مقالة منهجية

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

DOI:

10.3791/61285

⸱

يونيو 13, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Microbiological Analysis Team, Group for Biometrology, Korea Research Institute of Standards and Science (KRISS), 2College of Pharmacy, Chungnam National University (CNU), 3Stem Cell Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), 4Convergent Research Center for Emerging Virus Infection, Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT), 5Department of Bio-Analysis Science, University of Science & Technology (UST)

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يتم تقديم طرق لفهم الآثار المضادة للسرطان من اللاكتوباكيلوس الخلايا الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS). تظهر خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم وفيات الخلايا عند علاجها باستخدام LCFS في الثقافات ثلاثية الأبعاد. يمكن تحسين عملية توليد كرويدات اعتمادا على السقالة وأساليب التحليل المقدمة مفيدة لتقييم مسارات الإشارات المعنية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لتقييم وفيات الخلايا السرطانية في كرويات ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لأنواع متعددة الخلايا من الخلايا السرطانية باستخدام الخلايا الخارقة من زراعة خلايا الاختمار اللاكتوباكيلوس ، التي تعتبر ثقافات البروبيوتيك. استخدام الثقافات ثلاثية الأبعاد لاختبار اللاكتوباكيلوس الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS) هي خيار أفضل من الاختبار في الطبقات الأحادية ثنائية الأبعاد ، خاصة وأن L. fermentum يمكن أن تنتج تأثيرات مضادة للسرطان داخل الأمعاء. تم تحديد L. fermentum supernatant لامتلاك زيادة الآثار المضادة للتكاثر ضد العديد من خلايا سرطان القولون والمستقيم (CRC) في ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد. ومن المثير للاهتمام أن هذه الآثار كانت مرتبطة بقوة بنموذج الثقافة، مما يدل على القدرة الملحوظة ل. فيمرخوم للحث على موت الخلايا السرطانية. تم إنشاء كرويات مستقرة من CRCs متنوعة (خلايا سرطان القولون والمستقيم) باستخدام البروتوكول المعروض أدناه. هذا البروتوكول لتوليد كرويد 3D هو توفير الوقت وفعالة من حيث التكلفة. وقد تم تطوير هذا النظام للتحقيق بسهولة في الآثار المضادة للسرطان من LCFS في أنواع متعددة من كرويدات لجنة حقوق الطفل. كما هو متوقع، عالجت كرويات CRC مع LCFS موت الخلايا المستحث بقوة خلال التجربة وأعربت عن علامات جزيئية محددة للخلايا المبرمج كما تم تحليلها من قبل qRT-PCR، النشاف الغربي، وتحليل FACS. لذلك، هذه الطريقة قيمة لاستكشاف صلاحية الخلايا وتقييم فعالية الأدوية المضادة للسرطان.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروبيوتيك هي الكائنات الحية الدقيقة الأكثر فائدة في القناة الهضمية التي تحسن التوازن المناعي واستقلاب الطاقة المضيف1. البروبيوتيك من اللاكتوباكيلوس وبيفيدوباكتريا هي الأكثر تقدما من نوعها وجدت في الأمعاء2،3. وقد أظهرت التحقيقات السابقة أن Lactobacillus له آثار مثبطة ومكافحة الانتشار على العديد من أنواع السرطان, بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم4. وعلاوة على ذلك، البروبيوتيك منع أمراض التهاب الأمعاء، ومرض كرون، والتهاب القولون التقرحي5،6. ومع ذلك، أجريت معظم الدراسات مع البروبيوتيك في أحادية الأبعاد ثنائية الأبعاد (2D) التي تزرع على الأسطح الصلبة.

تفتقر أنظمة الثقافة الاصطناعية إلى السمات البيئية، وهو أمر غير طبيعي بالنسبة للخلايا السرطانية. للتغلب على هذا القيد، تم تطوير أنظمة ثقافة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)7و8. تظهر الخلايا السرطانية في 3D تحسينات من حيث الآليات البيولوجية الأساسية ، مثل صلاحية الخلية ، والانتشار ، والمورفولوجيا ، والاتصالات الخلوية ، وحساسية الدواء ، وفيأهميةالجسم الحي 9،10. وعلاوة على ذلك، يتم إجراء كرويدات من أنواع متعددة الخلايا من سرطان القولون والمستقيم وتعتمد على التفاعلات الخلية الخلية ومصفوفة خارج الخلية (ECM)11. وقد ذكرت دراستنا السابقة أن الخلايا بروبيوتيك خالية من الخلايا supernatant (CFS) المنتجة باستخدام اللاكتوباكيلوس fermentum أظهرت آثار مضادة للسرطان على الثقافات 3D من سرطان القولون والمستقيم (CRC) خلايا12. اقترحنا أن لجنة الأمن الغذائي العالمي هو استراتيجية بديلة مناسبة لاختبار آثار بروبيوتيك على كرويدات 3D12.

هنا, نقدم نهجا يمكن أن تستوعب أنواع متعددة الخلايا من سرطان القولون والمستقيم 3D لتحليل الآثار العلاجية للخلايا بروبيوتيك supernatant خالية (CFS) على العديد من أنظمة محاكاة سرطان القولون والمستقيم 3D. توفر هذه الطريقة وسيلة لتحليل الآثار ذات الصلة بروبيوتيك ومكافحة السرطان في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. زراعة الخلايا البكتيرية وإعداد اللاكتوباكيلوس الخالية من الخلايا الفائقة (LCFS)

ملاحظة: يتم إجراء الخطوات 1.2 - 1.9 في غرفة اللاهوائية.

  1. إعداد لوحة أجار MRS ومرق تحتوي على L-السيستين وتعقيمها عن طريق الالاستعباد التلقائي.
  2. قبل احتضان لوحة أجار MRS في H2 غرفة اللاهوائية الحفاظ على 37 درجة مئوية مع الأكسجين 20 ppm.
  3. ذوبان اللاكتوباكيلوس الأسهم البكتيرية وتطعيم لوحة أجار مع الثقافة البكتيرية (الشكل 1A (1)).
  4. احتضان البكتيريا لمدة 2-3 أيام في H2 غرفة اللاهوائية في 37 درجة مئوية و 20 صفحة في الدقيقة الأكسجين حتى يتم الحصول على مستعمرات بكتيرية واحدة.
  5. غسل وتجفيف نوع Hungate أنبوب الثقافة اللاهوائية. أوتوكلاف أنبوب الثقافة في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. ثم احتضان الأنبوب في H2 غرفة اللاهوائية في 37 درجة مئوية و 20 ppm الأكسجين لإزالة الأكسجين.
  7. مكان 2 - 3 مل من مرق MRS في الأنبوب. ختم أنبوب مع سدادة مطاطية بوتيل والمسمار الغطاء.
  8. الحصول على مستعمرة واحدة مع حلقة ووضعها في أنبوب الثقافة 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1x. (الشكل1A (2)).
  9. تعليق المستعمرة باستخدام حقنة 1 مل (الشكل 1A (iii)). القيام بذلك عن طريق, إدراج إبرة من حقنة 1 مل في وسط غطاء أنبوب, قرصنة مستعمرة علقت ومن ثم إعادة تعليق مرة أخرى في وسائل الإعلام مرق MRS. (الشكل 1A (4)).
  10. احتضان وسائل الإعلام مرق MRS في حاضنة شاكر لمدة 2 أيام (37 درجة مئوية، 5٪ CO2، 200 دورة في الدقيقة).
  11. قياس الكثافة البصرية (OD) باستخدام مطياف لرصد منحنيات النمو البكتيري حتى يصل الامتصاص في OD620 إلى 2.0.
  12. فصل الكريات البكتيرية ووسائل الإعلام مشروطة عن طريق الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 15 دقيقة. غسل الكريات البكتيرية التي تم جمعها مع برنامج تلفزيوني 1x وإعادة الإنفاق في 4 مل من RPMI 1640 تكملها مع 10٪ مصل البقر الجنين. لا تقم بتضمين أي مضادات حيوية في الوسط.
  13. الحفاظ على الكريات البكتيرية في RPMI واحتضان في حاضنة شاكر لمدة 4 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 بسرعة 100 دورة في الدقيقة.
  14. لإعداد بروبيوتيك supernatant, إزالة بيليه البكتيرية عن طريق الطرد المركزي في 1000 x ز, لمدة 15 دقيقة في 4 °C. قم بتصفية المسخ الفائق المسترد باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر وتخزينه عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. جيل من كرويدات

  1. إعداد خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم
    1. تنمو DLD-1، HT-29، وخطوط خلايا WiDr كطبقات أحادية حتى 70-80٪ التقاء واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة5٪ CO 2 (متوسط النمو: RPMI تحتوي على 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين-streptomycin).
    2. للخلايا التي تزرع في طبق بيتري 100 ملم، وغسل لوحة مرتين مع 4 مل من برنامج تلفزيوني 1x. إضافة 1 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA واحتضان طبق بيتري لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة5٪ CO 2 لتفكك الخلايا.
    3. بعد الحضانة، تحقق من تفكك الخلية تحت المجهر وتحييد التريبسين-EDTA مع 5 مل من متوسط النمو.
    4. نقل الخلايا المفككة إلى أنبوب مخروطي 15 مل وطارد مركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × ز.
    5. تجاهل supernatant و resuspend بلطف مع 3 مل من وسائل الإعلام النمو.
    6. عد الخلايا مع تريبان الأزرق لتحديد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم. (الشكل 1B (1))
  2. تشكيل كروي
    1. في أنبوب مخروطي 15 مل، تمييع الخلايا من 2.1.5 للحصول على 1- 2 × 105 خلايا / مل (الشكل 1B (2))
    2. إضافة تركيز النهائي من 0.6٪ ميثيلسليلوز إلى تعليق الخلية ونقل الخلايا المخففة إلى خزان معقم.
      ملاحظة: لكل خط الخلية، يجب أن يتم إعادة كمية الميثيلسليلوز اللازمة وتحديد وفقا لذلك.
    3. استخدام ماصة متعددة القنوات للاستغناء عن 200 ميكرولتر من الخلايا إلى كل بئر من مرفق منخفض جدا 96 جيدا جولة أسفل لوحة صغيرة. (الشكل 1B (iii))
    4. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة5٪ لمدة 24 - 36 ساعة.
    5. بعد 24 - 36 ساعة، مراقبة لوحة تحت المجهر الخفيف لضمان تشكيل كروية.

3. علاج الخلايا السرطانية ثلاثية الأبعاد مع LCFS

  1. إنشاء كرويدات كما هو موضح في الخطوتين 2 و 3.
  2. قبل إجراء علاج LCFS، قم بإذابة LCFS المجمدة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 -20 دقيقة.
  3. تلقيح حل أسهم LCFS في وسيط نمو. تخفيف تسلسلي إلى 25٪، 12.5٪، و 6٪ في متوسط النمو (أي، 25٪ LCFS = 150 ميكرولتر من متوسط النمو + 50 ميكرولتر من LCFS).
  4. إخراج لوحة ثقافة الخلية التي تحتوي على كرويدات من الحاضنة وإزالة أكبر قدر ممكن من متوسط النمو من كل بئر باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  5. أضف وسائط النمو مع LCFS على الخلايا واحتضن عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ لمدة 24 - 48 ساعة.
    ملاحظة: يعتمد الحجم الذي سيتم استخدامه على حجم اللوحة كما يلي: 2 مل لصفائح زراعة الخلايا ذات 6 آبار؛ و 2 مل للوحة زراعة الخلايا ذات الخلايا 6-well; 200 ميكرولتر ل 96 لوحة ثقافة خلايا جيدة.

4. صلاحية الخلية للشفرات

  1. إعداد 8 - 10 كرويدات سرطان القولون والمستقيم المعالجة LCFS في لوحات متعددة الآبار مبهمة الجدران (يتم إجراء مقايسات قابلية بقاء الخلية 48 ساعة بعد علاج LCFS).
  2. إذابة كاشف قابلية الخلية (راجع جدول المواد)عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لليلة واحدة.
  3. توازن الكاشف قدرة الخلية على البقاء لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
  4. قبل إجراء الفحص، قم بإزالة 50٪ من وسائط النمو من كرويدات.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من كاشف قدرة الخلية على البقاء إلى كل بئر.
    ملاحظة: يعتمد الحجم الذي سيتم استخدامه على حجم اللوحة كما يلي: 100 ميكرولتر لألواح زراعة الخلايا ذات 96 بئرا.
  6. خلط الكاشف بقوة لمدة 5 دقائق لتعزيز تحلل الخلية.
  7. حضانة لمدة 30 دقيقة - 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
  8. سجل التألق.

5. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي للشفرات

  1. لكل حالة، وإعداد 10-15 كروية في أنبوب 2 مل والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 400 × ز.
  2. تجاهل supernatant وغسل كرويدات مرتين في 1 مل من الجليد الباردة 1x PBS.
    ملاحظة: تجنب الطرد المركزي، دع كرويدات تستقر.
  3. يستنشق أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني 1x وعزل الجيش الملكي النيبالي باستخدام مجموعة متاحة تجاريا.
  4. توليف cDNA من 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي باستخدام عدة المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  5. إعداد مزيج رئيسي لتشغيل كافة العينات في ثلاثية (انظر الجدول 1 والجدول 2).
  6. قم بإجراء التضخيم في 20 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للقالب في كل لوحة qPCR بشكل جيد.
  7. مزيج ردود الفعل بشكل جيد وتدور إذا لزم الأمر.
  8. تشغيل العينات وفقا لتوصيات الشركة المصنعة للآلة (الجدول 3).

6. النشاف الغربي من كرويدات

ملاحظة: عند جمع كرويدات، استخدم ماصة 200 ميكرولتر وقطع نهاية النصائح لتجنب إزعاج هيكلها.

  1. لكل حالة، وإعداد 30-40 كروية في أنبوب 2 مل.
  2. ضع الأنبوب على الجليد ودع كرويدات تستقر في الجزء السفلي من أنبوب 2 مل.
  3. تجاهل supernatant وغسل كرويدات مرتين في 1 مل الجليد الباردة 1x PBS
    ملاحظة: تجنب الطرد المركزي، دع كرويدات تستقر.
  4. اسبيرات أكبر قدر ممكن من برنامج تلفزيوني 1x وإضافة RIPA العازلة مع كوكتيل مثبط بروتيز (10 كرويدات = 30 ميكرولتر من العازلة RIPA).
  5. Lyse الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا وأداء سونيكيشن لمدة 30 ق مع 30 ق من يستريح على الجليد لمدة 10 دورات.
  6. الطرد المركزي lysates البروتين في 15000 س غ لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  7. تحديد تركيز البروتين لكل خلية lysate.
  8. قبل التحميل، قم بغلي كل خلية في عينة عازلة عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  9. تحميل كميات متساوية من البروتين في آبار هلام SDS-PAGE وتشغيل هلام لمدة 1- 2 ساعة في 100 V.
  10. نقل البروتين من الجل إلى غشاء PVDF.
  11. بعد نقل، منع الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام العازلة حجب (5٪ الحليب الخالي من الدسم + TBS مع 0.05٪ توين-20).
  12. احتضان الغشاء مع 1:1,000 التخفيف من الأجسام المضادة الأولية (الجدول 4) في TBST 1x مع 5٪ BSA العازلة في 4 °C بين عشية وضحاها.
  13. غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBST، 15 دقيقة لكل غسل.
  14. احتضان الغشاء مع 1:2,500 تمييع الأجسام المضادة الثانوية في العازلة حجب في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة (انظر جدول المواد).
  15. غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBST، 15 دقيقة لكل غسل.
  16. إعداد الغشاء للكشف HRP مع ركيزة chemiluminescent.
  17. الحصول على صور تشيميلومينيسنت.

7. بروبيديوم يوديد (PI) تلطيخ كرويدات

  1. إعداد 5-10 كرويات كما هو موضح في الخطوة 4.1 ووضع كرويدات في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  2. تمييع 1 ملغ / مل من الأسهم PI 1:100 في برنامج تلفزيوني 1x.
  3. إزالة 50٪ من المتوسط من كل بئر من لوحة 96 جيدا.
  4. أضف 100 ميكرولتر من محلول PI لكل بئر وضع الآبار في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 10 - 15 دقيقة.
  5. اغسل محلول PI باستخدام برنامج تلفزيوني 1x.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من متوسط النمو واتخاذ صورة باستخدام المجهر مضان. تحليل كثافة الفلورية باستخدام صورة J للحصول على عدد صلاحية كروية.

8. تحليل FACS للشفرات

  1. إنشاء كرويات كما هو موضح سابقا.
  2. لكل حالة، قم بإعداد 30-40 كروية في أنبوب FACS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 400 × ز وRT.
  3. اسبيرات supernatant وغسل كرويدات في 3 مل من برنامج تلفزيوني 1x، ثم الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 3 دقائق في 4 درجة مئوية.
  4. أسبيرات supernatant وإضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA، ثم احتضان في RT لمدة 2-3 دقائق.
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على حجم كروية ونوع الخلية.
  5. إضافة 1 مل من العازلة FACS وتفكيك بلطف كرويدات باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  6. الطرد المركزي الخلايا المفككة في 400 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: FACS المخزن المؤقت = 1x PBS + 2.5٪ FBS، تمت تصفيته باستخدام مرشح أعلى 0.22 ميكرومتر.
  7. تجاهل supernatant وإضافة 7-AAD/Annexin V كاشف (7AAD (5 ميكرولتر)، Annexin V (5 ميكرولتر)/عينة).
  8. دوامة بلطف الخلايا واحتضان لمدة 13 -30 دقيقة في RT في الظلام.
  9. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة FACS وتصفية الخلايا باستخدام أنابيب اختبار البوليسترين مخروطية لإزالة الخلايا المجمعة.
  10. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق.
  11. إضافة 500 ميكرولتر من الملحق الخامس العازلة ملزمة لكل أنبوب وإعادة الإنفاق.
  12. تحليل باستخدام مقياس التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف بروتوكول الحصول على كرويدات من خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم المتنوعة. وكان مطلوبا مكملات مع ميثيلسليلوز لتوليد كرويدات. كما نقدم طريقة لإعداد LCFS وتقديم نموذج لدراسة العلاقة بين البروبيوتيك وسرطان القولون والمستقيم. يتم توضيح تشكيل كروي وبروتوكولات إعداد LCFS تخطيطيا في الشكل 1A،B. كما هو مبين في الشكل 2A، تركيز ميثيلسليلوز من 0.6 ٪ يحول الخلايا السرطانية إلى كرويدات مدمجة. تشير هذه النتيجة إلى أنه يمكن توليد كرويدات من عدة أنواع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البيئة الدقيقة للأنسجة، بما في ذلك الخلايا المجاورة والمصفوفة خارج الخلية (ECM)، أمر أساسي لتوليد الأنسجة وحاسمة في السيطرة على نمو الخلايا وتطوير الأنسجة13. ومع ذلك ، فإن الثقافات 2D لها العديد من العيوب ، مثل تعطيل التفاعلات الخلوية ، وكذلك التعديلات في مورفولوجيا الخلايا ، والبيئات خارج الخلية ، ونهج القسم14. وقد درست بدقة نظم زراعة الخلايا 3D لتحسين إنتاج في آثار الجسم الحي, وثبت كأنظمة أكثر دقة لاختبار السرطان في المختبر15,

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يملك صاحبا البلاغ أي إفصاحات مالية ذات صلة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا البحث "وضع معايير قياس الكيمياء والإشعاع"، ورقم المنحة KRISS-2020-GP2020-0003، و"تطوير معايير القياس والتكنولوجيا للمواد الحيوية والتقارب الطبي"، ورقم المنحة KRISS-2020-GP2020-0004، بتمويل من المعهد الكوري للبحوث للمعايير والعلوم. كما تم دعم هذا البحث من قبل وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (MSIT)، والمؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF-2019M3A9F3065868)، ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية (MOHW)، والمعهد الكوري لتنمية الصناعة الصحية (KHIDI، HI20C0558)، ووزارة التجارة والصناعة والطاقة (MOTIE)، ومعهد التقييم الكوري للتكنولوجيا الصناعية (KEIT، 20009350). معرف ORCID (هي مين يو: 0000-0002-5951-2137; دوكجين كانغ: 0000-0002-5924-9674; سيل كيم: 0000-0003-3465-7118; جو أون لي: 0000-0002-2495-1439; جينا لي: 0000-0002-3661-3701). نشكر تشانغ وو بارك للمساعدة في التجارب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات

10٪ Mini-PROTEAN TGX جل البروتين مسبقة الصب ، 15 بئر ، 15 وميكرو ؛ ل		Biorad4561036Pkg من 10
أنظمة حيوية مطبقة MicroAmp فيلم لاصق بصريThermo Fisher Scientific4311971100 يغطي 10x
عازلة نقلIntronIBS-BT031A1 L
10X Tris-Glycine (W / SDS) IntronIBS-BT0141 L
Axygen 2.0 مل MaxyClear Snaplock أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، بولي بروبيلين ، شفاف ، غير معقم ، 500 أنبوب / حزمة ، 10 عبوات / علبةCorningSCT-200-C500 أنبوب / عبوة ، 10 عبوات / علبة
BD Difco Bacto AgarBD214010500 جرام
BD Difco Lactobacilli MRS BrothBDDF0881-17-5500 جم
CellTiter-Glo 3D Cell مقايسة الجدوىPromegaG9681100 & mu ؛ L / الفحص في 96 بئر لوحات كاملة
كوكتيل مثبط البروتيازSigma-Aldrich11697498001قارورة من 20 قرصا Corning
Phosphate-Buffered Saline ، 1X بدون الكالسيوم والمغنيسيوم ، PH 7.4 & plusmn ؛ 0.1Corning21-040-CV500 مل
EMD Millipore Immobilon-P PVDF Transfer MembranesScientificIPVH0001026.5 سم × 3.75 م لفة ؛ حجم المسام: 0.45um
Falcon 5 مل أنبوب اختبار البوليسترين القاع المستدير ، مع غطاء خلية مصفاةخلية Corning35223525 / حزمة ، 500 / حالة
مصل بقري الجنين ، معتمد ، من أصل أمريكيThermo Fisher Scientific16000044500 مل
iScript cDNA Synthesis Kit ، 25 × 20 & micro ؛ l rxns # 1708890Biorad170889025 × 20 & micro; L rxns
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad17251215 × 1 مل
Lactobacillus fermentumالمجموعة الكورية للثقافات المتنوعةKCTC 3112
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-AldrichC6852-25G25 جم
ميثيل السليلوز (3500-5600mPa & middot ؛ ق ، 2٪ في الماء عند 20 درجة ؛ ج)TCIM0185500 جم
MicroAmp لوحة تفاعل بصرية سريعة 96 بئر مع الباركود ، 0.1 ملأنظمة حيوية مطبقة434690620 لوحة
وحدة تصفية حقنة Millex-GS ، 0.22 وميكرو ؛ م ، استرات السليلوز المختلطة ، 33 مم ، أكسيد الإيثيلين المعقمب MilliporeSLGS033SB250
PE Annexin V طقم الكشف عن موت الخلايا المبرمج مع 7-AADBiolegend640934100 اختبار
البنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)Thermo Fisher Scientific15140122100 مل
بروبيديوم يوديدIntrogenP1304MP100 مجم
RIPA تحلل واستخراج المخزن المؤقتثيرمو فيشر Scientific89901250 مل
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen74106250
RPMI-1640Gibco11875-119500 مل
Trypsin-EDTA (0.25٪) ، فينول أحمرThermo FisherScientific 25200056100 مل
< قوي>اسم المواد / المعدات / البرامج< strong>الشركة< قوي قوي><قوي>رقم الكتالوجتعليقات / وصف
anti - p-Iκ ب & ألفا (باء-9)سانتا كروزsc-8404200 & micro; جم / مل
مضاد ل BclxL (H-5) سانتاكروزsc-8392200 & micro ؛ جم / مل
مضاد ل PARP 1 (C2-10) سانتاكروزSC-5364350 & مايكرو ؛ ل الاستسقاء
المضاد للبيتا ؛ الأكتين (C4) سانتاكروزSC-47778200 & micro ؛ جم / مل
BD FACSVerseBD Biosciences ساندييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
Synergy HTX Multi-Mode Microplate ReaderBioTS1LFA
CO2 حاضنةثيرمو فيشرHERAcell 150i
أنبوب مخروطي 15 ملSPL50015
أنبوب مخروطي 50 ملSPL50050
مرفق كورنينج كوستار فائق الارتفاع لوحة الآبار المتعددةسيجما ألدريتشCLS7007
كورنينج كوستار مرفق منخفض للغاية لوحة آبار متعددةسيجما ألدريتشCLS3471
كوستار 50 مل كاشف خزانات ، 5 / كيس ، معقمكوستار4870
غرفة عد خلايا الكونتيسةThermofisherC10228
الكونتيسة II FL عداد الخلايا الآليinvitrogenAMQAF1000
EnSpire Multimode ReaderPerkin ElmerEnspire 2300
Eppendorf Research Plus ماصة متعددة القنوات ، 8 قنواتEppendorf3122000051
برنامج FlowJoTreeStarAshland ، OR ، الولايات المتحدة الأمريكية
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) Jacksonimmunoresearch115-035-0621.5 مل
IgG مضاد للأرانب للماعز (H + L)Jackson immunoresearch111-035-1442.0 مل
GraphPad Prism 5GraphPad SoftwareInc. ، سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية
ImageJNIH
ImageQuant LAS 4000 miniFujifilmطوكيو ، اليابان
رفيق مختبر شاكر المحتضنSIF-6000R
Multi Gauge الإصدار 3.0 ،فوجي فيلمطوكيو ، اليابان
الكثافة البصرية (OD) لامدا الأشعة فوق البنفسجية / مقاييس الطيفبيركين إلمروالثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة
الأمريكية مجهر تباين الطورأوليمبوسطوكيو ، اليابان
أنبوب الطرد المركزي الصغير SPL 1.5 ملSPL60015
خزانات متعددة القنوات SPL ، 12 قناة ، PS ، معقمSPL21012
PCRفي الوقت الحقيقي StepOnePlusثيرمو فيشر العلميوالثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية
معالجات السائل بالموجات فوق الصوتية Vibra-CellSONICS-vibra CELLVC 505500 وات معالج بالموجات فوق الصوتية
غرفة الفينيل اللاهوائيةمنتجات مختبر
fisher شرائح الضوئي نظام COY

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bron, P. A., Van Baarlen, P., Kleerebezem, M. Emerging molecular insights into the interaction between probiotics and the host intestinal mucosa. Nature Reviews Microbiology. 10 (1), 66-78 (2012).
  2. Ruiz, L., Delgado, S., Ruas-Madiedo, P., Sánchez, B., Margolles, A. Bifidobacteria and their molecular communication with the immune system. Frontiers in Microbiology. 8, 1-9 (2017).
  3. Sanders, M. E., Merenstein, D. J., Reid, G., Gibson, G. R., Rastall, R. A. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (10), 605-616 (2019).
  4. Pandey, K. R., Naik, S. R., Vakil, B. V. Probiotics, prebiotics and synbiotics- a review. Journal of Food Science and Technology. 52 (12), 7577-7587 (2015).
  5. Harish, K., Varghese, T. Probiotics in humans-evidence based review. Calicut Medical Journal. 4 (4), 3(2006).
  6. Routy, B., et al. The gut microbiota influences anticancer immunosurveillance and general health. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (6), 382-396 (2018).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. Most of the cell-based data-harvesting efforts that drive the integration of cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Jong, B. K. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
  10. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  11. Anton, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: A breakthrough in vivo. International Journal of Molecular Sciences. 16 (3), 5517-5527 (2015).
  12. Lee, J. E., et al. Characterization of the Anti-Cancer Activity of the Probiotic Bacterium Lactobacillus fermentum Using 2D vs. 3D Culture in Colorectal Cancer Cells. Biomolecules. 9 (10), 557(2019).
  13. Koledova, Z. 3D cell culture: An introduction. Methods in Molecular Biology. 1612, (2017).
  14. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  15. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 1-14 (2018).
  16. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: The missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  17. Mazzocchi, A. R., Rajan, S. A. P., Votanopoulos, K. I., Hall, A. R., Skardal, A. In vitro patient-derived 3D mesothelioma tumor organoids facilitate patient-centric therapeutic screening. Scientific Reports. 8, 2886(2018).
  18. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  19. Thirumala, S., Gimble, J., Devireddy, R. Methylcellulose Based Thermally Reversible Hydrogel System for Tissue Engineering Applications. Cells. 2 (3), 460-475 (2013).
  20. Chandrashekran, A., et al. Methylcellulose as a scaffold in the culture of liver-organoids for the potential of treating acute liver failure. Cell and Gene Therapy Insights. 4 (11), 1087-1103 (2018).
  21. Lee, W., Park, J. 3D patterned stem cell differentiation using thermo-responsive methylcellulose hydrogel molds. Scientific Reports. 6, 1-11 (2016).
  22. Fan, H., Demirci, U., Chen, P. Emerging organoid models: Leaping forward in cancer research. Journal of Hematology and Oncology. 12 (1), 1-10 (2019).
  23. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  24. Liou, C. S., et al. A Metabolic Pathway for Activation of Dietary Glucosinolates by a Human Gut Symbiont. Cell. 180 (4), 717-728 (2020).
  25. Sherwin, E., Bordenstein, S. R., Quinn, J. L., Dinan, T. G., Cryan, J. F. Microbiota and the social brain. Science. 366 (6465), 2016(2019).
  26. Honda, K., Littman, D. R. The microbiota in adaptive immune homeostasis and disease. Nature. 535 (7610), 75-84 (2016).
  27. Bárcena, C., et al. Healthspan and lifespan extension by fecal microbiota transplantation into progeroid mice. Nature Medicine. 25 (8), 1234-1242 (2019).
  28. Michalovich, D., et al. Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients. Nature Communications. 10, 5711(2019).
  29. Ansaldo, E., et al. Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis. Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Lactobacillus

مقالات ذات صلة