمر بين القرنية والعدسة، مما يسمح لها لتتراكم ببطء (الشكل 2 و، إدراج). تجنب فقاعات الهواء.
   ملاحظة: يوصى بالإضاءة الجانبية مع مصباح خرطوم معدني مرن لضبط التركيز وتوطين الطعوم الجزيرة.
7. لتصور الأوعية الدموية، وإدارة 100 ميكرولتر من عامل التصوير (على سبيل المثال، Angiosense 680) عن طريق الوريد في الوريد الذيل باستخدام حقنة الأنسولين المتاح 30 G.
8. في "وضع الاكتساب" ضبط حجم الإطار إلى 512 × 512 وسرعة المسح الضوئي.
   ملاحظة: إن عمليات المسح البطئ (أي زيادة وقت الإسهاب) سوف تحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
9. في"القنوات"القائمة ضبط كسب ماجستير لكل PMT في فولت لتضخيم إشارة حتى ينظر إلى صورة على الشاشة في وضع المسح الحي. كلما ارتفعت هذه القيمة، كلما أصبح الكاشف أكثر حساسية للإشارة والضوضاء.
   ملاحظة: يفضل أن تبقى القيم بين 500-800 V.
10. في "Z - المكدس" القائمة تحديد بداية ونهاية z - المكدس عن طريق نقل التركيز يدويا إلى الجزء العلوي من الكسب غير المشروع في جزيرة. حفظ الموقف عن طريق تحديد"تعيين أولا". الانتقال إلى آخر مستوى أسفل التي يمكن أن تركز في الكسب غير المشروع جزيرة وحفظ الموقف عن طريق تحديد"تعيين الأخير". استخدام حجم خطوة ض 2 μm.
11. جمع كومة الصورة النهائية عن طريق النقر على "بدء التجربة" علامة التبويب وحفظ ك 8 بت CZI (أي ، كارل زييس الشكل) الملف.

6. تصوير الجزر البشرية المزروعة عن طريق المجهر confocal

ملاحظة: يمكن تقييم الحجم الكلي، المورفولوجيا، ولدونة الجزر المزروعة من خلال مراقبة إشارة التشتت في الجسم الحي في مسح منفصل (أي مسار منفصل) عن طريق الكشف عن ضوء¹⁰بالليزر.

1. إخراج تقسيم شعاع الرئيسي (أي، مرشح LBF) وفي"ضوء المسار"الحوار إعداد مسار منفصل للتصوير confocal. اختيار الليزر الأرجون مع الطول الموجي من 633 نانومتر والكشف في نفس الطول الموجي مثل ضوء الليزر. يتم الحصول على رصات Z بحجم خطوة 2-3 ميكرومتر للإشارة الضوئية المُتَرَسَّة.
2. تعديل إعدادات المكدس z للتأكد من تسجيل جزيرة بأكملها (راجع الخطوة 5.10).
3. الحصول على كومة الصورة وحفظ كملف CZI 8 بت.

7. تحليل الصور

ملاحظة: البرامج التجارية (انظر جدول المواد)تم استخدامها لهذه الخطوة.

1. إزالة الفلوروس التلقائي جزيرة (الشكل 3b)
   1. في "معالجة الصورة" اختيار علامة التبويب " القناةالحسابية" ونوع "ch1-ch2". وهذا يخلق قناة جديدة 4 (ch 4); إعادة تسمية باسم"Vasculature".
      ملاحظة: يتم طرح قناة Green/Autofluorescence من قناة Red/Angiosense.
   2. كرر الخطوة السابقة واكتب"ch3-ch2"لإنشاء قناة جديدة (Ch 5); إعادة تسمية باسم "الطماطم (جميع)".
      ملاحظة: يتم طرح قناة Green/Autofluscence من قناة Orange/Tomato.
2. تعريف قناع الجزر بواسطة الرسم اليدوي (الشكل 3c)
   1. إنشاء سطح جديد (رمز أزرق) وفي المعالج اختيار"تحرير يدويا". الحفاظ على المؤشر في "حدد" وضع وفي عرض 3D unclick "وحدة التخزين" (تحت المشهد)لتصور المقاطع.
   2. للحصول على تمييز أسهل على حدود الجزر، قم بتنشيط جميع القنوات، بما في ذلك ch 1-ch 3.
      ملاحظة: قناة أورانج/طماطم مفيدة لتحديد حدود الجزر بواسطة إشارة كبسولة الطماطم. بدلا من ذلك، زيادة كثافة القناة لاستخدام متعددة القنوات جزيرة الفلورة التلقائية وإشارة خلفية كاشفة كتوجيه.
   3. في "رسم" علامة التبويب اختيار "كفاف" وانقر فوق "رسم" لبدء رسم ملامح حول حدود جزيرة بدءًا من موضع الشريحة 1.
   4. الانتقال إلى موضع شريحة جديدة وتكرار رسم ملامح. الانتهاء مع الشريحة الأخيرة على الجزء العلوي من جزيرة ونهاية عن طريق النقر على "إنشاء سطح" علامة التبويب. عادة ما يكفي لرسم ملامح كل شريحة^10.
3. تجزئة "جزيرة الأوعية الدموية" و "الطماطم جزيرة" الفلورس باستخدام قناع جزيرة(الشكل 3d).
   1. اختيار المحدد سابقا "قناع جزيرة" الكائن ، انتقل إلى علامة التبويب التحرير ( رمز قلمرصاص) ، وانقر على "قناع كل" علامة التبويب ، الذي يفتح نافذة جديدة.
   2. اختيار قناة المسمى سابقا "Vasculature" (CH 4) في قائمة اختيار قناة القائمة المنسدلة وتفعيل الخيارات "قناة مكررة قبل تطبيق قناع", " ثابت داخل /خارج", وتعيين voxels خارج السطح إلى "0.000", مما يخلق قناة جديدة; إعادة تسمية باسم "جزيرة الأوعية الدموية"(ch 6).
   3. كرر الخطوات 7.3.1 و 7.3.2 واختر القناة التي تم إنشاؤها مسبقاً"الطماطم (الكل)"(ch 5) في القائمة المنسدلة لاختيار القناة لإنشاء قناة جديدة؛ إعادة تسمية باسم "طماطم جزيرة" (ch 7).
4. عرض السطح من الأوعية الدموية جزيرة(الشكل 3e)
   1. إنشاء سطح جديد في "المشهد" القائمة وفي المعالج اختيار "إنشاء تلقائي".
   2. تعيين قناة المصدر إلى إنشاء سابق"جزيرة vasculature"(ch 6) واختيار الطرح الخلفية. ويمكن تعديل التقدير التلقائي للعتبة إذا لزم الأمر. مقارنة مع قناة الفلوريسنس المستجيبة (على سبيل المثال، عن طريق مزج داخل/خارج علامة التبويب السطحي المنشأة حديثًا). تابع في المعالج.
   3. اختياريا، استخدم المرشحات. على سبيل المثال، اختر"مستوى الصوت"ثم قم بضبط عامل التصفية (الأصفر) في النافذة، والذي يمكنه إزالة الكائنات السطحية المحددة. إنهاء المعالج وتسمية الكائن السطحي الجديد"جزيرة الأوعية الدموية".
5. تجزئة "جزيرة الطماطم الأوعية الدموية" إشارة الفلورانس ( الشكل3f)
   1. في الكائن السطحي"أوعية جزيرة جزيرة" الذي تم إنشاؤه سابقًا، انتقل إلى علامة التحرير وانقر على علامة التبويب"قناع الكل"،الذي يفتح نافذة جديدة.
   2. اختيار قناة المسمى سابقا "الطماطم جزيرة" (CH 7) في اختيار قناة القائمة المنسدلة وتعيين voxels خارج السطح إلى "10.000", الذي يخلق قناة جديدة; إعادة تسمية باسم "جزيرة الطماطم vasculature" (ch 8).
6. تجزئة "كبسولة الطماطم" إشارة الفلورسنس (الشكل 3g)
   1. اختيار "القناة الحسابية" في "معالجة الصورة" علامة التبويب ونوع "ch7 -ch8" ، إنشاء قناة جديدة ؛ إعادة تسمية باسم "كبسولة الطماطم" (ch 9).
      ملاحظة: يتم طرح "جزيرةالطماطم vasculature"إشارة الفلوريسنس من مجموع "الطماطم جزيرة" إشارة الفلور.
7. عرض السطح من "جزيرة الطماطم vasculature" و "كبسولة الطماطم" (الشكل 3h)
   1. اتبع الخطوة 7.4، وفي المعالج اختيار القنوات المصدر "جزيرة الطماطم vasculature" (Ch 8) أو "كبسولة الطماطم" (ch 9) لإنشاء كائنات سطحية جديدة وفقا لذلك.
8. سطح تقديم من سطح جزيرة مجموع (الشكل 3i)
   1. افتح ملف backscatter جزيرة ثم إنشاء سطح جديد.
   2. في المعالج، اختر"إنشاء تلقائي"وحدد"منطقة الاهتمام".
      ملاحظة:"منطقة الاهتمام"يستخدم لفصل إشارات الجزر المتعددة وتحديد عمق الجزر التي سيتم تحليلها (على سبيل المثال، أعلى 75 ميكرومتر).
   3. في "كثافة المطلقة" ضبط عتبة إذا لزم الأمر. يمكن النقر على الكائن السطحي أو إيقاف تشغيله للتحقق من شدة القناة المقابلة. أغلق المعالج.
9. القياس الكمي (الشكل 3j)
   1. حدد كائن سطحي تم إنشاؤه في"المشهد"القائمة والذهاب إلى "إحصائيات" علامة التبويب .
   2. لاسترداد بيانات وحدة التخزين التفصيلية في الكائن السطحي المحدد اختر " علامة التبويبالمفصلةوحدد "قيم محددة" و "Volume" من القائمة المنسدلة. لاسترداد قيمة حجم إجمالي للكائن السطحي المحدد، انتقل إلى " علامة التبويبالتفصيليةواختر "متوسط القيم".

النتائج

تم زرع الجزر البشرية غير المسماة في ACE من NOD الإناث البالغ من العمر 8 أسابيع. (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^tm4-Rag2^-/-(NOD. روزا- الطماطم. Rag2^−/−)فئران المتلقي. لمنع رفض الأنسجة البشرية ، تم اختيار الفئران Rag2 الضربة القاضية المناعية كمستلمين. في هذه الفئران المعدلة وراثيا، أعربت جميع الخلايا والأنسجة عن بروتين الفلورية الطماطم المستهدفة بالغشاء (mT) الذي يسمح بتحديد واضح للمتلقي والأنسجة المانحة. التصوير المتكرر لطعوم الجزر بواسطة المجهر عالي الدقة 2...

المناقشة

يتم تقديم طريقة لدراسة عملية تطعيم خلية البنكرياس في البنكرياس البشري من خلال مراقبة مشاركة الأنسجة المتلقية والمتبرعة. بعد عملية جراحية طفيفة التوغل زرع الجزر البشرية في الغرفة الأمامية من العين الماوس المناعي، والماوس يتعافى بسرعة في غضون دقائق بعد الجراحة. يتم تنفيذ الإجراء على عين واحدة. عموما، من 5-7 أيام بعد الزرع فصاعدا يتم شفاء القرنية بما فيه الكفاية لأداء التصوير داخل الرحم.

في هذا البروتوكول، ونوعية الطعوم الجزر البشرية أمر بالغ الأهمية. يمكن أن تختلف جودة الجزر البشرية وبالتالي نتي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
8323001 تستخدم آلة التخدير ، على سبيل المثال وحدة التخدير U-400	Agnthos		للتخدير الأيزوفلوران أثناء الجراحة
وغرفة تحريض التصوير 1.4 لتر	Agnthos	8329002	الاتصال عبر الأنابيب بمفتاح توجيه الغاز U-400
	Agnthos	8433005	الاتصال عبر الأنابيب ب U-400
AngioSense 680 EX	Percin Elmer	NEV10054EX	عامل تصوير للحقن ، يستخدم لتصوير الأوعية الدموية في الطعوم الجزرية البشرية
تجميعات أنابيب الشفاط	Sigma	A5177-5EA	تتصل بماصات شعرية مسحوبة لالتقاط الجزر اليدوية
بوبرينورفين (Temgesic) 0.3 مجم / مل	Schering-Plough Europ & eacute ؛	64022	سائل ، لتخفيف الآلام
الماصات الشعرية	VWR	321242C	المستخدمة مع مجموعات أنابيب الشفاط
Dextran-Texas Red (TR) ، 70kDa	Invitrogen	D1830	عامل تصوير للحقن
قنية العين ، نهاية حادة ، 25 G	BVI Visitec / BD	BD585107	مصنوعة حسب الطلب من خط خط Hydrode المدبب [Blumenthal] ، الأبعاد: 0.5 × 22 مم (25 جم × 7/8 بوصة) (45؟) ، طرف مدبب إلى 30 جم ( 0.3 مم)
جل العين	Novartis		Viscotears ، يحتوي على حقنة كاربومير 2 مجم / جم
هاميلتون 0.5 مل ، موديل 1750 TPLT	هاميلتون	81242	محقنة محكمة الغلق من نوع المكبس لحقن الجزيرة
<حامل رأس قوي>
رأس محول عقد	Narishige	SG-4N-S	مجمعة على قناع غاز صفيحة معدنية
	Narishige	GM-4-S-UST-2
Solid Universal Joint	Narishige	UST-2	مجمعة على لوحة
معدنية مصنوعة حسب الطلب لتجميع
- Dumont # 5 ،	Agnthos	مستقيم 0207-5TI-PS أو 0208-5-PS	متصل ب UST-2 (حسب الطلب)
وسادة تسخين ، مسجلة			على المنصة التجسيمية
<قوي > وسائط ثقافة الجزر البشرية< / قوي>
-CMRL 1066	ICN Biomedicals		وسائط زراعة الخلايا للجزر البشرية
- HEPES	GIBCO
	GIBCO
	GIBCO BRL-Fungizone
	GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin	باير الرعاية الصحية
	سيجما
برنامج تحليل الصور	Bitplane		Imaris 9
برنامج مسح الصور	Zeiss		ZEN 2010
الأشعة تحت الحمراء	VWR		يستخدم 1010364937 للحفاظ على دفء في قفص الاستيقاظ
Isoflurane Isoflo	Abott سائل الاسكندنافية / أبوتيك		، لإبرة التخدير
25 جم (0.5 × 16 مم) ، 10442204 برتقالي	BD		يستخدم كأطباق بتري مشرط
، 90 مم	VWR	391-0440
<قوي >2-فوتون / مجهر متحد البؤر< / قوي>
-LSM7 MP مجهر مستقيم	Zeiss-Ti
: تسونامي	ليزر الياقوتألطيف الفيزياء ، ماي تاي
عدسة غمس الماء لمسافات طويلة 20x / NA1.0
/ 40m (Angiosense 680)	Chroma
/ 65m-2p (TR)	Chroma
/ 50 (GFP)
/ 75 (طماطم) شعاع	Chroma
الرئيسي الفاصل T680lpxxr	Chroma	T680lpxxr	مرآة ثنائية اللون لنقل 690 نانومتر وما فوق وتعكس 440 إلى 650 نانومتر بحجم 25.5 × 36 × 1 مم
أنابيب البوليثين (معرف 0.38 مم ، 1.09 مم OD)	سميثس الطبية دانمارك	800/100/120	للتواصل مع حقنة هاميلتون وقنية العين
مجهر مجسم	نيكون		موديل SMZ645 ، لقطف الجزر
< قوي > مجهر مجسم (فلورتسن) < / قوي>			لتصوير الكسب غير المشروع
Multizoom	نيكون		مجال واسع ومسافات
طويلة-AZ Plan Apo 1x	Nikon-AZ
Plan Apo 4x	Nikon-AZ-FL
Epiflourescence مع مصباح C-LHGFI	HG نيكون
دليل جديد Intensilight	Nikon
- يحتوي Epi-FL Filter Block TEXAS RED	Nikon		على EX540-580 و DM595 و BA600-660-Epi-FL
Filter Block G-2A	Nikon		(EX510-560 و DM575 و BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A	Nikon		(EX450-490 و DM505 و BA520)
-DS-Fi1 كاميرا رقمية ملونة (5 ميجابكسل)	نيكون
1 مل ، أومنتيكس	براون	9161406V	لحقن البوبرينورفين ، يستخدم مع إبرة 27 جرام
شريط جراحي	3M