مقالة منهجية

بروتوكول محسن لتنقية ومباشرة أحادية الحيوية المؤتلف BDNF في أنبوب لدراسات الاتجار الخلوي في الخلايا العصبية

DOI:

10.3791/61262

⸱

يوليو 11, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Biological Sciences, Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, Center for Aging and Regeneration (CARE UC), Pontificia Universidad Católica de Chile, 3Institute of Biomedical Sciences. Faculty of Medicine and Faculty of Life Sciences, Universidad Andrés Bello, 4Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology and UK Dementia Research Institute at UCL, University College London Campus

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إنتاج BDNF المؤتلف الذي يحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi) في خلايا HEK293 بطريقة فعالة من حيث التكلفة ويتم تنقيته بواسطة الكروماتوغرافيا المتقاربة. ثم BDNFavi هو مباشرة أحادية الحيوية مع إنزيم BirA في أنبوب. يحتفظ BDNFavi و BDNFavi أحادية الفينيل البيولوجية بنشاطهم البيولوجي عند مقارنتها بـ BDNF المتوفرة تجاريًا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إنتاج BDNF المؤتلفة التي تحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi) في خلايا HEK293 ثم تنقيتها بفعالية من حيث التكلفة بواسطة الكروماتوغرافيا التقاربية. تم تطوير بروتوكول قابل للاستنساخ مباشرة أحادية أحادية BDNFAvi مع إنزيم BirA في أنبوب. في هذا التفاعل، يحتفظ BDNFAvi أحادية الحيوية بنشاطه البيولوجي.

تعتبر المغذيات العصبية عوامل نمو مشتقة من الأهداف تلعب دورًا في تطوير الخلايا العصبية وصيانتها. وهي تتطلب آليات نقل سريعة على طول المسار الداخلي للسماح بالإشارة لمسافات طويلة بين مقصورات الخلايا العصبية المختلفة. وقد مكن تطوير الأدوات الجزيئية لدراسة الاتجار بالعقاقير العصبية من التتبع الدقيق لهذه البروتينات في الخلية باستخدام في تسجيل الجسم الحي. في هذا البروتوكول، قمنا بتطوير إجراء الأمثل وفعالة من حيث التكلفة لإنتاج BDNF أحادية الحيوية. يتم إنتاج متغير BDNF المؤتلف الذي يحتوي على تسلسل أفيين قابل لاتينيلية (BDNFAvi) في خلايا HEK293 في نطاق ميكروغرام ثم تنقيته في إجراء قابل للتطوير بسهولة باستخدام الكروماتوغرافيا التقارب. ويمكن بعد ذلك تنقية BDNF تكون monotinylated متجانسة من خلال رد فعل مباشرة في المختبر مع انزيم BirA في أنبوب. يمكن أن يكون النشاط البيولوجي لBDNF أحادية الحيوية (mbtBDNF) مترافقة إلى streptavidin-الاقتران مع مختلف الفلوروفوريس. تحتفظ BDNFAvi و mbtBDNF بنشاطهما البيولوجي الذي تم إثباته من خلال الكشف عن الأهداف الفوسفورية المصبّعة باستخدام البقع الغربية وتفعيل عامل النسخ CREB على التوالي. باستخدام نقاط الكم streptavidin، كنا قادرين على تصور ميغابايتBDNF استيعابية بالتزامن مع تفعيل CREB، الذي تم الكشف عنه مع جسم مضاد محدد فوسفو-كريب. بالإضافة إلى ذلك ، mbtBDNF مترافق إلى نقاط الكم streptavidin كانت مناسبة لتحليل النقل الرجعي في الخلايا العصبية القشرية التي تزرع في غرف microfluidic. وهكذا، في أنبوب إنتاج mbtBDNF هو أداة موثوقة لدراسة الفسيولوجية الإشارات ديناميات endosome والاتجار في الخلايا العصبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية هي الوحدات الوظيفية للجهاز العصبي التي تمتلك مورفولوجيا معقدة ومتخصصة تسمح بالاتصال المتشابك ، وبالتالي ، فإن توليد السلوك المنسق والمعقد استجابة للمحفزات المتنوعة. الإسقاطات العصبية مثل dendrites والمحاور هي السمات الهيكلية الحرجة المشاركة في الاتصالات العصبية، وs neurotrophins هي اللاعبين الحاسمة في تحديد مورفولوجيا ودالة1. المغذيات العصبية هي عائلة من عوامل النمو المفرزة التي تشمل NGF، NT-3، NT-4، وعامل التغذية العصبية المستمدة من الدماغ (BDNF)2. في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تشارك BDNF في عمليات بيولوجية متنوعة بما في ذلك نقل الأعصاب ، التشجير ، نضوج العمود الفقري المتجني ، التقوية على المدى الطويل ، من بين أمور أخرى3،4. لذلك، BDNF يلعب دورا حاسما في تنظيم وظيفة الخلايا العصبية.

عمليات الخلوية المتنوعة تنظم ديناميات BDNF ووظيفته. على سطح الخلايا العصبية, BDNF يربط مستقبلات التروبوميوسين كيناز B (TrkB) و / أو مستقبلات المغذيات العصبية P75 (p75). يتم endocytosed BDNF-TrkB و BDNF-p75 complexs وفرزها في مختلف العضيات endocytic5,6,7,8. مطلوب الاتجار الصحيح داخل الخلايا من مجمع BDNF / TrkB لإشارات BDNF المناسبة في دوائر الخلايا العصبية المختلفة9,10,11. ولهذا السبب، فإن الفهم العميق لديناميات الاتجار بـ BDNF وتعديلاتها الموجودة في العمليات الفيزيولوجية المرضية أمر ضروري لفهم إشارات BDNF في الصحة والمرض. وسيساعد تطوير أدوات جزيئية جديدة ومحددة لرصد هذه العملية على دفع هذا المجال إلى الأمام والسماح بفهم أفضل للآليات التنظيمية المعنية.

هناك العديد من الأدوات المتاحة لدراسة الاتجار BDNF في الخلايا العصبية. تتضمن المنهجية الشائعة الاستخدام انتقال BDNF المؤتلف الموسومة بجزيئات الفلورسنت مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أو البديل أحادي الميل الفلوري الأحمر المتحول من GFP mCherry12،13. ومع ذلك، عيب كبير من إفراط BDNF هو أنه يلغي إمكانية تقديم تركيزات معروفة من هذا neurotrophin. أيضا، قد يؤدي إلى السمية الخلوية، الغموض تفسير النتائج14. استراتيجية بديلة هي transfection من TrkB الموسومة epitope، مثل العلم-TrkB. هذه المنهجية تسمح لدراسة TrkB ديناميات استيعاب15، لكنه ينطوي أيضا على transfection ، والتي قد تؤدي إلى تغيير وظيفة TrkB والسمية الخلوية. للتغلب على هذه العقبات المنهجية، تم تطوير المتغيرات المؤتلفة من NGF و BDNF التي تحتوي على تسلسل Avi (BDNFAvi)، والتي يمكن أن تكون أحادية البيوتينات بواسطة إنزيم بييرا ثنائيات البيوتين،16،17. يمكن أن يقترن BDNF المؤتلفة من الاقتران مع أدوات مختلفة مرتبطة بالسنتبيدين ، والتي تشمل الفلوروفهورات والخرز والجسيمات النانوية شبه المغناطيسية وغيرها للكشف عنها. من حيث التصوير الخلايا الحية، أصبحت النقاط الكمومية (QD) تستخدم كثيرا fluorophores، كما لديهم خصائص مرغوب فيه لتتبع الجسيمات المفردة، مثل زيادة السطوع ومقاومة لphotobleaching بالمقارنة مع الفلوروفوريس جزيء صغير18.

وقد تم إنتاج ثنائيات أحادية BDNF (mbtBDNF) باستخدام BDNFAvi عن طريق co-transfection من plasmids القيادة التعبير عن BDNFAvi وبيرا، تليها تنقية البروتين المؤتلف عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب مع غلة 1-2 ميكروغرام من BDNF لكل 20 مل من HEK293 وسائل الإعلام ثقافة مكيفة17. هنا، نقترح تعديل هذا البروتوكول الذي يسمح لتنقية BDNFAvi من 500 مل من وسائل الإعلام HEK293 مكيفة، والتي تسعى إلى تحقيق أقصى قدر من الانتعاش البروتين في بروتوكول قائم على عمود الكروماتوغرافيا لسهولة التلاعب. وكيل transfection المستخدمة، البولي ايثيلينمين (PEI)، يضمن طريقة فعالة من حيث التكلفة دون التضحية العائد transfection. وقد تم تكييف خطوة أحادية ثنائي الفينيل إلى تفاعل في المختبر لتجنب المضاعفات المرتبطة بالانباتات المشتركة ولضمان وضع علامات متجانسة من BDNF. وقد تجلى النشاط البيولوجي لـ mbtBDNF من خلال تجارب المجهر لطخة الغربية وفلوريسنس، بما في ذلك تنشيط pCREB والتصوير الحي للخلايا لدراسة النقل المحوري الرجعي لـ BDNF في الغرف الدقيقة الفلورية. استخدام هذا البروتوكول يسمح للإنتاج الأمثل، عالية الإنتاجية من متجانسة أحادية الحيوية و BDNF النشطة بيولوجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة للجنة الوطنية الشيلية للبحوث العلمية والتكنولوجية. وقد وافقت على البروتوكولات المستخدمة في هذه الدراسة من قبل لجان الأمن البيولوجي وأخلاقيات البيولوجيا ورعاية الحيوان التابعة جامعة كاتالونيا في شيلي. وقد وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا ورعاية الحيوان التابعة لمنظمة "الجامعة البابوية الكاثوليكية في شيلي" على إجراء تجارب تشمل الفقاريات.

ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لتنقية BDNFAvi من حجم إجمالي 500 مل من المتوسط مكيفة المنتجة في خلايا HEK293. كمية المتوسط المشروطة التي يتم إنتاجها ومعالجتها لتنقية BDNFAvi يمكن أن يكون أعلى أو تحان حسب الحاجة. ومع ذلك، قد يكون من الضروري تحقيق مزيد من التحسين في ظل هذه الظروف. ويمكن الاطلاع على تكوين وسائط الثقافة والمخازن العازلة المستخدمة في جميع أجزاء البروتوكول في مواد تكميلية.

1. إنتاج وتنقية BDNFAvi من HEK293-مكيفة وسائل الإعلام

  1. نقل خلايا HEK293
    1. تنمو خلايا HEK293 إلى التقاء 70٪ في 15 تكملة DMEM المتوسطة (10٪ مصل الجنين البقري، 1x تكملة الغلوتامات، 1x المضادات الحيوية / المضادة للصم) في 15 سم الأطباق ثقافة في 37 درجة مئوية.
    2. تغيير الوسيطة إلى المخزن المؤقت transfection.
    3. إعداد خليط بي أي-الدنا لتحول. استخدام اثنين من أنابيب المخروطية 15 مل مختلفة لتخفيف الحمض النووي وجزيرة الأمير إدوارد 25 K، على التوالي. تمييع 20 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في حجم النهائي من 500 ميكرولتر في أنبوب واحد. تخفيف 60 ميكروغرام من 25K PEI خطي في حجم النهائي من 500 ميكرولتر في أنبوب آخر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    4. بعناية ماصة حل الحمض النووي في أنبوب PEI، خلط مرة واحدة عن طريق أعلى إلى أسفل الحركة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
    5. بالتنقيط 1 مل من خليط بي اي-الحمض النووي في جميع أنحاء كل طبق 15 سم. احتضان الخلايا مع خليط بي أي-الحمض النووي لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية.
    6. تغيير وسيطة إلى عازلة حضانة جديدة.
  2. جمع الوسائط وتخزينها
    1. جمع المتوسطة من جميع الأطباق 48 ساعة بعد transfection من خلايا HEK293. إعداد الأرصدة المركزة من الحلول الموصوفة في قسم "العازلة التعديل الفائقة" من الملف التكميلي 1 وإضافتها إلى عظمى HEK293 لتحقيق التركيزات النهائية المذكورة.
      ملاحظة: يمكن تجاهل الخلايا أو استردادها لمزيد من التحليل.
    2. احتضان المتوسطة في الجليد لمدة 15 دقيقة.
    3. Aliquot الوسط في أنابيب الطرد المركزي.
    4. جهاز طرد مركزي في المتوسط 10،000 س ز لمدة 45 دقيقة في جهاز طرد مركزي 4 °C. هذه الخطوة تسمح بإزالة حطام الخلية والخلايا الميتة المعلقة في وسائل الإعلام.
    5. جمع ااابر، إضافة BSA بتركيز نهائي من 0.1٪. ثم تخزين في -20 درجة مئوية. ويمكن نقل وسائل الإعلام قبل تجميد لذوبان أسرع خلال خطوة تنقية.
      ملاحظة: أوقات التخزين من الوسائط المُعدّلة المجمدة التي تصل إلى شهرين قد أسفرت عن نتائج إيجابية، لم يتم تقييم أوقات التخزين الأطول.
  3. تركيز وسائل الإعلام وتنقيتها
    1. ذوبان وسائل الإعلام في 37 درجة مئوية حمام thermoregulated.
    2. Aliquot وسائل الإعلام في أنابيب الطرد المركزي.
    3. جهاز طرد مركزي متوسط ل 1 ساعة في 3,500 x ز في جهاز طرد مركزي مبرد 4 °C. وتسمح هذه الخطوة بإزالة بقايا حطام الخلايا لضمان التدفق الكافي عبر عمود الكروماتوغرافيا.
    4. استخدام المكثفات البروتين مع قطع 10 كيلو Da للحد من وسائل الإعلام من 500 مل إلى 100 مل. اتبع معلمات الطرد المركزي الموصى بها من قبل الشركة المصنعة للحصول على التركيز الأمثل.
    5. إضافة 500 μL من ني NTA أنغروس الخرز إلى وسائل الإعلام المركزة واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في الروك.
    6. تجميع جهاز الكروماتوغرافيا وصب وسائل الإعلام في ذلك. السماح لها بقية لمدة 5 دقائق ثم فتح stopcock 2-الاتجاه للسماح للتدفق المتوسط من خلال.
    7. غسل الخرز مع 5 مل من مخزن الغسيل لمدة 5 دقائق. تأكد من إعادة تعليق الخرز في العمود. استنزاف المخزن المؤقت من خلال فتح stopcock 2-way. كرر 3 مرات.
    8. إضافة 1 مل من العازلة elution إلى العمود. تأكد من إعادة تعليق الخرز في العمود. احتضان لمدة 15 دقيقة، ومن ثم جمع eluate في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كرر هذه الخطوة 3 مرات ل elution كاملة من BDNFAvi.
    9. تحميل 5 ميكرولتر من كل مُلَزات وتركيزات مختلفة من BDNF المتاحة تجارياً (40-160 نانوغرام) في هلام بولي كلريد بنسبة 15%. الكشف عن البروتين النقي عن طريق النشاف الغربية باستخدام المضادة BDNF المضادة.
    10. تحديد تركيز BDNFAvi المنقى في كل مُلَح باستخدام منحنى التركيز المعد مع BDNF المتوفرة تجاريًا.
    11. Aliquot وتخزين BDNFAvi المنقى في -80 درجة مئوية.

2. في المختبر أحادية ثنائي الفينيل من BDNFAvi باستخدام انزيم بيرا

  1. في المختبر أحادية التفاعل البيولوجي
    1. إعداد حلول المخزون المركزة من الكواشف العازلة biotinylation. استخدام الأسهم المركزة سوف يقلل من تخفيف البروتين المؤتلف.
    2. خذ aliquot من 800 نانوغرام من BDNFAvi وإضافة الكواشف العازلة biotinylation و BirA انزيم في علاقة 1:1 الضرس إلى BDNF. على سبيل المثال، لحجم التفاعل النهائي 200 μL إضافة; 100 ميكرولتر من الحل الذي يحتوي على 800 نانوغرام من BDNFAvi، 20 ميكرولتر بيسين 0.5 م 8.3، 20 ميكرولتر ATP 100 mM، 20 ميكرولتر MgOAc 100 مل م، 20 ميكرولتر د-البيوتين 500 ميكرومتر، 0.8-1 ميكروغرام إلى 1 ميكرولتر من BirA-GST، وكاملة إلى 200 ميكرولتر مع المياه فائقة الخطورة.
      ملاحظة: تم إجراء تفاعلات اتينيل ناجحة مع 400 ميكروغرام من 400 ميكرولتر تحتوي على تركيز حوالي 30 نانوغرام / ميكرولتر BDNFAvi ، مما أدى إلى BDNFAvi ثنائي حيوي متجانس إلى تركيز نهائي من ~ 20 نانوغرام / ميكرولتر في التفاعل النهائي.
    3. احتضان الخليط في 30 درجة مئوية في فرن التهجين لمدة 1 ساعة. اخلط المحتوى عن طريق انعكاس الأنبوب كل 15 دقيقة.
    4. إضافة نفس وحدة التخزين من ATP و BirA كما في الخطوة 2.1.2 وكرر الخطوة 2.1.3.
    5. يُخزن عند -80 درجة مئوية لإجراء التحليلات المستقبلية أو الاحتفاظ به على الجليد للاستخدام الفوري (على سبيل المثال، مراقبة جودة المعالجة البيولوجية).
  2. تحليل ثنائيات البيوت
    1. كتلة 30 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي streptavidin لكل عينة BDNF في 1 مل من العازلة حظر. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في أنبوب microcentrifuge الدوار.
    2. عجلت الخرز المغناطيسي باستخدام رف فصل المغناطيسي لمدة 3 إلى 5 دقائق أو حتى المخزن يظهر تماما مسح الخرز وتجاهل العازلة حظر.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من العازلة منع جديدة و 80 نانوغرام من أحادية الحيوية BDNFAvi (mbtBDNF) عينة إلى الخرز، مع التأكد من resuspend لهم تماما عن طريق pippeting.
    4. احتضان في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في دوار أنبوب microcentrifuge الغزل في حوالي 20 دورة في الدقيقة.
    5. جمع الخرز باستخدام رف الفصل المغناطيسي لمدة 3 إلى 5 دقائق، وجمع افرا، والحفاظ على aliquot 30 ميكرولتر للتحليل.
    6. غسل الخرز مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، ومن ثم جمعها باستخدام رف الفصل المغناطيسي لمدة 3 إلى 5 دقائق. استرداد فائقة والحفاظ على aliquot 30 ميكرولتر للتحليل.
    7. إضافة 10 μL من 4x تحميل العازلة إلى الخرز.
    8. سخني العينات إلى 97 درجة مئوية لمدة 7 دقائق لـ mbute mbtBDNF.
    9. كشف mbtBDNF باستخدام المضادة المضادة BDNF محددة19.

3 - التحقق من النشاط البيولوجي لـ mbtBDNF

  1. الكشف عن pTrkB وperk بواسطة لطخة الغربية.
    1. بذور 2 مليون الخلايا العصبية القشرية الفئران في أطباق ثقافة 60 ملم.
    2. ثقافة الخلايا العصبية لمدة 7 أيام (DIV7). ثم، تغيير متوسطة إلى غير مكملة االأصبي المتوسط عند بدء التجربة.
    3. بعد ساعة واحدة من التغيير المتوسط، أضف mbtBDNF إلى تركيز نهائي قدره 50 نانوغرام/مل. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. الحفاظ على طبق التحكم السلبي (غير محفزة مع BDNF) وطبق تحكم إيجابي (تعامل مع 50 نانوغرام / مل من BDNF المتاحة تجاريا).
    4. جمع المتوسطة وغسل بلطف كل طبق مع 1X برنامج تلفزيوني. جمع وتجاهل 1X برنامج تلفزيوني.
    5. ضع الأطباق على الجليد وأضف 50-80 ميكرولتر من عازلة التحلل إلى كل طبق. استخدام مكشطة الخلية لlyse الخلايا.
      ملاحظة: يجب تنفيذ خطوة التحلل بأسرع وقت ممكن لتجنب dephosphorylation البروتين وتدهور. 1-2 دقيقة من الكشط قوية كافية لتصور البروتينات من الفائدة من قبل النشاف الغربية.
    6. جمع العازلة تحلل ويحرك في خلاط دوامة في أعلى سرعة لمدة 5 s.
    7. الطرد المركزي العازلة تحلل في 14،000 س ز (4 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة. جمع supernatant.
    8. كمي محتوى البروتين من عظمى من قبل بروتوكول الكم البروتين BCA20.
    9. إضافة العازلة التحميل إلى aliquot التي تحتوي على 30-50 ميكروغرام من البروتين لكل حالة وتحميله في هلام بولياكريلاميد 12٪ لنشاف الغربية. الكشف عن pTrkB وperK باستخدام أجسام مضادة فوسفو محددة للتحقق من النشاط البيولوجي BDNFAvi.
  2. التحقق من النشاط البيولوجي BDNF-QD بواسطة pCREB من الفلورا المناعية.
    1. البذور 40،000 الخلايا العصبية القشرية الفئران في 10 ملم يغطي، سابقا autoclaved وتعامل مع بولي-L-ليسين كما وصف سابقا21.
    2. ثقافة الخلايا العصبية لمدة 7-8 أيام في العازلة صيانة الخلايا العصبية (انظر المواد التكميلية) في 37 ºC.
    3. لبدء التجربة، قم بتغيير الوسط المتوسط إلى المتوسط العصبي غير المُؤدّن وحضن في 37 درجة مئوية لمدة ساعة.
    4. إعداد mbtBDNF مترافق إلى نقاط الكم (BDNF-QD) عن طريق إضافة إلى mbtBDNF aliquot، وحجم اللازمة من نقطة الكم streptavidin conjugate (Streptavidin-QD) لتحقيق 1:1 BDNF-QD ضروس النسبة. ثم، تخفيف إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء.
      ملاحظة: إعداد أنبوب آخر مع نفس حجم نقطة الكم streptavidin conjugate وتمييعه إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية كتحكم سلبي.
    5. احتضان mbtBDNF / streptavidin QD خليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الروك.
    6. تخفيف BDNF QD إلى التركيز النهائي المطلوب (200 pM و 2 nM) في الوسط العصبي.
    7. بعد 1 ح من الحضانة مع غير مكملة العصبية المتوسطة، وتحفيز الخلايا العصبية مع BDNF-QD أو Streptavidin-QD (السيطرة) إلى تركيز نهائي من 200 pM و 2 nM من BDNF لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    8. غسل الأغطية 3 مرات مع 1X برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية) وإصلاح الخلايا لمدة 15 دقيقة عن طريق علاج غطاء مع 4٪ حل شبهformaldehyde تحتوي على مثبطات فوسفاتاز.
    9. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم احتضان مع حظر / permeabilization العازلة (BSA 5٪، تريتون X-100 0.5٪، 1x فوسفاتاز المانع) لمدة 1 ساعة.
    10. احتضان مع الأجسام المضادة pCREB 1:500 (في 3٪ BSA، 0.1٪ تريتون X-100) بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    11. في اليوم التالي، اغسل 3 مرات مع 1x PBS، واحتضان لمدة 1 ساعة مع الأجسام المضادة الثانوية 1:500 (3٪ BSA، 0.1٪ تريتون X-100).
    12. غسل 3 مرات مع 1X PBS. إضافة حل البقع النووية Hoechst (5 ميكروغرام / مل) لمدة 7 دقائق.
    13. غسل 3 مرات مع 1X برنامج تلفزيوني وجبل.
  3. التصور من النقل المحوري الرجعية من BDNF QD في الخلايا العصبية الحية
    1. إعداد غرف microfluidic والخلايا العصبية البذور كما هو موضح سابقا16.
    2. بعد 7-8 أيام في الثقافة، وتغيير المتوسطة إلى غير مكملة العصبي المتوسط.
    3. إعداد mbtBDNF مترافق إلى نقاط الكم (BDNF-QD) عن طريق إضافة إلى mbtBDNF aliquot، وحجم اللازمة من نقطة الكم streptavidin conjugate (Streptavidin-QD) لتحقيق 1:1 BDNF-QD ضروس النسبة. ثم، تخفيف إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء.
      ملاحظة: إعداد أنبوب آخر مع نفس حجم نقطة الكم streptavidin conjugate وتمييعه إلى 20 ميكرولتر مع المتوسطة العصبية كأداة تحكم.
    4. احتضان mbtBDNF / streptavidin QD خليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الروك.
    5. تخفيف BDNF QD إلى التركيز النهائي المطلوب (2 ن م).
    6. بعد 1 ساعة من الحضانة مع المتوسطة العصبية غير مكملة إضافة BDNF QD أو خليط التحكم في مقصورات محور عصبي من غرفة microfluidic. احتضان لمدة 210 دقيقة في 37 درجة مئوية لضمان النقل العكسي صافي BDNF QD.
    7. للتصوير الخلية الحية، تصور نقل الوراء المحوري في الجزء من microgrooves التي هي قريبة إلى مقصورة الجسم الخلية باستخدام هدف 100x باستخدام مجهر مناسب لهذه الغرض (37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون). الحصول على الصور في 1 إطار / ثانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام بروتوكول يستند إلى عمود الكروماتوغرافي يسمح بمعالجة كميات كبيرة من وسائط HEK293 مكيفة. في الشكل 1، تظهر نتائج تنقية BDNFAvi من 500 مل من وسائل الإعلام المكيفة. elutions متتالية من BDNFAvi من ني NTA أغاروز الخرز العائد انخفاض تركيزات BDNFAvi (الشكل 1A). بعد أربعة من التلميحات المتتالية (كل منها يدوم 15 دقيقة)، يتم استرداد غالبية BDNF التي تم التقاطها بواسطة الخرز. تتراوح تركيزات الرواد من 6 إلى 28 نانوغرام/ميكرولتر، وبلغ إجمالي الغلة حوالي 60 ميكروغرام من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة، يتم وصف منهجية الأمثل لإنتاج وتنقية mbtBDNF في إجراء قائم على اللونية تقارب، استنادا إلى عمل سونغ والمتعاونين17. وتشمل التحسينات استخدام كاشف نقل فعال من حيث التكلفة (PEI) مع الحفاظ على كفاءة أساليب نقل أكثر تكلفة مثل الدهون. ويترجم هذا التحسين إلى تخفيض كبير في تكلفة البروتوكول، مما يسمح بالتدرج مع الحفاظ على فعالية عالية من حيث التكلفة. ويتضمن البروتوكول أيضا اعتبارات سهولة الاستخدام، بما في ذلك تجميد وسائل الإعلام المكيفة لمدة تصل إلى شهرين. هذه التحسينات تجعل الإجراء قابلاً للت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب الاعتراف بامتنان الدعم المالي من Fondecyt (1171137) (FCB) ، ومركز القاعدية للتميز في العلوم والتكنولوجيا (AFB 170005) (FCB) ، Millenium - Nucleus (AFB 170005) ، ميلينيوم - نيوكليوس (AFB) P07/011-F( FCB)، وجائزة ويلكوم تراست لكبار المحققين (107116/Z/15/Z) (GS) وجائزة مؤسسة معهد بحوث الخرف في المملكة المتحدة (GS). وقد دعم هذا العمل اتحاد الميكروسكوبيا أفانزادا UC .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2 اتجاه: محبسBioRad7328102مكون جهاز الكروماتوغرافيا
2-mercaptoethanolSigmaM6250BDNF الشطف العازلة
أكريلاميد / بيساكريلاميدBioRad1610154SDS-PAGE تحضير هلام
Amicon Ultra-15 10KMilliporeUFC901024تركيز BDNF
الأمونيوم بيرسولفاتسيجماA9164SDS-PAGE تحضير هلام
مضاد للجسم المضاد B-III-TubulinسيجماT8578فحوصات اللطخة الغربية للكشف عن النشاط البيولوجي BDNF
المضاد للجسم المضادBDNF AlomoneAGP-021فحوصات اللطخة الغربية لقياس BDNF
المضاد للجسم المضاد BDNFAlomoneANT-010فحوصات اللطخة الغربية لقياس BDNF كمي
الأجسام المضادة ERK الإشارات9102فحوصات اللطخة الغربية للكشف عن النشاط البيولوجي BDNF
الأجسام المضادة ل pCREB (S133)إشارات الخلية9198فحوصات اللطخة الغربية للكشف عن النشاط البيولوجي BDNF
الأجسام المضادة ل pERK (T202 ، Y204)الخلية4370فحوصات اللطخة الغربية للكشف عن النشاط البيولوجي BDNF
الأجسام المضادة ل pTrkB (Y515)Abcamab109684فحوصات اللطخة الغربية للكشف عن النشاط البيولوجي BDNF
المضاد الحيوي / المضاد للفطرياتGibco15240-062صيانة HEK293
ATPSigmaA26209BDNF أحادي الحيوية المخزن
المؤقت B-27ملحق Gibco17504-044صيانة الخلايا العصبية
BicineSigmaB3876BDNF monobiotinylation buffer
BirA-GSTإنزيم BPS Bioscience70031ل BDNF AviTag monobiotinylation
مصل الجنين البقريHyCloneHC. SH30396.02صيانة HEK293
مصل الأبقار الألبومينجاكسون ImmunoResearch001-000-162مكون تعديل المخزن المؤقت BDNF ، مانع المخزن المؤقت للبقعة الغربية والتألق المناعي
D-BiotinSigmaB4639BDNF monobiotinylation
buffer DMEM عالي الجلوكوز متوسطGibco11965-092بذر الخلايا العصبية
DMEM متوسطGibco11995-081صيانة HEK293
قمع عمود اقتصاديBioRad7310003مكون جهاز الكروماتوغرافيا
EDTAMerck108418
EZ-ECLKit الصناعات البيولوجية1633664الكشف عن البروتين عن طريق النشاف الغربي
GlutamaxGibco35050-061Neuron و HEK293 صيانة
GlycerolMerck104094المخزن المؤقت للشطف BDNF ، عازلة التحلل لمقايسات اللطخة الغربية
Hettich Rotina 46R جهاز طرد مركزيHettichتم إيقافجهاز الطرد المركزي المستخدم لإزالة وسط الحطام
Hettich Universal 32R جهاز طردHettichتم إيقافالطرد المركزي المستخدم في الطرد المركزي لمكثف البروتين
مصل الحصانGibco16050-122بذر
الخلايا العصبيةImageQuant LAS 500GE Healthcare LifeSciences 29005063الحصول على صورة لطخة غربية
ImidazoleSigmaI55513مكون تعديل المخزن المؤقت BDNF
KClWinklerBM-1370PBS مكون
KH2< / sub>PO4< / sub>Merck104873مكون
PBS LamininInvitrogen23017-015طلاء الغطاء للخلايا العصبية المجزأة
محول أنابيب لورBioRad7323245مكون جهاز الكروماتوغرافيا
Luminata & trade ؛ Forte Western HRP SubstrateMilliporeWBLUF0100الكشف عن البروتين عن طريق النشاف الغربي
Mg (CH3< / sub>COO) 2< / sub>Merck105819BDNF monobiotinylation buffer
Mowiol 4-88Calbiochem475904كاشف متصاعد لمقايسات التألق المناعي
MyOne C1 Streptavidin الخرز المغناطيسيInvitrogen65001التحقق من البيوتينيل
Na2HPO4Merck106586مكون تعديل المخزن المؤقت BDNF
مكون NaClWinklerBM-1630PBS ، مكون تعديل المخزن المؤقت BDNF
NaH2PO4Merck106346مكون تعديل المخزن المؤقت BDNF
الوسيط العصبي القاعديGibco21103-049صيانة الخلايا العصبية
Ni-NTA حبات الاغاروزQiagen30210BDNF AviTag تنقية
نيكون Ti2-Eنيكونللتصوير الفلوري
غشاء النيتروسليلوزBioRad1620115نقل البروتين للنشاف الغربي
ORCA-Flash4.0 V3 كاميرا CMOS الرقميةHamamatsuC13440-20CUكاميرا لتصوير epifluorescence
P8340 كوكتيل مثبط البروتيازSigmaP8340BDNF مكون تعديل العازلة
ParaformaldehydeMerck104005Fixative لمقايسات التألق المناعي
Penicillin / StreptomycinGibco15140-122صيانة الخلايا العصبية
Poli-D-LysineCorningDLW354210طلاء الغطاء للخلايا العصبية المجزأة
Poli-L-LysineMilliporeP2363طلاء الغطاء للخلايا العصبية غير المجزأة
عمود الكروماتوغرافيا Poly-PrepBioRad7311550مكون جهاز الكروماتوغرافيا
Polyethyleneimine 25KPolysciences Inc.PLY-0296HEK293 تعداء
النقاط الكمومية 655 الستربتافيدين المترافقInvitrogenQ10121MPأحادي البيوتينيل BDNF AviTag ملصق لتجارب الخلايا الحية والثابتة
SaponinSigmaS4521منظف لمقايسات التألق المناعي
Syldgard 184 قاعدة مطاط أسطوانة السيليكونPoirot4019862تحضير غرفة الموائع
الدقيقة TEMEDSigmaT9281SDS-PAGE تحضير جل
TrisWinklerBM-2000مكون عازلة التحلل
Triton X100Merck108603نفاذية الخلية في التألق المناعي ومقايسات اللطخة الغربية
Trypsin-EDTA 0.5٪Gibco15400-054HEK293
خلية إشارات مركزي جهاز مجهر المرور

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, E., Reichardt, L. Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function. Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).
  2. Skaper, S. D. The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview. Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).
  3. Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor. Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).
  4. Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. A simple role for BDNF in learning and memory. Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1(2010).
  5. Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  6. Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development. Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).
  7. Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293(2006).
  8. Escudero, C. A., et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling. Scientific Reports. 9, 6070(2019).
  9. Vrabec, J. P., Levin, L. A. The neurobiology of cell death in glaucoma. Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).
  10. Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites. Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).
  11. Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons. Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).
  12. Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons. Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).
  13. Adachi, N., et al. Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles. Scientific Reports. 5, 12684(2015).
  14. Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/ (2012).
  15. Zhao, L., et al. Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface. Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).
  16. Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons. Journal of Visualized Experiments. 91, 51899(2014).
  17. Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).
  18. Deerinck, T. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  19. Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction. Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).
  20. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  21. Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493(2018).
  22. Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).
  23. Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1 (2019).
  24. Mowla,, et al. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).
  25. Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI). Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).
  26. Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55 (1), 44-51 (2011).
  27. Dalton, A., Barton, W. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
  28. Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. Optimization of protein expression in mammalian cells. Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77(2019).
  29. Stepanenko, A. A., Heng, H. H. Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutation Research. 773, 91-103 (2017).
  30. Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  31. Angelova, A., Angelov, B. Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair. Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BDNF BDNF HEK293 BirA

مقالات ذات صلة