Method Article

قياس التفاعلات عبر الخلية من خلال تجميع البروتين في نظام الخلايا heterologous

DOI:

10.3791/61237

⸱

May 22nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Colorado Denver School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لقياس بسرعة وشبه متزامنة التفاعلات مستقبلات رابطة في trans في نظام خلية غير متغايرة باستخدام المجهر الفلورية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات البروتينية في الواجهات الخلوية تملي العديد من النتائج البيولوجية التي تتراوح بين تطوير الأنسجة وتطور السرطان إلى تشكيل المشبك العصبي والصيانة. العديد من هذه التفاعلات الأساسية تحدث في مغايرة وعادة ما يتم الناجمة عن التفاعلات غير المتغايرة أو المثلية بين الخلايا التي تعبر عن أزواج الربط الراسية الغشاء. توضيح كيف الطفرات المرض ذات الصلة تعطيل هذه التفاعلات البروتين الأساسية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في عدد لا يحصى من حقول بيولوجيا الخلايا. العديد من البروتين البروتين التفاعل المقايسة لا عادة توضيح بين رابطة الدول المستقلة والتفاعلات عبر, مما قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير مدى الربط الذي يحدث في الجسم الحي وينطوي على تنقية كثيفة العمالة من البروتين و / أو معدات الرصد المتخصصة. هنا، نقدم بروتوكول بسيط الأمثل الذي يسمح لمراقبة وكمية التفاعلات عبر فقط دون الحاجة إلى تنقية البروتين طويلة أو المعدات المتخصصة. يتضمن فحص تجميع خلايا HEK خلط مجموعتين مستقلتين من خلايا HEK، يعبر كل منهما عن أربطة مزدوجة مُلزمة بالغشاء. بعد فترة حضانة قصيرة، يتم تصوير العينات ويتم تحديد المجاميع الناتجة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات متشابك تسهيلها من قبل جزيئات التصاق متشابك هي الأساس لتطوير وتنظيم ومواصفات وصيانة وظيفة من نقاط الاشتباك العصبي وتوليد الشبكات العصبية. ويتزايد بسرعة تحديد جزيئات التصاق الخلايا المتحولة؛ وبالتالي، من المهم بشكل أساسي تحديد الشركاء الملزمين وفهم كيفية تفاعل جزيئات الالتصاق الجديدة هذه مع بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك، حددت تسلسل الجينوم الطفرات في العديد من هذه الجزيئات التصاق التي ترتبط عادة إلى العديد من الاضطرابات العصبية النمائية، العصبية والنفسية،والإدمان 1. الطفرات في الجينات التي رمز لجزيئات التصاق الخلايا متشابك قد تغير بشكل ضار التفاعلات عبر وقد تسهم في التعديلات فيزيائية المرضية في تشكيل المشبك أو الصيانة.

توجد مقايسات متعددة لتقييم كمي تفاعلات البروتين والبروتين مثل قياس السعرات الحرارية isothermal، dichroism دائري، الرنين البلازمونالسطحي 2 وعلى الرغم من الكمية في الطبيعة، لديهم عدة قيود. أولاً، تتطلب بروتيناً مؤتلفاً، وتطالب أحياناً بخطوات تنقية طويلة ومملة. ثانيا، تتطلب هذه الكفاءات معدات متخصصة متطورة وخبرة فنية. ثالثاً، يمكن أن تبالغ في تقدير مدى الربط لأنها تسمح لكل من رابطة الدول المستقلة والتفاعلات العابرة بين البروتينات المربوطة بشكل طبيعي إلى غشاء في الجسم الحي. هنا نقترح اختبار بسيط وسريع نسبيا أن الاختبارات حصرا التفاعلات عبر.

للتحايل على العديد من المضاعفات المرتبطة بمقايس البروتين النقي، قمنا بتحسين تحليل تفاعل البروتين القائم على الخلايا الذي يلخص التفاعلات عبر في نظام الخلايا غير المغايرة. وقد سبق استخدام هذا الفحص في أشكال مختلفة لدراسة التفاعلات عبر الخلايا. في هذا النهج، يتم نقل جزيئات التصاق الخلية المرشحة إلى خلايا HEK293T. في الظروف الفسيولوجية، خلايا HEK293T لا تظهر التجميع الذاتي، مما يجعلها نماذج مثالية لهذا الفحص. ومع ذلك، عندما يتم الجمع بين مجموعات من الأفراد من خلايا HEK التعبير عن مستقبلات ويغاند، فإن ربط المستقبلات وقواد ليغاند تجميع خلايا HEK أن يحدث. ويتم هذا التجميع حصرياً عن طريق التفاعلات عبر، وعادة ما يكون قابلاً للملاحظة في عشرات الدقائق. لا يلزم اتخاذ خطوات لتنقية البروتين في هذه الطريقة، وتعتمد كفاءة الطريقة على النموذج الذي يتم فيه دمج مجموعات خلايا HEK التي تعبر عن جزيئات التصاقها، ثم يتم تصويرها بعد عشرات الدقائق فقط. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة غير مكلفة نسبيا، حيث لا الأجسام المضادة ولا معدات مكلفة مطلوبة. المعدات الوحيدة المطلوبة للحصول على البيانات هي مجهر فلوري قياسي. ميزة إضافية لهذا المقايسة القائمة على الخلية هي القدرة على فحص بسرعة تأثير الطفرات نقطة ذات الصلة المرض على التفاعلات عبر. ويمكن إجراء ذلك عن طريق نقل خلايا HEK مع cDNAs من المتغيرات المتحولة من البروتين من الفائدة.

في هذا البروتوكول، نقدم مثالاً نتحقق فيه مما إذا كانت طفرة الميزنس في Neurexin3α (Neurexin3αA687T)،التي تم تحديدها في مريض تم تشخيصه بإعاقة ذهنية عميقة والصرع، يغير التفاعلات في ترانس مع بروتين تكرار الغشاء اللين الغني باليوسين 2 (LRRTM2). Neurexin3α هو عضو في الأسرة المحفوظة تطوريا من الجزيئات presynaptic الخلية التصاق وبينما عمل مؤخرا قد حددت أدوار متعددة في المشبك3,4,5,6,7, فهمنا متشابك من هذا الجزيء وجميع أعضاء الأسرة neurexin لا تزال غير مكتملة. LRRTM2 هو عبارة عن بروتين التصاق الخلايا بعد التصاقات ما بعد التصاقات التي تشارك في تشكيل المشبك العصبي والصيانة8,9,10. الأهم من ذلك، LRRTM2 يتفاعل حصرا مع isoforms neurexin التي تفتقر إلى موقع لصق 4 exon البديل (SS4-) ولكن ليس مع isoforms neurexin التي تحتوي على موقع لصق 4 البديلة exon (SS4 +). يقع الطفرة البشرية (A687T) التي تم تحديدها في Neurexin3α في منطقة خارج الخلية غير مدروسة يتم حفظها تطورياً ويتم الحفاظ عليها بين جميع نويات ألفا7. كما تم تأسيس التفاعل بين هذين الجزيئات8,9,11, طرحنا السؤال: هل القدرة على الربط من Neurexin3α SS4- إلى LRRTM2 غيرت بواسطة A687T نقطة طفرة؟ وكشفت هذه الأقوال أن طفرة نقطة A687T عززت بشكل غير متوقع تجميع Neurexin3α إلى LRRTM2 مما يشير إلى أن المنطقة خارج الخلية التي تقع فيها الطفرة النقطة، تلعب دورا في التوسط التفاعلات عبرسينابتيك.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية ثقافة وtransfection

  1. جعل وسائط الخلية HEK مع DMEM، 1x (تعديل دولبيككو من المتوسط النسر) تكملها مع 4.5 ز / ل الجلوكوز، L-الجلوتامين والصوديوم بيروفات و 10٪ FBS. مرشح معقمة.
  2. يحدد مسبقاً الأحرف اللينة والمستقبلات المناسبة لتشايس التجميع.
    ملاحظة: Neurexin3α SS4+/ - وأحد اليغانات المعروفة، LRRTM2، تم استخدامه في هذه الدراسة. وأعرب عن اليغاندس والمستقبلات من الفائدة من cDNAs في pcDNA3.1. تم استخدام تجميع جيبسون لإدراج Neurexin3α فيpcDNA3.12. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGGCGCATCCCACCATGAGCCTCTCTCACCTCACCCACTC/
    GAGCGGCCGCCACTGCTGCTGCTGGGGGGGGGGACCTTACACATAATAATACTCCTTCCTT.
  3. إعداد خلايا HEK293T.
    1. تنمو خلايا HEK293T إلى التقاء في واحدة T-75 قارورة.
    2. مرة واحدة التقاء، واستخدام 2 مل من التربسين ومكان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. إضافة 6 مل من وسائط HEK إلى القارورة لإعادة تعليق الخلايا ونقل جميع 8 مل إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    3. بيليه في 500 س ز لمدة 5 دقائق و resuspend في وسائط الخلية HEK لمجموع 8 مل.
    4. عد الخلايا وإضافة 735،000 الخلايا في كل بئر من لوحة 6-جيدا. ضبط مستوى الصوت النهائي إلى 2 مل لكل بئر باستخدام وسائط خلية HEK.
    5. وضع في حاضنة 37 درجة مئوية والسماح للخلايا أن تنمو بين عشية وضحاها أو حتى تصل إلى 50-60٪ التقاء.
  4. Transfect خلايا HEK293T باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم13.
    1. Transfect جيدا-1 مع 3 ميكروغرام من البروتين من الفائدة وtransfect مع 1 ميكروغرام من البروتين الفلورسنت (3 ميكروغرام من pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- و 1 ميكروغرام من mCherry).
    2. Transfect بشكل جيد-2 كما في الخطوة 1.4.1. ولكن مع البروتين المتحول من الفائدة (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
    3. Transfect جيدا-3 مع 3 ميكروغرام من يغاند من الفائدة وtransfect مع 1 ميكروغرام من بروتين آخر الفلورسنت (3 ميكروغرام من pcDNA3.1 LRRTM2 و 1 ميكروغرام من GFP).
    4. Transfect جيدا-4 و-5 لتكون بمثابة ضوابط سلبية: جيدا-4 مع 1 ميكروغرام من GFP و-5 جيدا مع 1 ميكروغرام من mCherry.
    5. إعداد لوحة أخرى (كما هو الحال في الخطوة 1.4.1-1.4.4) إذا تطلبت شروطًا أو عناصر تحكم إضافية (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
      ملاحظة: يتم تحليل كفاءة النقل 24 ساعة بعد transfection تحت مجهر epifluorescence وكميتها كعدد من الخلايا التي تعبر عن البروتين الفلورسنت أنها كانت مصابة. ومن شأن اتباع نهج أكثر تبسيطا أن يشمل نقل خلايا HEK مع ترميز ناقلات bicistronic لبروتين الفلورسنت ورابطة الاهتمام وينصح بشدة فوق co-transfection. في حالة هذه الدراسة، ألفا Neurexins هي ~ 4.3 كيلوبايت، ولوحظت كثافة الفلوريسنس منخفضة باستخدام نظام bicistronic مما يستلزم co-transfection.
  5. بعد 48 ساعة من عملية التهيّن، حصاد الخلايا من أجل التجميع.
    1. غسل كل جيدا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    2. أضف 1 مل من 10 mM EDTA في برنامج تلفزيوني في كل بئر إلى فصل بلطف التفاعلات بين الخلايا إلى الخلية ولوحة احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: لا ينصح التربسين للخطوة 1.5.2 بسبب الانقسام البروتيني المحتمل لجزيئات التصاق في الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، بعد إضافة EDTA قد لا يتم إيقاف البروتوكول حتى اكتمال كما الخلايا الآن سيتم تعرضها للظروف المحيطة.
    3. بلطف اضغط لوحة لفصل الخلايا، وحصاد كل بئر في أنابيب مخروطية 15 مل منفصلة.
    4. أنابيب مخروطية للطرد المركزي عند 500 x g ودرجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. في حين أن الخلايا هي تعبئة، وإعداد 6 أنابيب الحضانة عن طريق وضع العلامات على الجزء العلوي من كل أنبوب microcentrifuge مع كل حالة.
    ملاحظة: ينبغي استخدام كل تبديل في شروط GFP و mCherry لتشمل جميع الظروف التجريبية والضوابط المناسبة. على سبيل المثال: 1. GFP/mCherry، 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4--mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4----mCherry/LRRTM2-GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- -mCherry/LRRTM2-GFP. جعل أنابيب إضافية لاستيعاب المزيد من الشروط والضوابط.
  7. إزالة الخلايا فائقة و resuspend في 500 ميكرولتر من وسائط HEK مع 10 mM CaCl2 و 10 mM MgCl2 2 الدفء إلى 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: إضافة CaCl2 و MgCl2 يسمح جزيئات التصاق لإعادة الربط وهو مطلوب فقط إذا كان الشركاء التفاعل عبر الخلية في السؤال تتطلب الكاتيونات divalent للتصاق.
  8. عد الخلايا في كل أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام مقياس للهيمويت و aliquot 200,000 خلية من كل حالة في أنبوب مناسب من الخطوة 1.6.1 لمزيج 1:1 في حجم إجمالي 500 ميكرولتر.
    ملاحظة: يجب أن يستغرق 5 دقائق فقط لكل شرط لحساب والمبالغ aliquot.
  9. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة في دوار أنبوب بطيء.

2. الحصول على صورة

  1. تحسين المعلمات المجهر للحصول على عينات محددة. في هذا المثال، تم التقاط الصور على مجهر واسع المجال. استخدام هدف الهواء 5x (NA: 0.15; WD: 20000 μm) للحصول على حقل كبير بما فيه الكفاية للتحليل.
  2. تقييم تجميع خط الأساس مباشرة بعد خلط الشرطين خلايا HEK في الخطوة 1.8. هذه هي الآن 'الوقت صفر' الصور.
    1. Pipette 40 ميكرولتر من كل خليط عينة على شريحة المجهر المشحونة والصورة تحت الفلورانس في كل من القنوات 488 و 561.
    2. الحصول على ثلاثة حقول مختلفة من الرؤية في مستوى التركيز واحد لكل قطرة العينة.
  3. الحصول على الصور النهائية في 60 دقيقة كما صورة 'الوقت 60'.
    1. للحصول على صورة 'الوقت 60' من الخليط بعد 60 دقيقة حضانة، واتخاذ آخر 40 ميكرولتر عينة من كل حالة من أنابيب الدورية والماصات كل عينة على شريحة مشحونة. صورة كما في الخطوة 2.2.2.
      ملاحظة: يجب التحقق من تجميع الخلايا كل 15 دقيقة حتى يحدث التشبع. وسيتوقف توقيت التجميع على البروتينات التي يجري اختبارها.

3. تحليل ImageJ/فيجي

  1. لتحديد مدى التجميع باستخدام فيجي/ImageJ، احفظ ملفات التحليل.
    1. حفظ ملفات ترميز إضافية المتوفرة في مجلد imageJ وحدات الماكرو على الكمبيوتر.
    2. تثبيت ماكرو التجميع المتوفرة (الإضافات، وحدات الماكرو، تثبيت، وحدد ملف "AggregationAssay.txt").
  2. تحديد العتبات.
    1. تحميل ملف "وقت الصفر" .tif إلى imageJ وتقسيم القنوات (صورة | | اللون انقسام القنوات).
      ملاحظة: يتم استخدام الصورة 'الوقت صفر' لتحديد العتبة وأصغر حجم بونكتا للتجربة بأكملها.
    2. قناع كل قناة(الإضافات | | وحدات الماكرو AggregationAssay_MakeMask). جعل قناع من صورة نافذة سوف تظهر. خانات الاختيار بجوار تحديد عتبة الصورة وتحديد الكتل Params من مدرج التكراري وانقر فوق موافق.
    3. حدد عتبة الصورة باستخدام شريط الشرائح، وسجل الرقم إلى يمين شريط الشرائح، وانقر فوق موافق.
    4. سيظهر مدرج بياني لحجم الكتلة. حدد حجم كتلة من الرسم البياني الذي يناسب التجربة، اكتب هذا الرقم في المربع الحد الأدنى من حجم الكتلة: ثم انقر فوق موافق. لن يتم تحليل الكتل التي دون هذا الحجم.
  3. قم بتشغيل التحليل.
    1. فتح صورة 'الوقت 60' من حالة 1 في imageJ وتقسيم القنوات كما هو الحال في الخطوة 3.2.1.
    2. قناع كل قناة (الإضافات ، وحدات الماكرو ، AggregationAssay_MakeMask). استخدام نفس عتبة والحجم المحدد في الخطوة 3.2.3 والخطوة 3.2.4. إلغاء تحديد المربعات بجوار تحديد عتبة الصورة وتحديد الكتل Params من الرسم البياني ثم يدوياً اكتب الحجم وعتبات في الحقول المناسبة ثم انقر فوق موافق.
    3. حساب مؤشر التجميع(الإضافات | | وحدات الماكرو AggregationAssay_CalculateOverlap). حدد القنوات المقنعة التي سيتم مقارنتها والدليل الذي سيتم حفظ الملفات الناتجة فيه.
    4. كرر الخطوات 3.3.1-3.3.3 لكل صورة 'الوقت 60' في كل حالة.
      ملاحظة: يُعرَّف مؤشر التجميع بأنه منطقة التداخل الإجمالي مقسوماً على مجموع منطقتين للقناتين مطروحاً منها منطقة التداخل مضروبة في 100 (مؤشر التجميع = منطقة التداخل/[مساحة القناة 1 + مساحة القناة 2 – منطقة التداخل] x 100). هذا التهيئة عملية 'OR' بين القناتين المقنعين تمثل إجمالي البيكسلات في أي قناع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طفرة A687T يزيد Neurexin3α SS4- ملزمة LRRTM27
للتحقيق في كيفية تأثر التفاعلات بين الخلايا من اثنين من البروتينات متشابك المعروفة من خلال إدخال طفرة نقطة وجدت في المريض مع الإعاقة الفكرية والصرع، استخدمنا أعلاه هيك خلية تجميع المقايسة(الشكل 1). وقد تم نقل الخلايا وفقا للقسم 1 وأعدت للتصوير وفقا للقسمين 1 و 2 من البروتوكول. تم تصوير الخلايا عند خط الأساس حيث لم يتم ملاحظة أي تجميع كما هو متوقع (غير مبين). وتم تحليل الصور التي تم الحصول عليها في 60 دقيقة كما هو ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشريح البروتين البروتينية التفاعلات التي تحدث في عبر خلال التصاق الخلية يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية الكامنة في العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك تشكيل وظيفة وصيانة نقاط الاشتباك العصبي أثناء النضج وإعادة عرض. الآثار المترتبة على التفاعلات من خلية إلى خلية توسيع نطاقها وراء علم الأعصاب ولها أدوار أوسع نطاقا في نقل الإشارات، وهجرة الخلايا وتطوير الأنسجة14. يمكن الانحرافات في التصاق الخلية تعطيل العمليات الخلوية حتمية لوظيفة الخلية السليمة ويمكن الكامنة تحت مجموعة متنوعة من الإلتكول...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المنح من المعهد الوطني للصحة العقلية (R00MH103531 و R01MH116901 إلى J.A.) ، ومنحة تدريب ما قبل الدكتوراه من المعهد الوطني للطب العام (T32GM007635 إلى S.R.) ، وزمالات ليدا هيل جيليام للدراسة المتقدمة (GT11021 إلى S.R.). نشكر الدكتور كيفن وولفري على المساعدة في المجهر، والدكتور ك أولريش باير لاستخدام مجهره النيففلورسنت، وتوماس سودهوف (جامعة ستانفورد) لLRRTM2 بلاسميد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 مل أنابيب دقيقة يمكن التخلص منها مع أغطية المفاجئةVWR89000-028حضانة السكان المختلطين من خلايا HEK
1000 مل Rapid & [مدش] ؛ وحدة تصفية التدفق ، 0.2 um aPES غشاءThermo Fisher567-0020تعقيم وسائط HEK
15 مل أنابيب الطرد المركزي SpectraTubeWard ' s Science470224-998حصاد خلايا HEK
6 ألواح زراعة الأنسجة المعقمةVWR100062-892زراعة خلايا HEK
كلوريد الكالسيومSigma223506-500Gتعداء فوسفات الكالسيوم ، إعادة تعليق خلية HEK
أجهزة الطرد المركزي - Sorvall Legend RTKendro منتجات المختبر75004377حصاد خلايا HEK
حاضنةخلايا CO2Thermo ScientificHERACELL 150iحضانة خلايا HEK أثناء النمو
DMEM ، 1x (تعديل Dulbecco لوسط النسر) مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و L-glutamine وبيروفات الصوديومCorning10-013-CVصيانة خلايا HEK
Dulbecco s الفوسفات المخزن الملحي PBS (1X)Gibco14190-144تمرير / حصاد خلية HEK
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكSigmaED-500Gحصاد خلايا HEK
قوارير ثقافة فالكون ذات التهوية ، 75 سم < sup>2< / sup> منطقة النموCorning9381M26زراعة خلايا HEK
مصل الأبقار الجنينيSigma17L184صيانة
HEK293T خلاياATCCنظام نموذج
ImageJNIHV: 2.0.0-rc-69 / 1.52pتحليل الصور
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومSigmaM9272-500GHEK إعادة تعليق خلية
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائيفيشر الكواشف الحيويةBP332-500تعداء فوسفات الكالسيوم
التربسين 0.25٪ (1X) الحلGE Healthcare Life العلومSH30042.01خلايا HEK
حضانة أنبوب دوارلمجموعات مختلطة من خلايا HEK
شرائح مجهر فائق الوضوح. وايت فروستيد ، إيجابي تهمةدينفيل العلمية.الحصولصورة M1021
مجهر واسع المجالZeissAxio Vert 200Mالحصول على صورة
جيدا خلايا HEK مرور على

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
  2. Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
  3. Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
  4. Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
  5. Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
  6. Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
  7. Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
  8. Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
  9. de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
  10. Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
  11. Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
  12. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  13. Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
  14. Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
  15. Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
  16. Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
  17. Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).
  18. Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
  19. Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcellular InteractionsProtein AggregationHEK Cell AggregationTrans Adhesion AssayFluorescence ImagingCell CountingEDTA TreatmentCentrifugation ProtocolGFP mCherry LabelingAdhesion Molecule Screening

Related Articles