هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لقياس بسرعة وشبه متزامنة التفاعلات مستقبلات رابطة في trans في نظام خلية غير متغايرة باستخدام المجهر الفلورية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التفاعلات البروتينية في الواجهات الخلوية تملي العديد من النتائج البيولوجية التي تتراوح بين تطوير الأنسجة وتطور السرطان إلى تشكيل المشبك العصبي والصيانة. العديد من هذه التفاعلات الأساسية تحدث في مغايرة وعادة ما يتم الناجمة عن التفاعلات غير المتغايرة أو المثلية بين الخلايا التي تعبر عن أزواج الربط الراسية الغشاء. توضيح كيف الطفرات المرض ذات الصلة تعطيل هذه التفاعلات البروتين الأساسية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في عدد لا يحصى من حقول بيولوجيا الخلايا. العديد من البروتين البروتين التفاعل المقايسة لا عادة توضيح بين رابطة الدول المستقلة والتفاعلات عبر, مما قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير مدى الربط الذي يحدث في الجسم الحي وينطوي على تنقية كثيفة العمالة من البروتين و / أو معدات الرصد المتخصصة. هنا، نقدم بروتوكول بسيط الأمثل الذي يسمح لمراقبة وكمية التفاعلات عبر فقط دون الحاجة إلى تنقية البروتين طويلة أو المعدات المتخصصة. يتضمن فحص تجميع خلايا HEK خلط مجموعتين مستقلتين من خلايا HEK، يعبر كل منهما عن أربطة مزدوجة مُلزمة بالغشاء. بعد فترة حضانة قصيرة، يتم تصوير العينات ويتم تحديد المجاميع الناتجة.
المقدمة
التفاعلات متشابك تسهيلها من قبل جزيئات التصاق متشابك هي الأساس لتطوير وتنظيم ومواصفات وصيانة وظيفة من نقاط الاشتباك العصبي وتوليد الشبكات العصبية. ويتزايد بسرعة تحديد جزيئات التصاق الخلايا المتحولة؛ وبالتالي، من المهم بشكل أساسي تحديد الشركاء الملزمين وفهم كيفية تفاعل جزيئات الالتصاق الجديدة هذه مع بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك، حددت تسلسل الجينوم الطفرات في العديد من هذه الجزيئات التصاق التي ترتبط عادة إلى العديد من الاضطرابات العصبية النمائية، العصبية والنفسية،والإدمان 1. الطفرات في الجينات التي رمز لجزيئات التصاق الخلايا متشابك قد تغير بشكل ضار التفاعلات عبر وقد تسهم في التعديلات فيزيائية المرضية في تشكيل المشبك أو الصيانة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خلية ثقافة وtransfection
- جعل وسائط الخلية HEK مع DMEM، 1x (تعديل دولبيككو من المتوسط النسر) تكملها مع 4.5 ز / ل الجلوكوز، L-الجلوتامين والصوديوم بيروفات و 10٪ FBS. مرشح معقمة.
- يحدد مسبقاً الأحرف اللينة والمستقبلات المناسبة لتشايس التجميع.
ملاحظة: Neurexin3α SS4+/ - وأحد اليغانات المعروفة، LRRTM2، تم استخدامه في هذه الدراسة. وأعرب عن اليغاندس والمستقبلات من الفائدة من cDNAs في pcDNA3.1. تم استخدام تجميع جيبسون لإدراج Neurexin3α فيpcDNA3.12. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGGCGCATCCCACCATGAGCCTCTCTCACCTCACCCACTC/
GAGCGGCCGCCACTGCTGCTGCTGGGGGGGGGGACCTTACACATAATAATACTCCTTCCTT. - إعداد خلايا HEK293T.<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
طفرة A687T يزيد Neurexin3α SS4- ملزمة LRRTM27
للتحقيق في كيفية تأثر التفاعلات بين الخلايا من اثنين من البروتينات متشابك المعروفة من خلال إدخال طفرة نقطة وجدت في المريض مع الإعاقة الفكرية والصرع، استخدمنا أعلاه هيك خلية تجميع المقايسة(الشكل 1). وقد تم نقل الخلايا وفقا للقسم 1 وأعدت للتصوير وفقا للقسمين 1 و 2 من البروتوكول. تم تصوير الخلايا عند خط الأساس حيث لم يتم ملاحظة أي تجميع كما هو متوقع (غير مبين). وتم تحليل الصور التي تم الحصول عليها في 60 دقيقة كما هو ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تشريح البروتين البروتينية التفاعلات التي تحدث في عبر خلال التصاق الخلية يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية الكامنة في العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك تشكيل وظيفة وصيانة نقاط الاشتباك العصبي أثناء النضج وإعادة عرض. الآثار المترتبة على التفاعلات من خلية إلى خلية توسيع نطاقها وراء علم الأعصاب ولها أدوار أوسع نطاقا في نقل الإشارات، وهجرة الخلايا وتطوير الأنسجة14. يمكن الانحرافات في التصاق الخلية تعطيل العمليات الخلوية حتمية لوظيفة الخلية السليمة ويمكن الكامنة تحت مجموعة متنوعة من الإلتكول.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المنح من المعهد الوطني للصحة العقلية (R00MH103531 و R01MH116901 إلى J.A.) ، ومنحة تدريب ما قبل الدكتوراه من المعهد الوطني للطب العام (T32GM007635 إلى S.R.) ، وزمالات ليدا هيل جيليام للدراسة المتقدمة (GT11021 إلى S.R.). نشكر الدكتور كيفن وولفري على المساعدة في المجهر، والدكتور ك أولريش باير لاستخدام مجهره النيففلورسنت، وتوماس سودهوف (جامعة ستانفورد) لLRRTM2 بلاسميد.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل أنابيب دقيقة يمكن التخلص منها مع أغطية المفاجئة | VWR | 89000-028 | حضانة السكان المختلطين من خلايا HEK |
| 1000 مل Rapid & [مدش] ؛ وحدة تصفية التدفق ، 0.2 um aPES غشاء | Thermo Fisher | 567-0020 | تعقيم وسائط HEK |
| 15 مل أنابيب الطرد المركزي SpectraTube | Ward ' s Science | 470224-998 | حصاد خلايا HEK |
| 6 ألواح زراعة الأنسجة المعقمة | VWR | 100062-892 | زراعة خلايا HEK |
| كلوريد الكالسيوم | Sigma | 223506-500G | تعداء فوسفات الكالسيوم ، إعادة تعليق خلية HEK |
| أجهزة الطرد المركزي - Sorvall Legend RT | Kendro منتجات المختبر | 75004377 | حصاد خلايا HEK |
| حاضنة | خلايا CO2Thermo Scientific | HERACELL 150i | حضانة خلايا HEK أثناء النمو |
| DMEM ، 1x (تعديل Dulbecco لوسط النسر) مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و L-glutamine وبيروفات الصوديوم | Corning | 10-013-CV | صيانة خلايا HEK |
| Dulbecco s الفوسفات المخزن الملحي PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | تمرير / حصاد خلية HEK |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك | Sigma | ED-500G | حصاد خلايا HEK |
| قوارير ثقافة فالكون ذات التهوية ، 75 سم < sup>2< / sup> منطقة النمو | Corning | 9381M26 | زراعة خلايا HEK |
| مصل الأبقار الجنيني | Sigma | 17L184 | صيانة |
| HEK293T خلايا | ATCC | نظام نموذج | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69 / 1.52p | تحليل الصور |
| سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم | Sigma | M9272-500G | HEK إعادة تعليق خلية |
| فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائي | فيشر الكواشف الحيوية | BP332-500 | تعداء فوسفات الكالسيوم |
| التربسين 0.25٪ (1X) الحل | GE Healthcare Life العلوم | SH30042.01 | خلايا HEK |
| حضانة أنبوب دوار | لمجموعات مختلطة من خلايا HEK | ||
| شرائح مجهر فائق الوضوح. وايت فروستيد ، إيجابي تهمة | دينفيل العلمية. | الحصول | صورة M1021 |
| مجهر واسع المجال | Zeiss | Axio Vert 200M | الحصول على صورة |
المراجع
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
- ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
