Method Article

قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous

DOI:

10.3791/61237

⸱

May 22nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Colorado Denver School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لقياس بسرعة وشبه متزامنة التفاعلات مستقبلات رابطة في trans في نظام خلية غير متغايرة باستخدام المجهر الفلورية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات البروتينية في الواجهات الخلوية تملي العديد من النتائج البيولوجية التي تتراوح بين تطوير الأنسجة وتطور السرطان إلى تشكيل المشبك العصبي والصيانة. العديد من هذه التفاعلات الأساسية تحدث في مغايرة وعادة ما يتم الناجمة عن التفاعلات غير المتغايرة أو المثلية بين الخلايا التي تعبر عن أزواج الربط الراسية الغشاء. توضيح كيف الطفرات المرض ذات الصلة تعطيل هذه التفاعلات البروتين الأساسية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في عدد لا يحصى من حقول بيولوجيا الخلايا. العديد من البروتين البروتين التفاعل المقايسة لا عادة توضيح بين رابطة الدول المستقلة والتفاعلات عبر, مما قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير مدى الربط الذي يحدث في الجسم الحي وينطوي على تنقية كثيفة العمالة من البروتين و / أو معدات الرصد المتخصصة. هنا، نقدم بروتوكول بسيط الأمثل الذي يسمح لمراقبة وكمية التفاعلات عبر فقط دون الحاجة إلى تنقية البروتين طويلة أو المعدات المتخصصة. يتضمن فحص تجميع خلايا HEK خلط مجموعتين مستقلتين من خلايا HEK، يعبر كل منهما عن أربطة مزدوجة مُلزمة بالغشاء. بعد فترة حضانة قصيرة، يتم تصوير العينات ويتم تحديد المجاميع الناتجة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات متشابك تسهيلها من قبل جزيئات التصاق متشابك هي الأساس لتطوير وتنظيم ومواصفات وصيانة وظيفة من نقاط الاشتباك العصبي وتوليد الشبكات العصبية. ويتزايد بسرعة تحديد جزيئات التصاق الخلايا المتحولة؛ وبالتالي، من المهم بشكل أساسي تحديد الشركاء الملزمين وفهم كيفية تفاعل جزيئات الالتصاق الجديدة هذه مع بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك، حددت تسلسل الجينوم الطفرات في العديد من هذه الجزيئات التصاق التي ترتبط عادة إلى العديد من الاضطرابات العصبية النمائية، العصبية والنفسية،والإدمان 1. الطفرات في الجينات التي رمز لجزيئات التصاق الخلايا متشابك قد تغير بشكل ضار التفاعلات عبر وقد تسهم في التعديلات فيزيائية المرضية في تشكيل المشبك أو الصيانة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية ثقافة وtransfection

  1. جعل وسائط الخلية HEK مع DMEM، 1x (تعديل دولبيككو من المتوسط النسر) تكملها مع 4.5 ز / ل الجلوكوز، L-الجلوتامين والصوديوم بيروفات و 10٪ FBS. مرشح معقمة.
  2. يحدد مسبقاً الأحرف اللينة والمستقبلات المناسبة لتشايس التجميع.
    ملاحظة: Neurexin3α SS4+/ - وأحد اليغانات المعروفة، LRRTM2، تم استخدامه في هذه الدراسة. وأعرب عن اليغاندس والمستقبلات من الفائدة من cDNAs في pcDNA3.1. تم استخدام تجميع جيبسون لإدراج Neurexin3α فيpcDNA3.12. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGGCGCATCCCACCATGAGCCTCTCTCACCTCACCCACTC/
    GAGCGGCCGCCACTGCTGCTGCTGGGGGGGGGGACCTTACACATAATAATACTCCTTCCTT.
  3. إعداد خلايا HEK293T.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طفرة A687T يزيد Neurexin3α SS4- ملزمة LRRTM27
للتحقيق في كيفية تأثر التفاعلات بين الخلايا من اثنين من البروتينات متشابك المعروفة من خلال إدخال طفرة نقطة وجدت في المريض مع الإعاقة الفكرية والصرع، استخدمنا أعلاه هيك خلية تجميع المقايسة(الشكل 1). وقد تم نقل الخلايا وفقا للقسم 1 وأعدت للتصوير وفقا للقسمين 1 و 2 من البروتوكول. تم تصوير الخلايا عند خط الأساس حيث لم يتم ملاحظة أي تجميع كما هو متوقع (غير مبين). وتم تحليل الصور التي تم الحصول عليها في 60 دقيقة كما هو ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشريح البروتين البروتينية التفاعلات التي تحدث في عبر خلال التصاق الخلية يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية الكامنة في العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك تشكيل وظيفة وصيانة نقاط الاشتباك العصبي أثناء النضج وإعادة عرض. الآثار المترتبة على التفاعلات من خلية إلى خلية توسيع نطاقها وراء علم الأعصاب ولها أدوار أوسع نطاقا في نقل الإشارات، وهجرة الخلايا وتطوير الأنسجة14. يمكن الانحرافات في التصاق الخلية تعطيل العمليات الخلوية حتمية لوظيفة الخلية السليمة ويمكن الكامنة تحت مجموعة متنوعة من الإلتكول.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المنح من المعهد الوطني للصحة العقلية (R00MH103531 و R01MH116901 إلى J.A.) ، ومنحة تدريب ما قبل الدكتوراه من المعهد الوطني للطب العام (T32GM007635 إلى S.R.) ، وزمالات ليدا هيل جيليام للدراسة المتقدمة (GT11021 إلى S.R.). نشكر الدكتور كيفن وولفري على المساعدة في المجهر، والدكتور ك أولريش باير لاستخدام مجهره النيففلورسنت، وتوماس سودهوف (جامعة ستانفورد) لLRRTM2 بلاسميد.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 مل أنابيب دقيقة يمكن التخلص منها مع أغطية المفاجئةVWR89000-028حضانة السكان المختلطين من خلايا HEK
1000 مل Rapid & [مدش] ؛ وحدة تصفية التدفق ، 0.2 um aPES غشاءThermo Fisher567-0020تعقيم وسائط HEK
15 مل أنابيب الطرد المركزي SpectraTubeWard ' s Science470224-998حصاد خلايا HEK
6 ألواح زراعة الأنسجة المعقمةVWR100062-892زراعة خلايا HEK
كلوريد الكالسيومSigma223506-500Gتعداء فوسفات الكالسيوم ، إعادة تعليق خلية HEK
أجهزة الطرد المركزي - Sorvall Legend RTKendro منتجات المختبر75004377حصاد خلايا HEK
حاضنةخلايا CO2Thermo ScientificHERACELL 150iحضانة خلايا HEK أثناء النمو
DMEM ، 1x (تعديل Dulbecco لوسط النسر) مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و L-glutamine وبيروفات الصوديومCorning10-013-CVصيانة خلايا HEK
Dulbecco s الفوسفات المخزن الملحي PBS (1X)Gibco14190-144تمرير / حصاد خلية HEK
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكSigmaED-500Gحصاد خلايا HEK
قوارير ثقافة فالكون ذات التهوية ، 75 سم < sup>2< / sup> منطقة النموCorning9381M26زراعة خلايا HEK
مصل الأبقار الجنينيSigma17L184صيانة
HEK293T خلاياATCCنظام نموذج
ImageJNIHV: 2.0.0-rc-69 / 1.52pتحليل الصور
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومSigmaM9272-500GHEK إعادة تعليق خلية
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائيفيشر الكواشف الحيويةBP332-500تعداء فوسفات الكالسيوم
التربسين 0.25٪ (1X) الحلGE Healthcare Life العلومSH30042.01خلايا HEK
حضانة أنبوب دوارلمجموعات مختلطة من خلايا HEK
شرائح مجهر فائق الوضوح. وايت فروستيد ، إيجابي تهمةدينفيل العلمية.الحصولصورة M1021
مجهر واسع المجالZeissAxio Vert 200Mالحصول على صورة
جيدا خلايا HEK مرور على

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  2. Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
  3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcellular InteractionsProtein AggregationHEK Cell AggregationTrans Adhesion AssayFluorescence ImagingCell CountingEDTA TreatmentCentrifugation ProtocolGFP mCherry LabelingAdhesion Molecule Screening

Related Articles