مقالة منهجية

Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا من عزلة الثقافة

9.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61239

⸱

مايو 20, 2020

 ,  ,  , 
1Center for Veterinary Medicine, U.S. Food and Drug Administration

في هذه المقالة

ملخص

التضخيم الحراري الأيزوحرارية (LAMP) بوساطة حلقة هو اختبار تضخيم حمض النوى الحرارية (iNAAT) الذي اجتذب اهتمامًا واسعًا في مجال الكشف عن مسببات الأمراض. هنا، نقدم بروتوكول مصباح السالمونيلا متعدد المختبرات كوسيلة سريعة وموثوقة وقوية لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا المفترضة من عزلة الثقافة.

الملخص

وقد برز التضخيم متساوي الحراري (مصباح) بوساطة حلقة كاختبار قوي التضخيم حمض النووي للكشف السريع عن العديد من العوامل البكتيرية والفطرية والطفيلية والفيروسية. السالمونيلا هي مسببة أمراض بكتيرية للقلق سلامة الأغذية في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك الغذاء للحيوانات. هنا هو متعدد المختبرات التحقق من صحة السالمونيلا لامب البروتوكول الذي يمكن استخدامه لفحص بسرعة الغذاء الحيواني لوجود التلوث السالمونيلا ويمكن أيضا أن تستخدم لتأكيد عزل السالمونيلا المفترضة تعافى من جميع فئات المواد الغذائية. ويستهدف فحص المصباح على وجه التحديد جين غزو السالمونيلا (invA)وسريعة وحساسة ومحددة للغاية. يتم إعداد DNAs قالب من مرق إثراء من الأغذية الحيوانية أو الثقافات النقية لعزل السالمونيلا المفترضة. يتم إعداد خليط مُكْشف المصباح من خلال الجمع بين مزيج رئيسي متساوي الحرارة، واعمدة، وقوالب حمض نووي، والمياه. يعمل مقايسة المصباح عند درجة حرارة ثابتة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يتم رصد النتائج الإيجابية عن طريق الفلوريس في الوقت الحقيقي ويمكن الكشف عنها في وقت مبكر من 5 دقائق. اختبار المصباح معارض التسامح عالية لمثبطات في الغذاء الحيواني أو الثقافة المتوسطة، بمثابة سريعة وموثوقة وقوية، فعالة من حيث التكلفة، وسهلة الاستعمال لفحص وتأكيد السالمونيلا. وقد تم مؤخرا إدراج طريقة مصباح في الولايات المتحدة للأغذية والدواء دليل التحليل البكتريولوجي (BAM) الفصل 5.

المقدمة

Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة (مصباح) هو رواية اختبار تضخيم الحمض النووي متساوي المدى (iNAAT) اخترع في عام 2000 من قبل مجموعة من العلماء اليابانيين1. من خلال تشكيل هيكل الحمض النووي الجذعية حلقة محددة الهدف خلال الخطوات الأولية، يستخدم مصباح سليمر الحمض النووي الذي يُشرّد حبلاً لتضخيم هذه المادة بدءاً بشكل شبه أسي، مما أدى إلى 109 نسخ من الهدف في أقل من 1 ساعة1. بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وهو NAAT مستخدم على نطاق واسع ، يمتلك مصباح العديد من المزايا. أولاً، يتم تنفيذ تفاعلات المصباح في ظل ظروف متساوية. هذا يغني الحاجة إلى آلة متطورة للدراجات الحرارية. ثانيا، مصباح متسامحة للغاية لوسائل الإعلام والثقافة والمواد البيولوجية2 مع متانة أظهرت للتطبيقات السريرية والغذائية على حد سواء3،4. هذا يبسط إعداد العينة ويقلل من النتائج السلبية الخاطئة5. ثالثاً، إن LAMP قابل لمنصات الكشف المتعددة، مثل العكر، وقياس الألوان، والإنارة الحيوية، والفلور، وميكروفيويديك6. رابعاً، إن LAMP محدد للغاية لأنه يستخدم أربعة إلى ستة اُبُر مصممة خصيصاً لاستهداف ست إلى ثماني مناطق محددة1و7. خامساً، إن LAMP شديد الحساسية والعديد من الدراسات التي أفادت عن حساسيتها الفائقة ل PCR أو PCR8في الوقت الحقيقي . وأخيرا، LAMP هو أسرع مع العديد من المقايسات اعتماد الآن 30 دقيقة وقت التشغيل القياسي في حين PCR من نوع المقايسات عادة ما تأخذ 1-2 ح8.

غذت هذه الميزات الجذابة تطبيق مصباح في مناطق الكشف عن مسببات الأمراض واسعة، بما في ذلك التشخيص في المختبر 9، تشخيص الأمراض الحيوانية10، والغذاء واختبارات البيئية11. والجدير بالذكر أنّ منظمة الصحة العالمية أوصت بإجراء اختبار بديل صالح لفحص المجهر باستخدام اللطخة البلغمية لتشخيص السل الرئوي في البيئات الطرفية12. تطبيق مصباح يمتد أيضا إلى ما بعد تحديد الميكروبات لتشمل الكشف عن المواد المسببة للحساسية، والأنواع الحيوانية، ومقاومة المخدرات، والكائنات المعدلة وراثيا، والمبيدات13.

السالمونيلا غير التيفويدي هو مسبب أمراض حيوانية لسلامة الأغذية كبيرة والصحة العامة القلق في جميع أنحاء العالم14. كما تم تحديدها كخطر مكروبي مهم في الغذاء للحيوانات (أي، الغذاء الحيواني)15،16. لمنع أمراض السالمونيلا / تفشي من الأغذية البشرية الملوثة والغذاء الحيواني، لا بد من وجود أساليب سريعة وموثوقة وقوية لاختبار السالمونيلا في مجموعة متنوعة من المصفوفات. في العقد الماضي، بذلت جهود كبيرة على الصعيد الدولي على تطوير وتطبيق مقايسات السالمونيلا لامب في مجموعة واسعة من مصفوفات الغذاء، كما لخصت مؤخرا في استعراض مستفيض8. وقد أكملت عدة اختبارات مصباح السالمونيلا، بما في ذلك واحد المعروضة هنا، بنجاح التحقق من صحة المختبرات المتعددة بعد المبادئ التوجيهية الدولية الراسخة17،18،19،20.

لدينا السالمونيلا مصباح فحص يستهدف على وجه التحديد في غزو السالمونيلا الجينات invA (GenBank الانضمام رقم M90846)21 وسريعة وموثوقة وقوية في مصفوفات الغذاء متعددة4,22,23,24,25,26. وقد تم التحقق من صحة هذه الطريقة في ستة مصفوفات الأغذية الحيوانية في دراسة قبل26 وفي الغذاء الكلب الجاف في دراسة تعاونية متعددة المختبرات19. ونتيجة لذلك، تم مؤخرا إدراج طريقة مصباح السالمونيلا المعروضة هنا في الولايات المتحدة للأغذية والعقاقير (FDA) في دليل التحليل البكتريولوجي (BAM) الفصل 5 السالمونيلا27 لخدمة غرضين، واحد كوسيلة فحص سريع لوجود السالمونيلا في الغذاء الحيواني واثنين كوسيلة تأكيد موثوق بها لسالمونيلا المفترضة معزولة عن جميع الأطعمة.

البروتوكول

ملاحظة: يحتوي مزيج تفاعل المصباح على بوليميراز الحمض النووي، العازل، MgSO4،dNTPs، القوالب التمهيدية، قالب الحمض النووي، والماء. يتم احتواء الكواشف الأربعة الأولى في مزيج رئيسي متساوي الحرارة (جدول المواد). التمهيديات هي premixed في المنزل لتصبح مزيج التمهيدي (10x). يمكن إعداد قوالب الحمض النووي من مرق الإثراء لعينات الأغذية الحيوانية لغرض الفحص أو من ثقافات عزل السالمونيلا المفترضة لغرض التأكيد. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين السيطرة الإيجابية (الحمض النووي المستخرج من أي سلالات مرجعية السالمونيلا، على سبيل المثال، السالمونيلا enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) وأية سيطرة قالب (المجلس الوطني الانتقالي؛ معقم المياه الصف الجزيئي) في كل تشغيل مصباح.

1- إعداد نماذج الحمض النووي

  1. لإعداد قوالب الحمض النووي من الإثراءات الغذائية الحيوانية، اتبع هذه الخطوات.
    1. Aseptically تزن 25 غرام من عينة الغذاء الحيواني (على سبيل المثال، والغذاء القط الجاف، والغذاء الجاف الكلب، تغذية الماشية، والأعلاف الحصان، وعلف الدواجن، ولحوم الخنازير) في كيس مرشح معقمة (جدول المواد)،أو ما يعادلها. ضع الحقيبة في حاوية كبيرة أو رف للحصول على الدعم أثناء الحضانة.
    2. إضافة 225 مل من الماء المعقم بالبتون المخزنة (BPW). تخلط جيدا عن طريق دوامة وموجزة تدليك اليد. اسمحوا الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 ± 5 دقائق.
    3. تخلط جيدا عن طريق دوامة وتحديد رقم هيدروني مع ورقة اختبار. ضبط درجة ح H، إذا لزم الأمر، إلى 6.8 ± 0.2 مع 1 NAOH N عقيمة أو 1 N HCl. Incubate في 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.
    4. تخلط جيدا عن طريق دوامة الحقيبة التي تحتوي على مرق إثراء الغذاء الحيواني. نقل 1 مل من الجانب الذي تمت تصفيته من الحقيبة إلى أنبوب microcentrifuge. دوامة لفترة وجيزة.
    5. استخراج الحمض النووي باستخدام كاشف إعداد العينة(جدول المواد)على النحو التالي.
      1. جهاز طرد مركزي في 900 × ز لمدة 1 دقيقة لإزالة الجسيمات الكبيرة ونقل فائقة إلى أنبوب جديد microcentrifuge.
      2. جهاز طرد مركزي في 16،000 × ز لمدة 2 دقيقة والتخلص من الفائق.
      3. تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من مُكْشف إعداد العينة والحرارة عند 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة الحرارة الجافة.
      4. بارد لدرجة حرارة الغرفة وتخزين عينات من مستخلصات الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
  2. لإعداد قوالب الحمض النووي من الثقافات السالمونيلا المفترضة، اتبع هذه الخطوات.
    1. الحصول على السالمونيلا المفترض يعزل من عزلة الثقافة في جميع الأطعمة التالية FDA في BAM الفصل 5 قسم السالمونيلا D: عزل السالمونيلا27.
    2. تعول السالمونيلا المفترضة على لوحة أجار غير انتقائية (على سبيل المثال، أجار الدم، أجار المغذيات، و trypticase الصويا أجار) واحتضان في 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.
    3. نقل عدة مستعمرات واحدة إلى 5 مل من مرق الصويا trypticase (TSB) أو مرق القلب الدماغ (BHI) واحتضان في 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 16 ± 2 ساعة.
      ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن تكون اختيارية إذا الثقافة السالمونيلا المفترضة هو خالص. في هذه الحالة، يمكن إعداد قوالب الحمض النووي عن طريق تعليق عدة مستعمرات مفردة في 5 مل من TSB والحرارة 500 ميكرولتر من التعليق في 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في كتلة الحرارة الجافة. متابعة الخطوة 5 أدناه.
    4. نقل 500 ميكرولتر من ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنبوب microcentrifuge والحرارة في 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة الحرارة الجافة.
    5. بارد لدرجة حرارة الغرفة وتخزين عزل مستخلصات الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
  3. لإعداد الحمض النووي التحكم الإيجابي، اتبع خطوات مماثلة كما سبق لإعداد قوالب الحمض النووي من الثقافات السالمونيلا المفترضة مع خطوة تخفيف إضافية واحدة.
    1. تلقيح S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) أو أي سلالات مرجعية السالمونيلا على لوحة أجار غير انتقائية (على سبيل المثال، أجار الدم، أجار المغذيات، و trypticase الصويا أجار) واحتضان في 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 24 ± 2 ساعة.
    2. نقل عدة مستعمرات واحدة إلى 5 مل من TSB أو BHI مرق واحتضان في 35 ± 2 درجة مئوية لمدة 16 ± 2 ساعة لتصل إلى ~10 9 CFU / مل.
    3. بشكل متسلسل تخفيف ثقافة بين عشية وضحاها في 0.1٪ بيبتون المياه للحصول على ~ 107 CFU / مل.
    4. نقل 500 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى أنبوب microcentrifuge والحرارة في 100 ± 1 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في كتلة الحرارة الجافة.
    5. يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ويخزن الحمض النووي التحكم إيجابية في -20 درجة مئوية.

2. إعداد مزيج التمهيدي (10x)

  1. الحصول على ال التمهيديات مصباح توليفها تجاريا (Sal4-F3، Sal4-B3، SAL4-FIP، Sal4-BIP، Sal4-LF، و Sal4-LB) مع تنقية desalts القياسية(الجدول 1).
اسم التمهيديوصفتسلسل (5'-3')طول (bp)
سال4-F3التمهيدي الخارجي للأمامGAACGTGTCGCGGAAGTC18
سال4-ب3التمهيدي الخارجي للخلفCGGCAATAGCGTCACCTT18
Sal4-FIPالتمهيدي الداخلي إلى الأمامGCGCGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATTATCCGG38
Sal4-BIPالتمهيدي الداخلي الخلفيGCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC38
Sal4-LFالتمهيدي حلقة إلى الأمامTCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG25
Sal4-LBالتمهيدي حلقة إلى الوراءAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG21

الجدول 1: البهاء التمهيدية لفحص السالمونيلا في الأغذية الحيوانية وتأكيد السالمونيلا من عزلة الثقافة. تم تصميم التمهيديات على أساس تسلسل السالمونيلا إنفا (GenBank رقم الانضمام M90846).

  1. إعداد حلول الأسهم من كل التمهيدي (100 μM) عن طريق إعادة الترطيب التمهيدي مع كمية مناسبة من المياه الصف الجزيئي العقيمة. اخلط جيداً عن طريق الدوامة لمدة 10 ثانية ثم قم بتخزينها عند -20 درجة مئوية (-80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل).
  2. إعداد مزيج التمهيدي (10x) وفقا لورقة عمل (الجدول 2). إضافة وحدات التخزين المناسبة من حلول الأسهم التمهيدية والمياه الصف الجزيئي العقيمة في أنبوب microcentrifuge. اخلط جميع الكواشف جيدًا عن طريق الدوامة لمدة 10 s.
مكونconc. (μM)التمهيدي ميكس conc. (μM)حجم (ميكرولتر)
سال 4-F3 التمهيدي100110
سال4-B3 التمهيدي100110
سال 4-FIP التمهيدي10018180
سال 4-BIP التمهيدي10018180
Sal4-LF التمهيدي10010100
سال4-LB التمهيدي10010100
مياه الصف الجزيئيغير مُنَدِيًاغير مُنَدِيًا420
مجموعغير مُنَدِيًاغير مُنَدِيًا1000

الجدول 2: ورقة عمل لإعداد مزيج التمهيدي مصباح (10x). يتم سرد التمهيديات في الجدول 1.

  1. Aliquot مزيج التمهيدي 10x إلى 500 ميكرولتر لكل أنبوب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية.

3. جمعية رد فعل مصباح

ملاحظة: لمنع التلوث المتبادل، يوصى بشدة بفصل المناطق المستخدمة لإعداد المزيج الرئيسي للمصباح وإضافة قوالب الحمض النووي. الشكل 1 هو رسم بياني لمصباح.

figure-protocol-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير عمل SALMONELLA LAMP. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. إعداد وتشغيل الإعداد
    1. مقاعد البدلاء نظيفة مع ايزوبروبانول والحمض النووي- وDNase-مذلل حل (جدول المواد). الماصات النظيفة وحاملات الشريط أنبوب (جدول المواد) مع الحمض النووي وDNase- المهينة الحل.
    2. اذيب مزيج الماجستير متساوي الحرارة، مزيج التمهيدي (10x)، والمياه الصف الجزيئي، والحمض النووي التحكم الإيجابي، والقوالب الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بتشغيل أداة LAMP(جدول المواد)واضغط على شاشة الفتح للوصول إلى الشاشة الرئيسية. اتبع هذه الخطوات لإنشاء تشغيل.
      ملاحظة: نموذج واحد من أداة مصباح لديه 2 كتل (A و B) مع 8 عينات في كل كتلة ونموذج آخر لديه كتلة واحدة التي تستوعب 8 عينات (جدول المواد).
      1. انقر فوق LAMP+ الAnneal وحدد تحرير لإدخال معلومات العينة.
        ملاحظة: يتكون ملف تعريف تشغيل المصباح الافتراضي من التضخيم عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ومرحلة من 98 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية مع 0.05 درجة مئوية في الثانية.
      2. انقر فوق كل صف عينة لتنشيط المؤشر وإدخال معلومات العينة ذات الصلة، وذلك باستخدام رمز كتلة AB للتبديل بين كتلتين أداة LAMP.
      3. انقر فوق أيقونة التحقق عند إدخال كافة معلومات العينة.
        ملاحظة: اختيارياً، قد يتم حفظ الإعداد تشغيل (الذي يطلق عليه "ملف تعريف" الذي يحتوي على معلومات نموذج مع ملف تعريف تشغيل المصباح الافتراضي) للاستخدام لاحقاً. انقر فوق أيقونة حفظ واتّسم ملف التعريف باسم فريد. عند اختبار هذه المجموعة نفسها من العينات في المرة القادمة، يمكن بدء تشغيل جديد باستخدام ملف التعريف المحفوظة. انقر فوق أيقونة المجلد في الجزء السفلي الأيمن من الشاشة الرئيسية وحدد ملف التعريف لتحميل ملفات التعريف المحفوظة.
  2. تجمع تفاعل المصباح
    ملاحظة: عند استخدام كل من كتل أداة مصباح (A و B، ما مجموعه 16 عينة)، إعداد مزيج مصباح الرئيسي ل18 عينات. إذا كان استخدام واحد فقط كتلة أداة مصباح (8 عينات المجموع)، وإعداد مزيج المصباح الرئيسي ل10 عينات. بالنسبة لأرقام العينات الأخرى، اضبط مستوى الصوت وفقًا لذلك لاستيعاب فقدان الأنابيب. دائماً تشمل سيطرة إيجابية و NTC في كل تشغيل مصباح. يوصى بإجراء اختبار تكراري لكل عينة في تشغيلات المصباح المستقلة.
    1. إعداد المزيج الرئيسي مصباح وفقا لورقة عمل(الجدول 3). إضافة وحدات التخزين المناسبة من مزيج سيد متساوي الحراري، مزيج التمهيدي، والمياه الصف الجزيئية في أنبوب microcentruge ودوامة بلطف لمدة 3 s. الطرد المركزي لفترة وجيزة.
    2. ضع شريط الأنبوب في حامل الشريط ووزع 23 ميكرولتر من المزيج الرئيسي LAMP إلى كل بئر.
    3. دوامة جميع القوالب الحمض النووي والطرد المركزي لفترة وجيزة. إضافة 2 μL من قالب الحمض النووي إلى البئر المناسبة وغطاء بإحكام.
    4. إزالة شريط أنبوب من حامل ونفض الغبار المعصم لضمان جميع الكواشف قد تجمعت في الجزء السفلي من الأنبوب.
    5. قم بتحميل شريط الأنبوب في كتلة أداة LAMP ( كتلات) ، مما يضمن أن تكون القبعات آمنة قبل إغلاق الغطاء.
مكونعمل conc.رد فعل نهائي conc.حجم لكل عينة (μL)حجم 18 عينة (μL)حجم 10 عينات (μL)
ISO-001 مزيج سيد متساوي الحرارة1.67x1 x15270150
مزيج التمهيدي10x1 x2.54525
مياه الصف الجزيئيغير مُنَدِيًاغير مُنَدِيًا5.59955
المجموع الفرعي للمزيج الرئيسيغير مُنَدِيًاغير مُنَدِيًا23414230
نموذج الحمض النوويغير مُنَدِيًاغير مُنَدِيًا2غير مُنَدِيًاغير مُنَدِيًا

الجدول 3: ورقة عمل لإعداد مزيج رد فعل مصباح. يتم إعداد مزيج التمهيدي (10x) وفقا للجدول 2 باستخدام حلول الأسهم التمهيدية المدرجة في الجدول 1.

4. تشغيل المصباح

  1. انقر على أيقونة تشغيل في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة وحدد كتلة (ق) التي تحتوي على شريط أنبوب (ق) لبدء تشغيل مصباح.
  2. اختياريا، في حين أن رد فعل هو قيد التقدم، اضغط على درجة الحرارة، تضخيم، وعلامات الينال لرؤية التغيرات الديناميكية من مختلف المعلمات أثناء تشغيل مصباح.
  3. بمجرد اكتمال التشغيل، اضغط على علامات التبويب التضخيم والAnneal لرؤية كاملة التضخيم ومنحنيات الهادل واضغط على علامة التبويب النتائج لعرض النتائج.
  4. اختيارياً، لحفظ السجلات، سجل رقم التشغيل الموجود في أعلى يسار الشاشة، باستخدام تنسيق "رقم number_run التسلسلية" على سبيل المثال، "GEN2-2209_0030".

5. تفسير نتائج المصباح

ملاحظة: يمكن الاطلاع على نتائج المصباح على لوحة أداة مصباح مباشرة و / أو باستخدام برنامج مصباح(جدول المواد).

  1. لتفسير نتائج المصباح على لوحة العدادات، اتبع الخطوات التالية.
    1. انقر فوق أيقونة المجلد في أسفل يسار الشاشة الرئيسية وحدد تسجيل للانتقال إلى موقع الملف لتحميل تشغيل المصباح الذي يهمك.
      ملاحظة: يتم تنظيم تشغيل المصباح حسب التاريخ، بدءاً من السنة.
    2. مراقبة علامات التبويب الخمس المرتبطة بكل تشغيل: الملف الشخصي، درجة الحرارة، التضخيم، الينال، والنتائج.
      ملاحظة: تُظهر علامات تبويب النبذ ودرجة الحرارة درجات الحرارة المبرمجة والفعلية، على التوالي، في آبار العينة مع استمرار تفاعل المصباح. تُظهر علامات التضخيم والAnneal قراءات الفلور والتغيرات في الفلور أثناء مراحل التضخيم والحنيل، على التوالي. تعرض علامة التبويب النتائج طريقة عرض جدولية لنتائج المصباح.
    3. اضغط على علامة التبويب النتائج لمراقبة نتائج المصباح لكل بئر.
      ملاحظة: هناك ثلاثة أعمدة (حسناً، التضخيم، و(آنال). يُظهر عمود "التضخيم" قيم وقت الذروة(Tmax؛ min:sec) لكل عينة ("حسناً") ويظهر عمود "الهايل" درجات حرارة الذوبان/الذوبان(Tm؛ °C) لأي منتج مضخم في ذلك البئر.
    4. تفسير نتائج LAMP وتقرير نتائج المصباح النهائية على النحو التالي.
      1. فحص الآبار التحكم أولاً. وينبغي أن يكون المجلس الوطني الانتقالي جيدا فارغة T ماكس في حين أن تيم يمكن أن تكون إما فارغة (كلا من نماذج أداة مصباح) أو < 83 درجة مئوية (فقط لنموذج أداة مصباح مع كتلتين). السيطرة الإيجابية يجب أن يكون جيدا Tالحد الأقصى بين 5 و 10 دقيقة و T m حول 90 درجة مئوية.
      2. فحص العينة الآبار. جميع العينات مع Tم الصحيح (حوالي 90 درجة مئوية) و T كحدأقصى (بين 5−30 دقيقة) تعتبر إيجابية بالنسبة السالمونيلا.
      3. تقرير نتائج المصباح النهائية استنادًا إلى النتائج من عمليات التشغيل المكررة. إذا كان لـ "تشغيلات مكررة" نتائج متناسقة، يمكن الإعلام عن نتائج المصباح النهائية. إذا كانت عمليات التشغيل المكررة غير متناسقة، كرر تشغيل كلا بشكل مستقل. إذا كانت النتائج لا تزال غير متناسقة، ينبغي اعتبار العينة إيجابية افتراضية لسالمونيلا وسوف تحتاج إلى الذهاب من خلال تأكيد الثقافة.
  2. لتفسير نتائج LAMP باستخدام البرنامج، اتبع الخطوات التالية.
    1. انقر على أيقونة الكمبيوتر على اللوحة اليمنى وانتقل إلى موقع الملف لتحميل مصباح تشغيل الفائدة.
      ملاحظة: لا يحتاج الكمبيوتر الذي به البرنامج المثبت إلى أن يكون متصلاً بجهاز LAMP لتحليل نتائج المصباح، أي أن الوصول عن بعد متاح. يتم تنظيم تشغيل المصباح حسب التاريخ.
    2. مراقبة علامات التبويب السبع المرتبطة بكل تشغيل: الملف الشخصي، درجة الحرارة، التضخيم، معدل التضخيم، ال Anneal، مشتقة الناجيل، والنتيجة.
      ملاحظة: على غرار عرض لوحة العدادات، تعرض علامات تبويب النبذ ودرجة الحرارة درجات الحرارة المبرمجة والفعلية، على التوالي، في آبار العينة مع استمرار تفاعل المصباح. التضخيم /التضخيم معدل والآنيل/ علاماتالتبويب المشتقة الينال تظهر قراءات الفلورانس أو التغيرات في الفلوريس خلال مراحل التضخيم والحنى، على التوالي. تعرض علامة التبويب النتائج عرضًا جدوليًا لنتائج المصباح التي تختلف قليلاً عن عرض لوحة العدادات.
    3. اضغط على علامة التبويب معدل التضخيم لعرض عرض رسومي لنسب الفلورسينس حسب الوقت. انقر على رمز الإعداد في أعلى يمين الشاشة ثم قم بضبط "نسبة عتبة الكشف الذروة" من 0.020 إلى 0.010.
      ملاحظة: التعديل ضروري لضمان تحديد جميع القمم الصالحة، والنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام البرامج تتطابق مع تلك المعروضة على لوحة العدادات.
    4. اضغط على علامة التبويب النتيجة لمراقبة نتائج المصباح لكل بئر.
      ملاحظة: هناك أربعة أعمدة (اسم الرسم البياني رقم Well " " ، "اسم" و "قيمة الذروة"). الجزء العلوي من العمود "قيمة الذروة" يظهر "وقت أمبير"(Tmax؛ min:sec) لكل عينة ("اسم البئر") بينما الجزء السفلي يظهر "مشتقة البين"(Tm; °C) لأي منتج مضخم في ذلك البئر.
    5. تفسير نتائج المصباح وتقرير نتائج المصباح النهائي بعد خطوات مماثلة كما هو الحال عند استخدام لوحة العدادات مع استثناء واحد أن المجلس الوطني الانتقالي جيدا والعينات السلبية الأخرى ينبغي أن يكون Tم فارغة كما إعدادات برنامج المصباح القضاء على تلك النتائج Tم < 83 درجة مئوية. وبالمثل، تعتبر جميع العينات مع Tم الصحيح (حوالي 90 درجة مئوية) و T كحدأقصى (بين 5−30 دقيقة) إيجابية بالنسبة إلى السالمونيلا.

النتائج

الشكل 2 والشكل 3 تظهر الرسوم البيانية المصابيح التمثيلية / الجداول المعروضة على كلا المنصات. في هذا تشغيل المصباح، عينات S1 إلى S6 هي 10 أضعاف التخفيفات التسلسلية من S. enterica serovar ATCC ATCC 51741 تتراوح بين 1.1 × 106 CFU إلى 11 CFU لكل رد فعل. السيطرة الإيجابية هو S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) في 1.7 × 104 CFU لكل رد فعل NTC هو المياه الصف الجزيئية.

كما هو مبين في الشكل 2E و 3G الشكل، كل من المجلس الوطني الانتقالي و آبار الكمبيوتر هي ضوابط صالحة. المجلس الوطني الانتقالي جيدا لديه T ماكس فارغة في حين أن T m هو < 83 درجة مئوية على لوحة أداة مصباح وفارغة في برنامج مصباح، مما يشير إلى نتيجة سلبية. الكمبيوتر جيدا لديه Tكحد أقصى من 7 دقيقة 45 ثانية و T م من ~ 90 درجة مئوية على كلا المنصات، مما يشير إلى نتيجة إيجابية. عينات S1 إلى S6 لديها Tكحد أقصى بين 6 دقيقة 30 ثانية و 12 دقيقة 15 ثانية، وكلها السالمونيلا-إيجابية.

بعد تشغيل مكررة من نفس المجموعة من العينات، يتم الإبلاغ عن نتائج المصباح النهائية لهذه العينات. هذا التمثيل مصباح تشغيل يبين أن المصباح يكشف بنجاح السالمونيلا مع مجموعة واسعة من التركيزات في العينات.

figure-results-1
الشكل 2: عرض نتائج المصباح التمثيلية على لوحة أداة LAMP. (A) تعرض علامة التبويب الملف الشخصي ملف درجة الحرارة المبرمج. (B) علامة التبويب درجة الحرارة يظهر درجات الحرارة الفعلية في الآبار عينة كما امبال رد فعل العائدات. (C) علامة التبويب التضخيم يظهر قراءات الفلوريسنس أثناء تضخيم المصباح. (D)علامة التبويب الـ Anneal تظهر التغيرات في الفلور (المشتق) خلال مرحلة الـ(هابل). (E) تظهر علامة التبويب "النتائج" طريقة عرض جدولية لنتائج المصباح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 3: نتائج المصابيح التمثيلية التي يتم عرضها في برنامج LAMP. (A) تعرض علامة التبويب الملف الشخصي ملف درجة الحرارة المبرمج. (B) علامة التبويب درجة الحرارة يظهر درجات الحرارة الفعلية في الآبار عينة كما امبال رد فعل العائدات. (C) علامة التبويب التضخيم يظهر قراءات الفلوريسنس أثناء تضخيم المصباح. (D) علامة التبويب معدل التضخيم يظهر التغيرات في الفلوريسنس (نسبة الفلوريسين) أثناء تضخيم المصباح. (E) علامة التبويب الـ Anneal تعرض قراءات الفلورانس أثناء مرحلة الوَل. (F) علامة التبويب مشتقة الولاي تظهر التغيرات في الفلور (المشتق) خلال المرحلة اللدّية. (G) تظهر علامة التبويب النتيجة عرض جدولي لنتائج المصباح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

لقد قدمنا هنا بسيطة وسريعة ومحددة ، وطريقة حساسة لفرز و تأكيد السالمونيلا في الغذاء الحيواني والثقافة النقية ، على التوالي. مع الراحة من مزيج سيد isothermal الذي يحتوي على أربع الكواشف الرئيسية، وجاهزة للاستخدام، في المنزل إعداد مزيج التمهيدي، وتجميع رد فعل مصباح يتطلب سوى بضع خطوات pipetting (الشكل 1). إجمالي وقت التشغيل بما في ذلك التضخيم ومراحل الثني أقل من 38 دقيقة(الشكل 2A، B والشكل 3A، B). يتم رصد النتائج الإيجابية عن طريق الفلورسينس في الوقت الحقيقي (الشكل 2C والشكل 3C, D) ويمكن الكشف عنها في وقت مبكر من 5 دقيقة26. الطور الهاد بمثابة تأكيد إضافي خصوصية مصباح حيث أن العينات التي اُصيبت بـ Tm (حوالي 90 درجة مئوية) يتم الإبلاغ عنها على أنها إيجابية(الشكل 2D و E والشكل 3E−G). وقد تم الإبلاغ عن حساسيات من 1 خلية السالمونيلا في الثقافة النقية < 1 CFU/25 ز في الغذاء الحيواني سابقا26.

كما مصباح فعالة جدا ويولد كمية كبيرة من الحمض النووي1، فمن الأهمية بمكان أن يتم استخدام أفضل الممارسات المختبرية لمنع التلوث المتبادل ، والتي قد تشمل فصل جسديا المناطق اللازمة لإعداد المزيج الرئيسي مصباح وإضافة قوالب الحمض النووي ، وتجنب توليد الهباء الجوي ، وذلك باستخدام نصائح ماصة مرشح ، وتغيير القفازات في كثير من الأحيان ، والامتناع عن فتح ردود فعل المصباح بعد التضخيم.

وقد سبق اختبار خصوصية هذا الأسلوب لمبة السالمونيلا باستخدام 300 سلالات بكتيرية (247 السالمونيلا من 185 سيروفارس و 53 غيرالسالمونيلا)و أظهرت أن 100٪ محددة26. وتجدر الإشارة إلى أن الاختلافات الكبيرة في Tماكس لوحظ بين نوعي السالمونيلا، S. enterica وبونغوري السالمونيلا، وبين الأنواع الفرعية S. enterica، وخاصة subsp. أريزونا (IIIa)26. ومع ذلك، كانت هذه النتائج الإيجابية لا تزال صالحة وفقا لقواعد لتفسير نتائج مصباح. في دراستنا التعاونية متعددة المختبرات في الغذاء الكلب الجاف التي شملت 14 المحللين19، وعينات وجود نتائج غير متناسقة في تشغيل مصباح مكررة لوحظت أحيانا. هذه عادة ما تنطوي على عينات مع نتائج إيجابية متأخرة (Tmax > 15 دقيقة). تكرار كلا تشغيل بشكل مستقل عادة حل المشكلة. أكثر نادرا، لاحظنا عينات مع Tم الصحيح ولكن لا أو غير منتظمة Tالقيم القصوى (< 5 دقيقة). وعادة ما يكون هذا بسبب فقاعات الهواء في أنبوب رد الفعل.

طوال دورة حياة تطوير الأسلوب LAMP ، والتقييم ، والدراسات قبل الدراسة ، والتحقق من صحة المختبرات المتعددة ، لاحظنا تحملًا عاليًا من LAMP إلى مثبطات في مختلف المواد الغذائية الحيوانية أو مصفوفات الطعام ووسائل الإعلام الثقافية4،19،22،23،24، تسليط الضوء على قوة الطريقة والتعاون في العديد من الدراسات الأخرى على نطاق عالمي8. وهذا أعلى بالمقارنة مع PCR أو PCR في الوقت الحقيقي، الأمر الذي يتطلب عادة مراقبة التضخيم الداخلية لضمان أن النتائج السلبية ليست بسبب تثبيطمصفوفة 28. وعلاوة على ذلك، أظهر مصباح مماثلة (أو متفوقة) خصوصية وحساسية مقارنة PCR أو PCR في الوقت الحقيقي في الغالبية العظمى من الدراسات8. تكلفة كاشفات مصباح هو في حوالي 1 دولار لكل رد فعل. أجهزة LAMP المستخدمة في هذا البروتوكول هي صغيرة ومنخفضة الصيانة والمحمولة. ويمكن التعامل مع أي طريقة التضخيم متساوي الحرارة التي تستخدم الكشف عن الهدف عن طريق قياس الفلورانس، وشملت مصباح. باستخدام برنامج LAMP، يمكن إنشاء تقارير شاملة بتنسيق متعدد (pdf، نص، وصورة).

التحقق من صحة الأسلوب هو خطوة هامة قبل أن يمكن اعتماد أسلوب جديد للاستخدام الروتيني. ومن الجدير بالذكر أن بروتوكول المصابيح المبلغ عنها هنا قد أكمل بنجاح التحقق من صحة المختبرات المتعددة19. مع دمج مؤخرا هذا البروتوكول مصباح في الولايات المتحدة FDA في BAM الفصل 5 السالمونيلا27, ومن المتوقع أن الطريقة سوف تكسب استخدام أوسع بكثير, سواء كوسيلة للفحص السريع في الغذاء الحيواني وكوسيلة تأكيد موثوق بها لعزلات السالمونيلا المفترضة من جميع فئات الغذاء.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة. الآراء التي تم التعبير عنها في هذه المخطوطة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة السياسة الرسمية لوزارة الصحة والخدمات الإنسانية، أو إدارة الغذاء والدواء الأمريكية، أو الحكومة الأميركية. لا تشكل الإشارة إلى أي مواد أو معدات أو عملية تجارية بأي شكل من الأشكال موافقة أو موافقة أو توصية من إدارة الغذاء والدواء.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون أعضاء اللجنة الفرعية للتحقق من صحة أساليب الميكروبيولوجيا (MMVS) في إدارة الأغذية والعقاقير ومجلس دليل التحليل البكتريولوجي (BAM) على المراجعة النقدية لدراسات التحقق من طريقة السالمونيلا مصباح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرق تسريب قلب الدماغ (BHI)تشخيص BD ، سباركس ، MD299070نمو سائل يستخدم في زراعة السالمونيلا.
مياه الببتون المخزنة (BPW)BD ، Sparks ، MD218105وسيط التخصيب المسبق لاستعادة السالمونيلا من عينات الأغذية الحيوانية.
DNA AWAYThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA7010يزيل الحمض النووي و DNase غير المرغوب فيهم من مقاعد المختبر والأواني الزجاجية والأواني البلاستيكية دون التأثير على عينات الحمض النووي اللاحقة.
برنامج Genie ExplorerOptiGene Ltd. ، West Sussex ، المملكة المتحدةالإصدار 2.0.6.3يدعم التشغيل عن بعد لأدوات Genie بما في ذلك تشغيل LAMP وتحليل البيانات.
Genie II أو Genie III (أداة LAMP )OptiGene Ltd. ، غرب ساسكس ، المملكة المتحدةGEN2-02 أو GEN3-02أداة صغيرة قادرة على التحكم في درجة الحرارة حتى 100 درجة ؛ C مع ± 0.1 درجة ؛ دقة C والكشف المتزامن عن التألق عبر قناة FAT. يحتوي Genie II على كتلتين (A و B) مع 8 عينات في كل كتلة. يحتوي Genie III على كتلة واحدة تستوعب 8 عينات.
شريط الجنيOptiGene Ltd. ، غرب ساسكس ، المملكة المتحدةOP-0008شرائط أنابيب دقيقة ذات 8 آبار مع أغطية قفل متكاملة وحجم عمل من 10 إلى 150 ميكرو.
حامل شريط GenieOptiGene Ltd. ، غرب ساسكس ، المملكة المتحدةGBLOCKيستخدم لحمل شرائط Genie عند إعداد تفاعل LAMP ، ويمكن أيضا استخدام حامل الألمنيوم ككتلة باردة.
محلول حمض الهيدروكلوريك (HCl) ، 1 NThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MASA48-500يضبط درجة الحموضة في عينات الأغذية الحيوانية بعد إضافة BPW وقبل التخصيب بين عشية وضحاها.
كتلة حراريةThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA88-860-022يسخن العينات عند 100 & plusmn; 1 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي.
حاضنةThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA3960حاضنة مختبر قياسية.
ISO-001 مزيج رئيسي متساوي الحرارةOptiGene Ltd. ، غرب ساسكس ، المملكة المتحدةISO-001مزيج رئيسي محسن لتبسيط تجميع تفاعل LAMP ، يحتوي على جزء كبير من بوليميراز الحمض النووي GspSSD الذي يزيح الخيوط من Geobacillus spp. ، بيروفوسفاتيز غير عضوي قابل للحرارة ، عازلة للتفاعل ، MgSO4 ، dNTPs ، وصبغة ربط الحمض النووي مزدوجة الشريطة (قناة الكشف عن FAM).
يقوم IsopropanolThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MAA416بتطهير أسطح العمل.
بادئات LAMPIntegrated DNA Technologies Inc. ، Coralville ، IAبادئات LAMP مخصصةمع معلومات مفصلة في الجدول 1.
أجهزة الطرد المركزي الدقيقةEppendorf أمريكا الشمالية ، Hauppauge ، نيويورك22620207MiniSpin بالإضافة إلى أجهزة الطرد المركزي الدقيقة الشخصية.
أنابيب الطرد المركزي الدقيقةThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA05-408-129أنابيب الطرد المركزي الدقيقة القياسية.
المياه من الدرجة الجزيئيةThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MAAM9938تستخدم في صنع مخزونات التمهيدي ، ومزيج التمهيدي ، ومزيج تفاعل LAMP
محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، 1 NThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MASS266-1يضبط درجة الحموضة في عينات الأغذية الحيوانية بعد إضافة BPW وقبل التخصيب طوال الليل.
أجار غير انتقائي (على سبيل المثال ، أجار الدم ، أجار المغذيات ، وأجار الصويا التربتيكاز)ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، MAR01202وسط نمو صلب يستخدم في زراعة السالمونيلا.
أنظمة تشخيص مياه الببتون BD ، سباركس ، دكتوراه في الطب218071يخفف مزارع السالمونيلا بين عشية وضحاها لتكوين الحمض النووي للتحكم الإيجابي.
الماصات والأطرافMettler-Toledo Rainin LLC, سلسلة Oakland CAPipet Lite LTSماصات وأطراف مختبرية قياسية.
كاشف تحضير العينة PrepMan UltraThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA4318930مجموعة بسيطة تستخدم للتحضير السريع لقوالب الحمض النووي لاستخدامها في تفاعل LAMP
سلالة السالمونيلا المرجعية LT2ATCC ، Manassas ، VA700720سلالة السالمونيلا المرجعية المستخدمة كتحكم إيجابي.
مرق الصويا Trypticase (TSB)BD Diagnostic Systems ، Sparks ، MD211768وسط نمو سائل يستخدم في زراعة السالمونيلا.
خلاط دوامةScientific Industries، Inc. ، Bohemia ، NYSI-0236خلاط دوامة مختبر قياسي.
كيس فلتر دوامةNasco Sampling Brand ، Fort Atkinson ، WIB01318أكياس التصفية لحمل عينات الأغذية الحيوانية للتخصيب المسبق.
أنظمة وسط أنظمة تشخيص باك

المراجع

  1. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).
  2. Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).
  3. Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
  4. Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).
  5. Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).
  6. Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).
  7. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  8. Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).
  9. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).
  10. Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).
  11. Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).
  12. WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).
  13. Kundapur, R. R., Nema, V. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110(2016).
  14. WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).
  15. FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).
  16. FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).
  17. Bird, P., et al. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).
  18. D'Agostino, M., et al. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).
  19. Ge, B., et al. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562(2019).
  20. D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).
  21. Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).
  22. Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).
  23. Yang, Q., Chen, S., Ge, B. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).
  24. Yang, Q., et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).
  25. Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112(2016).
  26. Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).
  27. Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).
  28. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

invA
Loop-بوساطة التضخيم متساوي الحرارة لفحص السالمونيلا في الغذاء الحيواني وتأكيد السالمونيلا من عزلة الثقافة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.