تؤدي الشاشة الجينية الأمامية المستندة إلى ارتفاع Ca2+ كمطالعة إلى تحديد المكونات الوراثية المشاركة في مسارات الإشارة المعتمدة على الكالسيوم في النباتات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إلى الأمام الشاشة الجينية باستخدام المعدلة وراثيا مراسل الكالسيوم أيكورين لتحديد أهداف جديدة في إشارات الكالسيوم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وكانت الشاشات الجينية الأمامية أدوات هامة في تحديد المكونات الجينية التي تنطوي عليها عدة مسارات بيولوجية غير متحيزة. أساس الشاشة هو توليد السكان المتحولين التي يمكن فحصها مع النمط الظاهري من الفائدة. EMS (سلفونات الميثان الإيثيلي) هو عامل الألكيلات الشائع الاستخدام لتحفيز الطفرة العشوائية في شاشة جينية أمامية كلاسيكية لتحديد جينات متعددة تشارك في أي عملية معينة. السيتوسوليك الكالسيوم (كاليفورنيا2+) ارتفاع هو مفتاح في وقت مبكر من مسار الإشارات التي يتم تنشيطها على الإدراك الإجهاد. ومع ذلك، فإن هوية المستقبلات والقنوات والمضخات وناقلات كاليفورنيا2+ لا تزال بعيدة المنال في العديد من أنظمة الدراسة. Aequorin هو بروتين مراسل الكالسيوم الخلوي المعزول من Aequorea فيكتوريا وsquly أعرب في arabidopsis. استغلال هذا، قمنا بتصميم شاشة الجينية إلى الأمام التي نحن EMS-mutagenized aequorin المعدلة وراثيا. جمعت البذور من النباتات متحولة ([م1و1و1') وفرز لل نوع ظاهريّة الفائدة كان نفذت في الفصل ([م2و2و2و2]." باستخدام بروتوكول قياس 96-77777777776-77766676-77766666766-7006، يمكن التعرف على العديد من المسوخ الجديدة التي لها استجابة مختلفة من الكالسيوم ويتم قياسها في الوقت الحقيقي.2+ يتم إنقاذ المسوخ مع النمط الظاهري من الفائدة ونشرها حتى يتم الحصول على سكان النباتات متحولة homozygous. يوفر هذا البروتوكول طريقة للشاشات الجينية الأمامية في Ca2+ خلفية مراسل وتحديد أهداف رواية Ca2+ المنظمة.
المقدمة
وهناك تغيير في الكالسيوم السيتوسوليك (كاليفورنيا2 +) تركيز على إدراك من التحفيز الحيوي أو اللاأحيائي هو جيد درس مبكر إشارة الحدث الذي ينشط العديد من مسارات الإشارات1,2,3,4. وهناك خلية في حالته الراحة القاعدية يحافظ على أقل Ca2 + التركيز في السيتوسول وعزلات الزائد Ca2 + في مختلف العضيات داخل الخلايا وapoplast خارج الخلية مما يؤدي إلى حاد كاليفورنيا2 + التدرج5,6. عند إدراك الإشارة ، ترتفع مستويات Ca2+ في السيتوسول بسبب تدفق Ca....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1- تَمَتَّسُ تكوين نظم الإدارة البيئية وجمع البذور الأحادية النسب (1-3 أشهر)
- تزن 150 ملغ من البذور (~ 7500) من أيكورين لEMS mutagenesis (م0 البذور). تزن آخر 150 ملغ من البذور لاستخدامها كتحكم.
- نقل البذور إلى أنبوب 50 مل وإضافة 25 مل من 0.2٪ EMS (الخامس / الخامس) (تنبيه) (للعلاج) أو 25 مل من الماء autoclaved (للسيطرة).
ملاحظة: سلفونات الإيثيل - الميثان هي عامل كيميائي في عملية التكاء في المواد النباتية. - ختم الأنبوب مع parafilm والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم. قم بتدوير الأنبوب من النهاية إلى النهاية لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- السماح للبذور لتسوية. إزالة حل EMS بعناية والتخلص في حاوية النفايات التي تحتوي على....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم فحص السكان EMS لH2O2 الناجمة عن ارتفاع كاليفورنيا2+ . وكما نوقش آنفاً، تم فحص 12 شتلة من M2 من كل خط M1. في الشكل 3، يتم رسم خط M1 واحد مع كل لوحة تظهر 12 شتلة M2 فردية. ويستخدم أيكورين البرية من نوع كتحكم في مقارنة وتقييم استجابة متحولة. المتحول المتنحية يفصل في نسبة 1:7 (متحولة: غير متحولة). عند فحص 12 شتلة فردية لكل خط M1 ، يمكننا تحديد 1 أو 2 طفرات لكل خط. لقد حددنا 2 المسوخ المفترضة من 12 M2<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إن الطفرات التي تُنتج في نظام الإدارة البيئية هي أداة قوية لتوليد الطفرات في عدد السكان. كانت الشاشات الجينية الأمامية الكلاسيكية باستخدام نظام الإدارة البيئية أداة فعالة لتحديد الجينات الجديدة لسببين رئيسيين: أولاً، أنها لا تتطلب أي افتراضات مسبقة حول هوية الجينات، وثانياً، أنها لا تقدم أي تحيز. هناك عدة طرق لتوليد مجموعات فحص مثل EMS ، وإدخالات T-DNA ، والإشعاعات وما إلى ذلك. من بين جميع الطرق، فإن الطفرات القائمة على نظام الإدارة البيئية لديها مزايا قليلة على الطرق الأخرى. أولاً، من الأسهل توليد مجموعة من المتحولين عن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يوجد لدى أي من أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح يعلنه.
شكر وتقدير
نشكر المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي - مرفق Phytotron لنمو النبات ، وبومباي المحلية لتصوير الفيديو ، وإدارة التكنولوجيا الحيوية - eLibrary كونسورتيوم لتوفير الوصول إلى الموارد الإلكترونية. وقد دعم هذا العمل من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية، الهند من خلال المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي منحة الأساسية، ماكس بلانك Gesellschaft الهند شريك برنامج المجموعة; و CSIR-جونيور زمالة البحث (لD.M و S.M) وقسم التكنولوجيا الحيوية - زمالة البحوث المبتدئين (إلى R.P).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 24 لوحة زراعة أنسجة البئر | Jetbiofil | 11024 | لزراعة الشتلات |
| 96 صفيحة بيضاء بئر صفيحة | حرارية علمية | 9502887 | لقياسات مقياس الإضاءة |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem الهند | لنمو | |
| النبات كلوريد الكالسيوم | فيشر Scientific | 12135 | للتفريغ الحل |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | مجموعة الأطراف الاصطناعية ل aequorin |
| Ehtylmethane سلفونات | Sigma Aldrich | M0880-5G | لتكوين البذور |
| التحليلي للإيثانول | الكاشف التحليلي | 1170 | لمحلول التفريغ |
| حمض الهيدروكلوريك | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | محلول التعقيم |
| بيروكسيد الهيدروجين | فيشر ساينتفيك | 15465 | كمحفز لارتفاع الكالسيوم |
| صعود لومينوسكان | قياس | تلألؤ 5300172 إيكورين | |
| MES عازلة | هيميديا | RM1128-100G | نمو النبات |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | نمو النبات |
| هيدروكسيد الصوديوم | فيشر Scientific | 27805 | لتحييد EMS |
| هيبوكلوريت الصوديوم | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | محلول التعقيم |
| ثيوكبريتات الصوديوم | فيشر Scientific | 28005 | لغسل البذور في الخطوة 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | لنمو النبات | |
| الأواني المربعة | Lab Chem India | لنمو النبات | |
| السكروز | سيجما ألدريتش | S0389 | نمو النبات |
| Taxim | Alkem | 7180720 | لإنقاذ الشتلات |
المراجع
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
