يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إلى الأمام الشاشة الجينية باستخدام المعدلة وراثيا مراسل الكالسيوم أيكورين لتحديد أهداف جديدة في إشارات الكالسيوم

7.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61259

⸱

أغسطس 1, 2020

 ,  ,  , 
1National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg, New Delhi 110067, India

في هذه المقالة

ملخص

تؤدي الشاشة الجينية الأمامية المستندة إلى ارتفاع Ca2+ كمطالعة إلى تحديد المكونات الوراثية المشاركة في مسارات الإشارة المعتمدة على الكالسيوم في النباتات.

الملخص

وكانت الشاشات الجينية الأمامية أدوات هامة في تحديد المكونات الجينية التي تنطوي عليها عدة مسارات بيولوجية غير متحيزة. أساس الشاشة هو توليد السكان المتحولين التي يمكن فحصها مع النمط الظاهري من الفائدة. EMS (سلفونات الميثان الإيثيلي) هو عامل الألكيلات الشائع الاستخدام لتحفيز الطفرة العشوائية في شاشة جينية أمامية كلاسيكية لتحديد جينات متعددة تشارك في أي عملية معينة. السيتوسوليك الكالسيوم (كاليفورنيا2+) ارتفاع هو مفتاح في وقت مبكر من مسار الإشارات التي يتم تنشيطها على الإدراك الإجهاد. ومع ذلك، فإن هوية المستقبلات والقنوات والمضخات وناقلات كاليفورنيا2+ لا تزال بعيدة المنال في العديد من أنظمة الدراسة. Aequorin هو بروتين مراسل الكالسيوم الخلوي المعزول من Aequorea فيكتوريا وsquly أعرب في arabidopsis. استغلال هذا، قمنا بتصميم شاشة الجينية إلى الأمام التي نحن EMS-mutagenized aequorin المعدلة وراثيا. جمعت البذور من النباتات متحولة ([م1و1و1') وفرز لل نوع ظاهريّة الفائدة كان نفذت في الفصل ([م2و2و2و2]." باستخدام بروتوكول قياس 96-77777777776-77766676-77766666766-7006، يمكن التعرف على العديد من المسوخ الجديدة التي لها استجابة مختلفة من الكالسيوم ويتم قياسها في الوقت الحقيقي.2+ يتم إنقاذ المسوخ مع النمط الظاهري من الفائدة ونشرها حتى يتم الحصول على سكان النباتات متحولة homozygous. يوفر هذا البروتوكول طريقة للشاشات الجينية الأمامية في Ca2+ خلفية مراسل وتحديد أهداف رواية Ca2+ المنظمة.

المقدمة

وهناك تغيير في الكالسيوم السيتوسوليك (كاليفورنيا2 +) تركيز على إدراك من التحفيز الحيوي أو اللاأحيائي هو جيد درس مبكر إشارة الحدث الذي ينشط العديد من مسارات الإشارات1,2,3,4. وهناك خلية في حالته الراحة القاعدية يحافظ على أقل Ca2 + التركيز في السيتوسول وعزلات الزائد Ca2 + في مختلف العضيات داخل الخلايا وapoplast خارج الخلية مما يؤدي إلى حاد كاليفورنيا2 + التدرج5,6. عند إدراك الإشارة ، ترتفع مستويات Ca2+ في السيتوسول بسبب تدفق Ca2 + من مصادر خارج الخلية و / أو داخل الخلايا وتولد توقيع الكالسيوم محدد من المحفزات7،8،9. Ca2+ يتم تنشيط الارتفاعات في السيتوسول من قبل العديد من المحفزات، ولكن يتم الحفاظ على خصوصية من قبل مخازن متميزة الافراج عن كاليفورنيا2+، فريدة من نوعها كاليفورنيا2 + توقيع وبروتينات الاستشعار المناسبة10،11.

إن استخدام عامل الألكيلات، سلفونات الإيثيل-الميثان (EMS) في الطفرات الجينية هو أداة قوية في الشاشات الجينية الأمامية الكلاسيكية لتحديد الجينات المستقلة المتعددة المشاركة في العملية. EMS هو مطفرة كيميائية في الغالب تحفيز C إلى T و G إلى A التحولات بشكل عشوائي في جميع أنحاء الجينوم وتنتج 1 BP تغيير في كل 125 كيلوبايت من الجينوم. سوف EMS الطفرات تحفز التغييراتدلفين 1000 قاعدة واحدة، إما الإدراج / الحذف (InDel) أو متعددة الأشكال النوكليوتيد واحد (SNP) لكل الجينوم12. الطفرات الناجمة عن EMS هي طفرات متعددة نقطة مع تردد طفرة تتراوح بين 1/300 إلى 1/30000 لكل مكان. وهذا يقلل من عدد النباتات M1 اللازمة للعثور على طفرة في جين معين. ويستخدم عادة مجموعة من السكان البذور M1 من 2000-3000 للحصول على طفرات من الاهتمام في Arabidopsis ثالينا13,14.

Aequorin هي aequorin transgenics arabidopsis Columbia-0 (Col-0) النباتات ecotype التي تعبر عن p35S-apoaequorin (pMAQ2) في cytosol15. أيكورين هو بروتين Ca2+ ملزم يتكون من أبوبروتين ومجموعة اصطناعية تتكون من جزيء لوسيفيرين، coelenterazine. إن ربط Ca2+ إلى aequorin ، الذي يحتوي على ثلاثة مواقع CA2 + ملزمة EF-hands ، يؤدي إلى coelenterazine يتم أكسدةه وcyclized لإعطاء dioxetanone الوسيط ، يليه تغيير في التشكل من البروتين مصحوبًا بإطلاق ثاني أكسيد الكربون وكويليناراميد وحيد متحمس16. coelenteramide حتى تنتج تنبعث منها الضوء الأزرق (λماكس، 470 نانومتر) التي يمكن الكشف عنها من قبل17luminometer. وهكذا يمكن قياس الارتفاعات Ca2+ السريعة للغاية في الوقت الفعلي، واستغلالها للشاشات الجينية السريعة إلى الأمام. يهدف هذا البروتوكول إلى استخدام خصوصية استجابة الكالسيوم لتحديد اللاعبين الرئيسيين رواية التي تشارك في التوقيع Ca2+ . لتحقيق هذه المهمة، ونحن نستخدم EMS mutagenesis في aequorin المعدلة وراثيا وتحديد SNPs المرتبطة تغيير Ca2+ الإشارات. يحدد البروتوكول المسوخ التي لا تظهر أي ارتفاعات Ca2+ أو تخفضها عند إضافة المحفزات. ويمكن بعد ذلك تعيين هذه المسوخ لتحديد الجينات المسؤولة عن استجابة Ca2+ . الطريقة قابلة للتطبيق على أي نوع من المحفزات السائلة في النباتات التي تؤدي إلى ارتفاع كاليفورنيا2+ . منذ كاليفورنيا2 + الارتفاع هي واحدة من الاستجابات الأولى في مسار إشارة الدفاع النباتية، وتحديد مكونات استجابة المنبع يمكن أن توفر المرشحين للهندسة الوراثية لتطوير النباتات مرنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1- تَمَتَّسُ تكوين نظم الإدارة البيئية وجمع البذور الأحادية النسب (1-3 أشهر)

  1. تزن 150 ملغ من البذور (~ 7500) من أيكورين لEMS mutagenesis (م0 البذور). تزن آخر 150 ملغ من البذور لاستخدامها كتحكم.
  2. نقل البذور إلى أنبوب 50 مل وإضافة 25 مل من 0.2٪ EMS (الخامس / الخامس) (تنبيه) (للعلاج) أو 25 مل من الماء autoclaved (للسيطرة).
    ملاحظة: سلفونات الإيثيل - الميثان هي عامل كيميائي في عملية التكاء في المواد النباتية.
  3. ختم الأنبوب مع parafilm والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم. قم بتدوير الأنبوب من النهاية إلى النهاية لمدة 18 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. السماح للبذور لتسوية. إزالة حل EMS بعناية والتخلص في حاوية النفايات التي تحتوي على 1 M NaOH في وحدات تخزين متساوية (NaOH يساعد على تحييد / تعطيل EMS مما يجعلها آمنة للتخلص). تجاهل البلاستيك المستخدمة في محلول 1 M NaOH.
    ملاحظة: بعد 24 ساعة، تخلص من المرتجعات وفقاً لممارسات مختبر المواد الخطرة.
  5. اغسل البذور المُمَتَمَّعة تمامًا مع 40 مل من الماء المُقلَد ذاتيًا 8 مرات على الأقل. تخلص EMS تحتوي على المياه في حاوية نفايات NAOH كما ذكر أعلاه.
  6. لغسل النهائي، إضافة 40 مل من 100 mM ثيوسلفات الصوديوم وشطف 3 مرات لإزالة آثار EMS.
  7. نقع البذور في 40 مل من الماء autoclaved ل ~ 1 ح لنشر EMS من البذور ومن ثم وضعها على ورقة مرشح حتى يجف تماما.
  8. نقل البذور إلى أنبوب microcentrifuge وطبقة البذور في 4 درجة مئوية في 40 مل من المياه autoclaved لمدة 2-4 أيام. وهذا يساعد في كسر النوم البذور ويضمن النمو متجانسة.
  9. نقل كل من البذور المطفرة (M0)والبذور التحكم على التربة (تكوين التربة: الزراعية: تربة، 1:1) ونقلها إلى غرف النمو مع 16 ساعة ضوء/ 8 ساعة ضوئية داكنة، وكثافة خفيفة من 150 ميكرومول •m−2•s −1 و ~ 70٪ الرطوبة النسبية.
  10. لتحديد ما إذا كان الطفرات قد نجحت، ابحث عن انخفاض سرعة الإنبات ونمو الشتلات، وقطاع الكلوروفير18 (الشكل 1A). قارن النباتات المطفرة مع النباتات التحكم لتحديد هذه الاختلافات الفسيولوجية والتنموية.
    ملاحظة: يمكن استخدام طرق مختلفة لحصاد البذور من النباتات M1. في هذا البروتوكول، استخدمنا أسلوب تجميع البذور أحادي النسب المستندة. كل مصنع M1 يعطى رقما فريدا، بدءا من A1 إلى A3500.
  11. الحفاظ على النباتات المرقمة بشكل فردي كلخطوط نباتية منفصلة (الشكل 1B).
  12. عند النضج، حصاد البذور من هذه النباتات متحولة الفردية وتخزينها على النحو الفردية خطوط M1 (الشكل 2). من مجموعة البذور على أساس نسب واحد، حصلنا على حوالي 5000 M1 خطوط من الذي تم فحص 3500 M1 خطوط.

2. فحص عالي الإنتاجية لتحديد المسوخ (8 أشهر)

  1. تحديد المسوخ الجديدة على أساس استجابة Ca2+ إلى حافز مختار. هنا، استخدمنا H2O2 كمثال.
  2. لتحديد المسوخ، قم بفحص الجيل M2. منذ المسوخ المتنحية فصل في 1/8 تردد في M2 جيل على EMS mutagenesis14، فحص 8-12 M2- تغطي النباتات الفصل واحد M1 خط ويحدد متحولة متجانسة homozygous (باستخدام 12 شتلة يزيد من احتمال العثور على متحولة). من كل خط M1 مستقل، اختبار 12 M2 الشتلات لCa2+ استجابة لH2O2 (12 M2 الشتلات لكل خط M1).
  3. استخدام عالية الإنتاجية التعقيم البذور والزراعة المائية بروتوكول نمو النباتات19. ضع ما يقرب من 12-15 M2 البذور لكل M1 خط في الآبار الفردية من 24 بئرا النسيج لوحة الثقافة وتعقيم باستخدام غاز الكلور (40 مل من 12٪ هيبوكلوريت الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك، 3:1، v / الخامس) في desiccator لمدة 4 ساعة في غطاء الدخان. بعد الإجراء، افتحي جهاز الـ 1000 واتركيه بين عشية وضحاها ليتبخر غاز الكلور.
  4. بعد التعقيم، وجلب لوحات خارج وإضافة السائل 1/2 وسائل الإعلام MS (MS نصف قوة دون أجار) إلى الآبار الفردية. ختم لوحات مع parafilm وطبقات البذور لمدة 2-4 أيام في 4 °C ثم نقل البذور إلى غرفة النمو مع 10 ساعة خفيفة / 14 ساعة photoperiod الظلام في 20-22 درجة مئوية مع 70٪ الرطوبة النسبية.
  5. مرة واحدة الشتلات هي 8-12 يوما من العمر، مكان 12 M2 الشتلات من كل خط على حدة في لوحة مضيئة 96-جيدا. لقياس استجابة Ca2+ إلى H2O2، استخدم قارئ لوحة مضيئة.
  6. بعد نقل الشتلات، إضافة 150 ميكرولتر من 5-10 ميكرومتر محلول coelentrazine (المخفف في الماء المذاب من مخزون 5 mM في الميثانول) (تنبيه) في الآبار الفردية في منطقة مظلمة / منخفضة الإضاءة وتخزينها في الظلام في 21 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
    ملاحظة: Coelentrazine هي مجموعة اصطناعية تربط بـ apo-aequorin وتُعيد تشكيلها إلى الأيكورين الوظيفي. Coelentrazine هو ضوء حساس ومن ثم يتم تخزينها في زجاجات داكنة اللون، محمية من الضوء.
  7. في اليوم التالي، قم بأداء شاشة متحولة باستخدام 10 mM H2O2 كحافز وقياس استجابة Ca2+ اللاحقة.
  8. وللت وقياس 24 بئرًا في وقت واحد، أنشئ برنامجًا حركيًا آليًا يقيس الخلفية لمدة دقيقة، يليه إضافة منبهات (40 ميكرولتر) وقياس 10 دقائق، يليه إجمالي تصريف الـequorin (2 M CaCl2 في 150 ميكرولتر 20٪ إيثانول) لمدة 1-2 دقيقة.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى التفريغ النهائي للـ aequorin الكلي لتحديد كمية درجة Ca2+ المقاسة والتحكم الإضافي للـ aequorin الوظيفية. التفريغ نهاية قصيرة من 1-2 دقيقة ولا يسبب وفاة النبات كبيرة. بدلا من ذلك، إذا كانت النباتات تموت بعد خطوة التفريغ، ثم إعادة فرز خط M1 محددة والإنقاذ دون تفريغ. ويمكن تأكيد هذه المسوخ في M3 و M4 الأجيال باستخدام خطوة التفريغ.
  9. استخدم طريقة مسح بتنسيق 24 بئرًا تقيس كل صف في فاصل زمني 7 s مع وقت تكامل 300 مللي ثانية لكل نقطة قياس. استخدام شتلة من نوع البرية كتحكم في كل صف للمقارنة والتقييم من متحولة.
    ملاحظة: ستغطي 96 بئرًا واحدة تحتوي على شتلات M2 8 خط M1 فردي (8 M1*12 = 96 M2)ويمكن فحصها في 2.5 ساعة وسيتم فحص 32 M1 خطوط في اليوم ، 640 M1 محطات في الشهر. يستغرق إجراء الفحص بالكامل بعد أن تصبح النباتات جاهزة حوالي 8 أشهر.
  10. تحديد المسوخ على أساس فقدان أو انخفاض استجابة كاليفورنيا2+ مع H2O2. إنقاذ المسوخ المختارة من خلال عملية غسل تعتمد على المضادات الحيوية. غسل الشتلات مع 25 ملغ / L محلول cefotaxime مرتين ثم نقل إلى وسط الإنقاذ الذي يحتوي على 25 ملغ / لتر cefotaxime في 1/2 MS agar.
  11. تنمو لوحات في ضوء 10 ساعة / 14 ساعة photoperiod الظلام للحصول على نبات متحولة. غسل cefotaxime يساعد على إزالة أي الكائنات الحية الدقيقة الضارة على الشتلات. منذ يتم الاحتفاظ بالشتلات بعد إعادة تشكيل غير مختومة، والحد من التلوث عند نقل مرة أخرى إلى حالة معقمة.
  12. نقل النبات متحولة إلى التربة للحصول على homozygous M3 السكان.

3 - تحليل البيانات وتحديد الهوية المتحولة (شهر إلى ثلاثة أشهر)

ملاحظة: القراءات المقدمة من الأسلوب أعلاه في وحدات الضوء النسبي (RLU).

  1. لحساب [Ca2+] تركيزالسيّدات، استخدم معادلة التركيز التالية20.
    pCa = 0.332588(−log (L/Lكحد أقصى))+ 5.5593
    التلألؤ التهم () ومجموع عدد المتبقية (كحد أقصى).
  2. قم بتحويل قيم pCa التي تم الحصول عليها إلى [Ca2+]قيمcyt في μM عن طريق الضرب في 106. ثم مؤامرة بيانيا ضد aequorin (المعدلة وراثيا كول-0 aequorin) السيطرة على تحديد المفترض H2س2 المسوخ إلى Ca2 + الاستجابة.
  3. شتلات الإنقاذ التي تظهر فقدان أو انخفاض الاستجابة إلى H2O2 تم إنقاذها.
  4. عند النضج، حصاد البذور من متحولة إنقاذها وإعادة فرز للاستجابة لH2O2 في الشتلات M3. إذا كانت جميع الشتلات 12 M3 تظهر استجابة كاليفورنيا2 + مماثلة للنبات الأم، والنظر في السكان أن تكون متجانسة M3 السكان متحولة. إذا لم تظهر جميع الشتلات 12 مثل هذا الرد، ثم تأخذهم إلى الجيل M4 وإعادة الشاشة للحصول على السكان homozygous.
  5. بمجرد الحصول على خط نبات متماثل ، حدد الجين الذي يؤدي إلى النمط الظاهري المتغير باستخدام تسلسل الجيل التالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم فحص السكان EMS لH2O2 الناجمة عن ارتفاع كاليفورنيا2+ . وكما نوقش آنفاً، تم فحص 12 شتلة من M2 من كل خط M1. في الشكل 3، يتم رسم خط M1 واحد مع كل لوحة تظهر 12 شتلة M2 فردية. ويستخدم أيكورين البرية من نوع كتحكم في مقارنة وتقييم استجابة متحولة. المتحول المتنحية يفصل في نسبة 1:7 (متحولة: غير متحولة). عند فحص 12 شتلة فردية لكل خط M1 ، يمكننا تحديد 1 أو 2 طفرات لكل خط. لقد حددنا 2 المسوخ المفترضة من 12 M2<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إن الطفرات التي تُنتج في نظام الإدارة البيئية هي أداة قوية لتوليد الطفرات في عدد السكان. كانت الشاشات الجينية الأمامية الكلاسيكية باستخدام نظام الإدارة البيئية أداة فعالة لتحديد الجينات الجديدة لسببين رئيسيين: أولاً، أنها لا تتطلب أي افتراضات مسبقة حول هوية الجينات، وثانياً، أنها لا تقدم أي تحيز. هناك عدة طرق لتوليد مجموعات فحص مثل EMS ، وإدخالات T-DNA ، والإشعاعات وما إلى ذلك. من بين جميع الطرق، فإن الطفرات القائمة على نظام الإدارة البيئية لديها مزايا قليلة على الطرق الأخرى. أولاً، من الأسهل توليد مجموعة من المتحولين عن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يوجد لدى أي من أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح يعلنه.

شكر وتقدير

نشكر المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي - مرفق Phytotron لنمو النبات ، وبومباي المحلية لتصوير الفيديو ، وإدارة التكنولوجيا الحيوية - eLibrary كونسورتيوم لتوفير الوصول إلى الموارد الإلكترونية. وقد دعم هذا العمل من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية، الهند من خلال المعهد الوطني لبحوث الجينوم النباتي منحة الأساسية، ماكس بلانك Gesellschaft الهند شريك برنامج المجموعة; و CSIR-جونيور زمالة البحث (لD.M و S.M) وقسم التكنولوجيا الحيوية - زمالة البحوث المبتدئين (إلى R.P).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
24 لوحة زراعة أنسجة البئرJetbiofil11024لزراعة الشتلات
96 صفيحة بيضاء بئر صفيحةحرارية علمية9502887لقياسات مقياس الإضاءة
Aequorin
AgropetLab Chem الهندلنمو
النبات كلوريد الكالسيومفيشر Scientific12135للتفريغ الحل
CoelenterazinePJK55779-48-1مجموعة الأطراف الاصطناعية ل aequorin
Ehtylmethane سلفوناتSigma AldrichM0880-5Gلتكوين البذور
التحليلي للإيثانولالكاشف التحليلي1170لمحلول التفريغ
حمض الهيدروكلوريكMerck Life Sciences1.93001.0521محلول التعقيم
بيروكسيد الهيدروجينفيشر ساينتفيك15465كمحفز لارتفاع الكالسيوم
صعود لومينوسكانقياستلألؤ 5300172 إيكورين
MES عازلةهيميدياRM1128-100Gنمو النبات
Murashige and skoog mediaHimediaPT021-25Lنمو النبات
هيدروكسيد الصوديومفيشر Scientific27805لتحييد EMS
هيبوكلوريت الصوديومMerck Life Sciences1.93607.5021محلول التعقيم
ثيوكبريتات الصوديومفيشر Scientific28005لغسل البذور في الخطوة 1.6
soilriteLab Chem Indiaلنمو النبات
الأواني المربعةLab Chem Indiaلنمو النبات
السكروزسيجما ألدريتشS0389نمو النبات
TaximAlkem7180720لإنقاذ الشتلات
الكاشف الحراري العلمي

المراجع

  1. Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
  2. Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
  3. Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
  4. Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
  5. White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
  6. Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162(2014).
  7. Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
  8. Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
  9. Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
  10. Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
  11. McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
  12. Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
  13. Koornneef, M. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. , Oxford University Press. 1-10 (2002).
  14. Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
  15. Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
  16. Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Running, M. , Humana Press. Totowa, NJ. 45-54 (2013).
  17. Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
  18. Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399(2015).
  19. Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
  20. Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
  21. Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
  22. Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394(2018).
  23. Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
  24. Maple, J., Moeller, S. G. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. Rosato, E. , 362(2007).
  25. Qu, L. J., Qin, G. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. 1062, (2014).
  26. Leyser, H. M. O., Furner, I. J. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). Flanders, D., Dean, C. , AFRC Plant Molecular Biology II Programme. Norwich: UK. 9-10 (1993).
  27. Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
  28. Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
  29. Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
  30. Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
  31. Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
  32. Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
  33. Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
  34. Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
  35. Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
  36. Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
  37. Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

EMS Arabidopsis thaliana
إلى الأمام الشاشة الجينية باستخدام المعدلة وراثيا مراسل الكالسيوم أيكورين لتحديد أهداف جديدة في إشارات الكالسيوم
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.