يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تشريح وكيمياء الهيستولوجية المناعية وتركيب أدمغة ذبابة الفاكهة اليرقية والبالغة لتصور الفص البصري

5.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61273

⸱

أبريل 28, 2021

 ,  ,  , 
1Departments of Biology and Cell & Systems Biology, University of Toronto - Mississauga

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول ثلاث خطوات لإعداد الفصوص البصرية لليرقات وذبابة الفاكهة البالغة للتصوير: 1) تشريح الدماغ ، 2) الكيمياء الهيستولوجية المناعية و 3) التركيب. يتم التركيز على الخطوة 3 ، حيث يلزم وجود اتجاهات تركيب مميزة لتصور هياكل الفص البصري المحددة.

الملخص

يتكون الفص البصري من ذبابة الفاكهة ، الذي يتكون من أربعة خلايا عصبية: الصفيحة ، النخاع ، الفصيص والصفيحة الفصيصة ، هو نظام نموذجي ممتاز لاستكشاف الآليات التنموية التي تولد التنوع العصبي وتدفع تجميع الدائرة. نظرا لتنظيمه المعقد ثلاثي الأبعاد ، يتطلب تحليل الفص البصري أن يفهم المرء كيف يتم وضع الخلايا العصبية البالغة وأسلاف اليرقات بالنسبة لبعضها البعض والدماغ المركزي. هنا ، نصف بروتوكولا لتشريح وتلوين المناعة وتركيب أدمغة اليرقات والبالغين لتصوير الفص البصري. يتم التركيز بشكل خاص على العلاقة بين اتجاه التركيب والتنظيم المكاني للفص البصري. نصف ثلاث استراتيجيات تركيب في اليرقة (الأمامية والخلفية والجانبية) وثلاثة في البالغين (الأمامي والخلفي والأفقي) ، كل منها يوفر زاوية تصوير مثالية لهيكل الفص البصري المتميز.

المقدمة

كان النظام البصري لذبابة الفاكهة ، الذي يتألف من العين المركبة والفص البصري الأساسي ، نموذجا ممتازا لدراسة تطور الدائرة العصبية ووظيفتها. في السنوات الأخيرة ، ظهر الفص البصري على وجه الخصوص كنظام قوي لدراسة عمليات النمو العصبي مثل تكوين الخلايا العصبية وأسلاك الدوائر1،2،3،4،5،6،7،8. وهي مكونة من أربعة الخلايا العصبية: الصفيحة ، النخاع ، الفصيص والصفيحة الفصيصة (الأخيران يشكلان مجمع الفصيصات)1،2،3،4،5،6. المستقبلات الضوئية من العين ، تستهدف الخلايا العصبية للصفيحة والنخاع ، والتي تعالج المدخلات البصرية وتنقلها إلى الخلايا العصبية لمجمع الفصيص1،2،3،4،5،6. ترسل الخلايا العصبية الإسقاطية في مجمع الفصيصات بعد ذلك معلومات مرئية إلى مراكز المعالجة العليا في الدماغالمركزي 1،5،9. إن التنظيم المعقد للفص البصري ، الذي تستلزمه الحاجة إلى الحفاظ على الشبكية ومعالجة أنواع مختلفة من المحفزات البصرية ، يجعله نظاما جذابا لدراسة كيفية تجميع الدوائر العصبية المتطورة. والجدير بالذكر أن النخاع يشترك في أوجه تشابه مذهلة في كل من تنظيمه وتطوره مع شبكية العين العصبية ، والتي كانت منذ فترة طويلة نموذجا لتطوير الدائرة العصبية الفقارية 3,8.

يبدأ تطور الفص البصري أثناء التطور الجنيني ، مع مواصفات ~ 35 خلية من خلايا الأديم الظاهر التي تشكل الشفرة البصرية2،4،5،6،7،8. بعد فقس اليرقات ، ينقسم البشارة البصرية إلى بدائيين متميزين: 1) مركز الانتشار الخارجي (OPC) ، الذي يولد الخلايا العصبية للصفيحة والنخاع الخارجي و 2) مركز الانتشار الداخلي (IPC) ، الذي يولد الخلايا العصبية للنخاع الداخلي ومجمع الفصيصات4،5،6،10. في أواخر اليرقة الثانية ، تبدأ الخلايا الظهارية العصبية في OPC و IPC في التحول إلى خلايا عصبية تولد لاحقا خلايا عصبية عبر الخلايا الأم العقدة الوسيطة4،5،11،12. يتم تصميم الخلايا العصبية للفص البصري من خلال عوامل النسخ المقيدة مكانيا وزمانيا ، والتي تعمل معا لتوليد التنوع العصبي في ذريتها11،12،13،14. في الخادرة ، يتم تجميع دوائر الخلايا العصبية للفص البصري من خلال تنسيق العديد من العمليات ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج11,15 ، والهجرة العصبية12,16 ، والاستهداف المحوري / التغصني 10,17 ، وتشكيل المشبك 18,19 ودورات الأعصاب10,17.

هنا ، نصف المنهجية التي يتم من خلالها تشريح أدمغة اليرقات والبالغين ، وتلطيخها بالمناعة وتركيبها لتصوير الفص البصري. نظرا لتنظيمه المعقد ثلاثي الأبعاد ، يتطلب تحليل الفص البصري أن يفهم المرء كيف يتم وضع الخلايا العصبية البالغة وأسلاف اليرقات بالنسبة لبعضها البعض والدماغ المركزي. وبالتالي ، فإننا نركز بشكل خاص على كيفية ارتباط اتجاه التركيب بالتنظيم المكاني لهياكل الفص البصري. وصفنا ثلاث استراتيجيات تركيب لأدمغة اليرقات (الأمامية والخلفية والجانبية) وثلاث لأدمغة البالغين (الأمامية والخلفية والأفقية) ، كل منها يوفر زاوية مثالية لتصوير مجموعة محددة من أسلاف الفص البصري أو neuropil.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تحضير أدمغة اليرقات للتصوير متحد البؤر

  1. تشريح
    ملاحظة: قبل البدء في التشريح ، قم بإعداد محاليل الإصلاح (4٪ فورمالديهايد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)) و PBT (0.1-0.3٪ Triton في PBS). يجب وضع محلول الإصلاح على الجليد أثناء التشريح. على الرغم من استخدام مثبت بارافورمالدهايد (PFA) في هذا البروتوكول ، فقد تم وصف استراتيجيات التثبيت البديلة (باستخدام PLP20 أو PEM21) لحواتم محددة. لتشريح اليرقات ، هناك حاجة إلى زوجين من الملقط (Dumont # 5 أو #55s). انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل.
    1. ابدأ بملء كل بئر من طبق التشريح ب 400 ميكرولتر من 1x PBS. استخدم زوجا من الملقط لاختيار اليرقات الثالثة المتجولة التي تزحف برفق داخل القارورة. ضع اليرقات في البئر الأول من الطبق المملوء ب PBS.
    2. خذ يرقة واحدة وانقلها إلى البئر الأوسط. باستخدام اليد غير المهيمنة ، أمسك جسم اليرقة لأسفل عند قاعدة البئر.
    3. مع اليد المهيمنة ، أمسك بلطف خطاف فم اليرقات وابتعد عن الجسم. يجب ربط دماغ اليرقات بخطاف الفم والأنسجة الملحقة الأخرى وسوف ينفجر عند سحب الأنسجة بعيدا.
    4. قم بإزالة الأقراص الوهمية الملحقة ونقل دماغ اليرقات إلى البئر الثالث من طبق التشريح. الأقراص التخيلية هي أنسجة ظهارية تحيط بدماغ اليرقات ، والتي تولد هياكل بالغة مثل الهوائيات والعينين والساقين والأجنحة20. إذا تركت على الأنسجة ، فقد تعيق الأقراص الوهمية التلوين المناعي المناسب لدماغ اليرقات.
      1. لإزالة الأقراص الوهمية ، استخدم زوجا من الملقط للإمساك بالدماغ بإحكام عبر الحبل العصبي البطني. باستخدام زوج آخر من الملقط ، انتزع الأقراص برفق.
      2. قم بإزالة قرص العين بعناية ، لأنه يلتف على سطح فصوص الدماغ. لإزالة قرص العين ، استخدم زوجا من الملقط لتثبيت الدماغ على قاعدة الطبق. بدلا من إمساك الدماغ عبر الحبل العصبي البطني ، استخدم الملقط للإمساك برفق بفص الدماغ مع الحرص على عدم الضغط على الفص. باستخدام زوج آخر من الملقط ، اسحب قرص العين برفق.
        ملاحظة: سيؤدي القرص التخيلي للعين في النهاية إلى ظهور مستقبلات ضوئية للشبكية. للراغبين في دراسة الاتصال العصبي بين شبكية العين والفص البصري ، يمكن ترك قرص العين على الدماغ. ومع ذلك ، بالنسبة لأولئك المهتمين فقط بهياكل الفص البصري ، يوصى بإزالة قرص العين لأنه قد يعيق جودة الصورة بسبب موقعه على سطح الدماغ.
    5. كرر الخطوات 1.1.2-4 حتى يتم جمع عدد كاف من الأدمغة (أو انقضاء 30 دقيقة من وقت التشريح). يجب ألا يستغرق التشريح أكثر من 30 دقيقة لضمان عدم المساس بسلامة الأنسجة.
    6. بمجرد انتهاء فترة التشريح ، استخدم ماصة P200 لإزالة PBS بعناية من البئر الثالث. تأكد من بقاء كمية صغيرة من السائل في البئر للحفاظ على الأدمغة مغمورة.
      ملاحظة: من الضروري إبقاء الأدمغة مغمورة في السائل في جميع نقاط البروتوكول. إذا جفت الأنسجة ، فقد تتعرض جودة البقعة للخطر بسبب التألق الذاتي غير المرغوب فيه في الصورة متحدة البؤر.
    7. أضف 500 ميكرولتر من محلول التثبيت البارد إلى البئر الثالث. استخدم زوجا من الملقط لتقليب السائل برفق ، مما يسمح للأدمغة بالدوران في الطبق. غطي الطبق بشريحة زجاجية وضعيه على الثلج لمدة 30 دقيقة للسماح بتثبيت الأنسجة.
    8. قم بإزالة محلول التثبيت وغسل الأدمغة باستخدام 400 ميكرولتر PBT ، 5 مرات.
      ملاحظة: Triton هو منظف في PBT يمنع الأدمغة من الالتصاق ببعضها البعض أو الطبق ، ويعد الأنسجة لاختراق الأجسام المضادة الأمثل.
  2. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
    ملاحظة: هناك العديد من الأجسام المضادة الأولية المتاحة من بنك الدراسات التنموية Hybridoma Bank (DSHB) والتي يمكن استخدامها لتسمية هياكل أو أنواع خلايا معينة من الفص البصري. يقوم DE-Cadherin بتسمية IPC و OPC neuroepithelia، ويشير Bruchpilot (Brp) إلى الخلايا العصبية النامية الألماني بالخلايا العصبية الصفيحة والفصيصة (بالإضافة إلى مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية النخاعية). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام Elav لتسمية الخلايا العصبية ، Prospero لتمييز الخلايا الأم العقدية و Repo لتحديد الخلايا الدبقية.
    1. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأساسي عن طريق إضافة أجسام مضادة إلى PBT حتى حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر. يمكن استخدام عامل مانع (10٪ مصل الماعز الطبيعي) لمنع الارتباط غير المحدد بين الجسم المضاد الأساسي والأنسجة20،22،23. تقوم الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول بتسمية أنسجة المخ على وجه التحديد دون الحاجة إلى عوامل مانعة.
    2. قم بإزالة الغسول النهائي بعد التثبيت وأضف محلول الأجسام المضادة الأساسي. تأكد من وجود كمية صغيرة فقط من PBT في البئر قبل إضافة محلول الأجسام المضادة. بعد إضافة المحلول، حرك العقول برفق بالملقط 5-10 مرات. يغطى بشريحة زجاجية ، ويغلق بغشاء مختبري ويحتضن عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
      1. بدلا من ذلك ، إذا كان شاكر مداري مبرد متاحا ، ضع الطبق على شاكر لتحسين الحضانة الليلية.
        ملاحظة: يمكن بدلا من ذلك إجراء حضانة الأجسام المضادة الأولية وجميع الخطوات اللاحقة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. يمكن أن يظل حجم الحضانة الأولية والثانوية 100 ميكرولتر ، ولكن يجب إجراء خطوات الغسيل باستخدام 800 ميكرولتر أو أكثر من PBT.
    3. بعد الحضانة ، اغسل الأجسام المضادة الأولية باستخدام PBT كما في الخطوة 1.1.8 من القسم السابق.
      ملاحظة: يجب حفظ محلول الأجسام المضادة الأساسي وتخزينه عند 4 درجات مئوية حيث يمكن إعادة استخدامه في التجارب اللاحقة. يمكن إعادة استخدام العديد من الأجسام المضادة الأولية حتى أربع مرات.
    4. أضف 400 ميكرولتر من PBT إلى الأدمغة لغسلها نهائيا. غطي الطبق بشريحة ، وختمه بفيلم مختبري وضعه على شاكر مداري بسرعة منخفضة (100 دورة في الدقيقة) ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة ~ 4 ساعات.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن ترك الأدمغة في حالة غسيل لمدة 2-3 يوما عند 4 درجات مئوية.
    5. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوي في حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام جميع الأجسام المضادة الثانوية بتخفيف 1: 500 ، دون حظر العوامل.
    6. قم بإزالة غسل PBT من البئر وأضف محلول الأجسام المضادة الثانوي. امزج الأنسجة في المحلول باستخدام زوج من الملقط. غطي الطبق بشريحة وفيلم مختبري. ضع الطبق على شاكر مداري في RT لفترة حضانة لا تقل عن 2 ساعة. نظرا لأن الأجسام المضادة الثانوية تحتوي على فلوروفورات حساسة للضوء ، فقم بتغطية الطبق بورق الألمنيوم.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن ترك الأدمغة في محلول ثانوي للأجسام المضادة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    7. اغسل الأجسام المضادة الثانوية كما هو موضح في الخطوة 1.2.3. أضف 400 ميكرولتر من PBT إلى الأدمغة لغسلها نهائيا. غطي الطبق بشريحة ، وختمه بفيلم مختبر ورقائق. ضع العقول على شاكر في RT لمدة 4 ساعات.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن ترك الأدمغة في حالة غسيل لمدة 2-3 يوما عند 4 درجات مئوية.
  3. تصاعد
    1. قم بإزالة غسول PBT النهائي واستبدله بقطرتين من وسائط التركيب الآمنة للتألق. ضع قطرة من وسائط التركيب في وسط الشريحة.
    2. نقل العقول من البئر إلى قطرة على الشريحة باستخدام ملقط. لتجنب إتلاف الفصوص البصرية ، يمكن أن يمسك الحبل العصبي البطني بالأدمغة أثناء نقلها إلى الشريحة.
    3. قم بتركيب العقول وفقا لاستراتيجيات التركيب التالية (الشكل 1 أ).
      1. الجانب الأمامي لأعلى
        ملاحظة: للراغبين في تصور النخاع الأمامي أو الصفيحة أو سدادة الفصيص ، فإن اتجاه التثبيت هذا مثالي. أفضل طريقة للتمييز بين الحوامل الأمامية والخلفية هي فحص موضع الحبل العصبي البطني بالنسبة إلى فصوص الدماغ.
        1. استخدم الاتجاه الأمامي, لمراقبة الحبل العصبي البطني البارز فوق الفصوص (الشكل 1B).
      2. الجانب الخلفي لأعلى
        ملاحظة: يوصى بهذا التوجه للمهتمين بتصور الأطراف الخلفية ل OPC (pOPC) أو IPC 10,11.
        1. استخدم الاتجاه الخلفي ، لعرض الحبل العصبي البطني البارز من تحت فصوص الدماغ (الشكل 1C).
      3. عرض جانبي
        ملاحظة: يتم استخدام اتجاه التثبيت الجانبي لتصور هلال الخلايا العصبية الصفيحة أو النخاع أو الفصيص في كل من المحورين الظهري البطني والأمامي الخلفي في مستوى واحد (الشكل 1G).
        1. بالنسبة للحامل الجانبي ، افصل فصوص الدماغ عن بعضها البعض لتسقط بشكل مسطح على جانبها ، مع توجيه سدادة الصفيحة والفصيصة لأعلى.
        2. باستخدام زوجين من الملقط الحاد ، قم بتقسيم الحبل العصبي البطني إلى نصفين ، بدءا من مكان ارتباط الحبل بالفصوص. لاحظ أن الفصين منفصلان بالفعل عن بعضهما البعض ، مع الحبل العصبي البطني الذي يبقيهما سليمين. وبالتالي ، قم بتقسيم الحبل العصبي البطني لأسفل من نقطة الانقسام بين الفصوص ، لفصلها. ثم اقلب كل فص دماغي وربط الحبل العصبي البطني على جانبيها مع توجيه الأسطح الجانبية لأعلى.
          ملاحظة: لتركيب الرؤية الجانبية ، يوصى باستخدام إبرة التنغستن ذات الطرف الرفيع لتوجيه فص الدماغ على جانبه. لتصور اتجاه الفصوص واتجاه الحبل العصبي البطني بوضوح عند التركيب ، يمكن ضبط إضاءة المجهر. في حالة استخدام مصدر ضوء LED معقوفة ، يجب وضع العنق المنحنية بالتوازي مع سطح الشريحة للحصول على رؤية واضحة. أيضا ، يمكن زيادة شدة الإضاءة أو تقليلها لتعزيز التباين بين هياكل الدماغ وتوفير الوضوح أثناء التركيب.
    4. ضع قطرة صغيرة من PBS على جانبي وسائط التركيب التي تحتوي على الأدمغة. ضع غطاء واحد على كل قطرة ، وغطاء نهائي على الدماغ. يجب أن تستقر الحواف اليمنى واليسرى لغطاء الغطاء العلوي على منزلقي الغطاء الآخرين (الشكل 1 أ).
      ملاحظة: قبل وضع غطاء على الأدمغة ، يجب بناء جسر. يبلغ سمك أدمغة اليرقات حوالي 200 ميكرومتر ، وبالتالي ، للحفاظ على سلامة الأنسجة ، يتم إنشاء جسر يزيد من المسافة بين انزلاق الغطاء وسطح الشريحة.
    5. أغلق حواف الجسر بطلاء الأظافر لتأمين العقول المركبة.
    6. تخيل الأدمغة باستخدام المجهر متحد البؤر.

2. إعداد أدمغة البالغين للتصوير متحد البؤر

  1. تشريح
    ملاحظة: تشريح دماغ البالغين أكثر صعوبة من أدمغة اليرقات ويتطلب معالجة دقيقة. يوصى بشدة باستخدام زوج واحد على الأقل من الملقط فائق الدقة (Dumont # 55) لهذا الجزء من البروتوكول.
    1. تخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون2 ، باستخدام إبرة أو لوحة ذبابة ، ووضعها على منديل مختبر أو منشفة ورقية فوق الثلج (لإبقائها مخدرة).
    2. أضف 400 ميكرولتر من PBS إلى جميع الآبار الثلاثة للطبق الزجاجي. استخدم زوجا من الملقط للإمساك برفق بذبابة بالغة من الأجنحة ووضعها في البئر الأول من الطبق.
    3. استخدم زوجا من الملقط مثبتا في اليد غير المهيمنة لتثبيت صدر الذبابة على قاعدة البئر. مع اليد المهيمنة ، اسحب الرأس برفق من بقية الجسم.
    4. نقل الرأس إلى البئر الثاني. في كثير من الأحيان ، سوف يطفو الرأس في PBS ويمكن أن يكون من الصعب التعامل معه. استخدم زوجا من الملقط لتثبيته على قاعدة البئر بواسطة خرطوم.
    5. قشر منطقة من بشرة بين العينين باستخدام كلا الملقط. نظرا لأن الدماغ يجلس أسفل البشرة مباشرة ، فكن لطيفا قدر الإمكان لمنع إتلاف الأنسجة الكامنة. استمر في تقشير البشرة قطعة واحدة في كل مرة ، حتى يتعرض الدماغ. قم بإزالة أي نسيج ملحق (مثل شبكية العين والقصبة الهوائية والحويصلات الهوائية) التي قد تظل ملتصقة بالدماغ.
      ملاحظة: تم وصف إزالة شبكية العين في البروتوكولات السابقة22،24 ، ولكن يمكن أيضا فصل الصفيحة عن بقية الفص البصري. هذا مفيد لأولئك الذين يرغبون في دراسة مجمع النخاع أو الفصيص ، لأن الصفيحة تجلس على السطح وقد تعيق تصور هذه الخلايا العصبية الأخرى في الفص البصري عند التصوير. لإزالة الصفيحة ، استخدم زوجا من الملقط الحاد لسحب المسافة البادئة برفق بين الصفيحة والخلايا العصبية النخاعية. ستبدأ الصفيحة ببطء في التقشر بعيدا عن النخاع. كرر هذه الحركة حتى تتم إزالة الصفيحة بأكملها. خلال هذه العملية ، من المهم الحفاظ على قبضة قوية على الدماغ. استخدم زوجا آخر من الملقط لتثبيت الدماغ على قاعدة الطبق عن طريق وضعه بحيث يتناسب الجزء العلوي والسفلي من الدماغ المركزي تماما بين أطراف الملقط. قبضة قوية حول الدماغ المركزي ستمنع الضرر غير المرغوب فيه للفص البصري.
    6. نقل الدماغ النظيف إلى البئر الثالث. كرر الخطوات 2.1.2-6 حتى يتم الحصول على عدد كاف من الأدمغة أو انقضاء فترة تشريح قصوى تبلغ 30 دقيقة.
    7. قم بإزالة PBS في البئر الثالث وأضف 500 ميكرولتر من محلول الإصلاح. تأكد من أن الأدمغة لا تجف هنا أو أثناء أي خطوات غسيل لأن هذا سيؤدي إلى مضان الخلفية في الصور متحدة البؤر. غطي الطبق بشريحة زجاجية واسمح للأدمغة بالاحتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
    8. بعد التثبيت ، اغسل الأدمغة ب 400 ميكرولتر من PBT ، 5 مرات.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تغطية الأدمغة بشريحة زجاجية وفيلم مختبري وتركها في الغسيل لمدة 2-3 يوما عند 4 درجات مئوية. بالنسبة للباحثين الجدد في النظام ، قد يكون من الأسهل ترك الأنسجة الملحقة على الأدمغة قبل وأثناء التثبيت. سيسمح ذلك للباحثين بزيادة عدد عينات الدماغ التي تم الحصول عليها في فترة تشريح معينة. بعد إصلاح الأنسجة وغسلها ، يمكن تنظيف الأدمغة بعناية قبل إضافة محلول الأجسام المضادة الأولي. تميل أدمغة البالغين ذات الأنسجة الملحقة إلى الطفو ، وبالتالي تخاطر بالجفاف. نتيجة لذلك ، يوصى باستخدام زوج من الملقط لتجميع جميع الأدمغة بعناية في وسط الطبق عند إضافة محلول الإصلاح ، وتنظيف الأدمغة فور التثبيت.
  2. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
    1. إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية كما هو موضح لأدمغة اليرقات في القسم 1.2.
    2. تشمل الأجسام المضادة الأولية المفيدة من DSHB تلك المذكورة في بروتوكول الكيمياء الهيستولوجية المناعية لليرقات في القسم 1.2. انظر جدول المواد للحصول على قائمة كاملة بالأجسام المضادة والتخفيفات المقابلة.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد أثناء خطوات الغسيل لأدمغة البالغين ، لأنها قد تطفو على سطح محلول الغسيل وتخاطر بالجفاف على جوانب البئر عند إزالة المحلول (مما يؤدي إلى مضان الخلفية). من الممارسات الجيدة وضع الماصة بيد واحدة لإضافة السائل أو سحبه بعيدا ، وزوج من الملقط في اليد الأخرى للحفاظ على غمر الأدمغة.
  3. تصاعد
    1. قبل خطوة التركيب ، قم بإجراء غسل نهائي باستخدام PBS (بدلا من PBT). يتسبب برنامج تلفزيوني في أن تصبح الأدمغة لزجة قليلا ، مما يسمح لها بالبقاء في الاتجاه المطلوب أثناء التركيب.
    2. قم بإزالة الغسيل النهائي واستبدله بثلاث قطرات من وسائط التركيب الآمنة من التألق. ضع قطرة من وسائط التركيب على وسط شريحة المجهر.
    3. نقل العقول من البئر إلى قطرة على الشريحة باستخدام ملقط. لتجنب إتلاف الفصوص البصرية ومنع الأنسجة من الجفاف ، استرجع الدماغ بعناية عن طريق العمل الشعري. أغلق ببطء زوجا من الملقط حول الدماغ حتى يتم سحب كمية صغيرة من السائل الذي يحتوي على الدماغ بين الأطراف.
      ملاحظة: عند نقل الدماغ إلى الشريحة ، احرص على عدم إغلاق الملقط لأن ذلك سيؤدي إلى تلف الدماغ. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام ماصة P200 لنقل الأدمغة. اقطع نهاية الطرف لتوسيع الفتحة وشطفها مسبقا باستخدام PBT لمنع الأدمغة من الالتصاق بداخل الطرف.
    4. قم بتركيب العقول وفقا للاستراتيجيات التالية (الشكل 2 أ).
      1. الجانب الأمامي لأعلى
        ملاحظة: لتصور الخلايا العصبية الصفيحة والنخاع ، قم بتوجيه الدماغ مع الجانب الأمامي لأعلى (الشكل 2B). يمكن تحقيق ذلك من خلال فحص تشريح وانحناء فصوص الهوائي المركزية.
        1. باستخدام زوج من الملقط ، أدر الدماغ برفق على جانبه لفحص الجانبين الأمامي والخلفي. لاحظ أنه على الجانب الأمامي ، يكون انحناء الدماغ واضحا وتبرز فصوص الهوائي قليلا للخارج من المركز.
      2. الجانب الخلفي لأعلى
        1. ضع الأدمغة بحيث يكون الجانب الخلفي (المسطح) متجها لأعلى وفصوص الهوائي لأسفل (الشكل 2C).
          ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى تقريب صفيحة الفصيص والفصيصات من سطح التصوير وهو مثالي للمهتمين بتصور الخلايا العصبية المعقدة الفصيصية.
      3. عرض أفقي
        ملاحظة: لتصور جميع الخلايا العصبية للفص البصري في وقت واحد ، استخدم استراتيجية تركيب أفقية (الشكل 2G). في هذا الاتجاه ، يمكن تصور أجسام الخلايا العصبية والمسارات المحورية والتشجير الشجيري في نفس المستوى.
        1. في البداية ، قم بتوجيه الدماغ مع الجانب الأمامي لأعلى. باستخدام إبرة التنغستن ، قم بإمالة الدماغ برفق 90 درجة لأعلى بحيث يجلس على جانبه الظهري مع توجيه فصوص الهوائي للخارج. تأكد من أن كلا الجانبين الأمامي والخلفي للدماغ مرئيان في هذا الاتجاه.
    5. بدلا من جسر انزلاق الغطاء ، استخدم الطين لرفع انزلاق الغطاء من الشريحة. يسمح استخدام الطين بإعادة تركيب الأدمغة بعد التصوير (الموصوف في قسم المناقشة).
      1. ضع قطعة صغيرة من الطين على كل ركن من أركان قسيمة الغطاء. تأكد من أن كل قطعة من الطين بنفس السماكة نسبيا. يجب أن يتراوح سمك قطع الطين بين 0.5-1 مم. ضع الغطاء برفق على الأدمغة واضغط قليلا على الزوايا. يجب أن يلتقط غطاء الغطاء السائل على الفور ويشكل ختما. الشريحة جاهزة الآن للتصوير.
        ملاحظة: لتخزين الشريحة على المدى الطويل ، يوصى بإغلاق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم عرض الصور متحدة البؤر لليرقات والفصوص البصرية البالغة المثبتة في الاتجاهات الموصوفة في البروتوكول في الشكل 1 والشكل 2.

يوضح الشكل 1 مخططات وشرائح متحدة البؤر تمثيلية لأدمغة اليرقات الموضوعة في الاتجاهات الأمامية والخلفية والجانبية. في اتجاه التركيب الأمامي ، تظهر ظهارة OPC (DE-Cadherin) والخلايا العصبية النخاعية (deadpan>βgal) والخلايا العصبية الصفيحية (الألماني) على السطح كمجموعات من الخل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول ، نصف طريقة لمناعة اليرقات وأدمغة ذبابة الفاكهة البالغة وتركيبها في عدة اتجاهات. في حين أن طرق تلطيخ أدمغة اليرقات والبالغين قد تم وصفها سابقا22،23،24،27،28 ، فإن استراتيجيات التركيب للتصور الأمثل لهياكل الفص البصري المحددة قد حظيت باهتمام أقل28. من المتوقع أن يوفر البروتوكول الموصوف هنا للباحثين فهما أكبر للع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نود أن نشكر كلود ديسبلان لمشاركتنا حصصا من الجسم المضاد Bsh. تم الحصول على الأجسام المضادة أحادية النسيلة DE-Cadherin و Dachshund و Eyes Absent و Seven-up و Bruchpilot من بنك الدراسات التنموية Hybridoma Bank ، الذي أنشأه NICHD التابع للمعاهد الوطنية للصحة وتم الحفاظ عليه في جامعة أيوا ، قسم علم الأحياء ، مدينة أيوا ، IA 52242. تم دعم هذا العمل من خلال منحة اكتشاف NSERC الممنوحة ل T.E. يتم دعم U.A. من خلال منحة NSERC Alexander Graham Bell Canada للخريجين. يتم دعم PV من خلال منحة أونتاريو للدراسات العليا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10x PBSBioshopPBS405
37٪ فورمالديهايدBioshopFOR201
Alexa Fluor 488 (الماعز) الثانويInvitrogenA-11055استخدام في الساعة 1:500
Alexa Fluor 555 (الماوس) استخدامInvitrogenA-31570الثانوي في الساعة 1:500
Alexa Fluor 647 (خنزير غينيا) الثانويInvitrogenA-21450الاستخدام في الساعة 1:500
Alexa Fluor 647 (الفئران) الثانويInvitrogenA-21247استخدام في الساعة 1:500
زلات الغطاءVWR48366-067
الملقط - # 5Dumont11251-10
الملقط - # 55Dumont11295-51
تشريح طبقCorning722085
مناديل جافةKimbery Clark34155
استخدام الأجسام المضادة الأولية للماعز المضادة ل Bgalعند 1: 1000
Sarstedt72.706.600
شرائح المجهر VWRCA4823-180
الفأر المضاد للجسم المضاد الأولي DACدراسات التنموية بنك الورم الهجين (DSHB)استخدام mabdac2-3في الساعة 1:20
استخدام الجسم المضاد الأساسي للفأرDSHBeya10H6في الساعة 1:20
استخدام الجسم المضاد الأساسي للفأر المضاد ل nc82DSHBnc82في الساعة 1:50
الماوس استخدام الجسم المضاد الأساسي المضاد ل SVPDSHBSeven-up 2D3عند 1: 100
Polymer Clayاستخدام
استخدام الأرانب المضادة ل GFPInvitrogenA-11122عند 1: 1000
الجسم المضاد الأولي للجرذ المضاد ل DE-CadherinDSHBDCAD2عند 1:20
وسط تركيب SlowfadeInvitrogenS36967يمكن أيضا استخدام وسيط تركيب Vectashield (cat # H-1000)
Triton-x-100BioshopTRX506
تشريح تشريح هدية من الأجسام المضادة الأولية لخنزير غينيا المضادة ل Bsh هدية من استخدام Claude Desplan في الساعة 1: 500 الجسم المضاد الأساسي لخنزير غينيا المضاد ل Vsx1 Erclik et al. 2008 الاستخدام في 1: 1000 فيلم مختبر Parafilm PM-996 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة يمكن أي نوع من الطين استخدام

المراجع

  1. Fischbach, K. -F., Dittrich, A. P. M. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell Tissue Research. 258, (1989).
  2. Hofbauer, A., Campos-Ortega, J. A. Proliferation pattern and early differentiation of the optic lobes in Drosophila melanogaster. Roux's Archives of Developmental Biology. 198, 264-274 (1990).
  3. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design Principles of Insect and Vertebrate Visual Systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
  4. Nériec, N., Desplan, C. From the Eye to the Brain. Development of the Drosophila Visual System. Current Topics in Developmental Biology. 116, Academic Press Inc. 247-271 (2016).
  5. Apitz, H., Salecker, I. A Challenge of Numbers and Diversity: Neurogenesis in the Drosophila Optic Lobe. Journal of Neurogenetics. 28, 233-249 (2014).
  6. Contreras, E. G., Sierralta, J., Oliva, C. Novel strategies for the generation of neuronal diversity: Lessons from the fly visual system. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 140(2019).
  7. Erclik, T., Hartenstein, V., Lipshitz, H. D., McInnes, R. R. Conserved Role of the Vsx Genes Supports a Monophyletic Origin for Bilaterian Visual Systems. Current Biology. 18, 1278-1287 (2008).
  8. Erclik, T., Hartenstein, V., McInnes, R. R., Lipshitz, H. D. Eye evolution at high resolution: The neuron as a unit of homology. Developmental Biology. 332, 70-79 (2009).
  9. Wu, M., et al. Visual projection neurons in the Drosophila lobula link feature detection to distinct behavioral programs. eLife. 5, (2016).
  10. Ngo, K. T., Andrade, I., Hartenstein, V. Spatio-temporal pattern of neuronal differentiation in the Drosophila visual system: A user's guide to the dynamic morphology of the developing optic lobe. Developmental Biology. 428, 1-24 (2017).
  11. Li, X., et al. Temporal patterning of Drosophila medulla neuroblasts controls neural fates. Nature. 498, 456-462 (2013).
  12. Erclik, T., et al. Integration of temporal and spatial patterning generates neural diversity. Nature. 541, 365-370 (2017).
  13. Apitz, H., Salecker, I. A region-specific neurogenesis mode requires migratory progenitors in the Drosophila visual system. Nature Neuroscience. 18, 46-55 (2015).
  14. Suzuki, T., Kaido, M., Takayama, R., Sato, M. A temporal mechanism that produces neuronal diversity in the Drosophila visual center. Developmental Biology. 380, 12-24 (2013).
  15. Hara, Y., Sudo, T., Togane, Y., Akagawa, H., Tsujimura, H. Cell death in neural precursor cells and neurons before neurite formation prevents the emergence of abnormal neural structures in the Drosophila optic lobe. Developmental Biology. 436, 28-41 (2018).
  16. Morante, J., Erclik, T., Desplan, C. Cell migration in Drosophila optic lobe neurons is controlled by eyeless/Pax6. Development. 138, 687-693 (2011).
  17. Millard, S. S., Pecot, M. Y. Strategies for assembling columns and layers in the Drosophila visual system. Neural Development. 13, 1-17 (2018).
  18. Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: The input terminals to the medulla. Journal of Comparative Neurology. 509, 493-513 (2008).
  19. Akin, O., Bajar, B. T., Keles, M. F., Frye, M. A., Zipursky, S. L. Cell-type-Specific Patterned Stimulus-Independent Neuronal Activity in the Drosophila Visual System during Synapse Formation. Neuron. 101, 894-904 (2019).
  20. Spratford, C. M., Kumar, J. P. Dissection and immunostaining of imaginal discs from drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (91), e51792(2014).
  21. Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resoluton of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122, Cambridge, England. 4139-4147 (1996).
  22. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. Journal of visualized experiments. , e4347(2012).
  23. Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains. Journal of Visualized Experiments. , e56174(2017).
  24. Williamson, R. W., Hiesinger, R. P. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. , e1936(2010).
  25. Bertet, C., et al. Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper. Cell. 158, 1173-1186 (2014).
  26. Pinto-Teixeira, F., et al. Development of Concurrent Retinotopic Maps in the Fly Motion Detection Circuit. Cell. 173, 485-498 (2018).
  27. Plevock, D. A., Rusan, K. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. , e51756(2014).
  28. Ting, C. Y., et al. Analyzing dendritic morphology in columns and layers. Journal of Visualized Experiments. , e55410(2017).
  29. Özel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. eLife. 4, (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Drosophila PBS
تشريح وكيمياء الهيستولوجية المناعية وتركيب أدمغة ذبابة الفاكهة اليرقية والبالغة لتصور الفص البصري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.