مقالة منهجية

مقايسات للتحقق من صحة مثبطات هيستون أسيتيل ترانسفيراز

6.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61289

⸱

أغسطس 6, 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, and UF Health Cancer Center, University of Florida College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

مثبطات acetyltransferases هيستون (HATs، المعروف أيضا باسم lysine أستيل ترانسفيراليس)، مثل CBP/p300، هي العلاجات المحتملة لعلاج السرطان. ومع ذلك، هناك حاجة إلى أساليب صارمة للتحقق من صحة هذه المثبطات. ثلاث طرق في المختبر للتحقق من الصحة وتشمل المقايسات HAT مع أسيتيل ترانسفيرات المؤتلف، المناعية لاستيل هيستون في ثقافة الخلية، وChip-qPCR.

الملخص

Lysine acetyltransferases (KATs) تحفيز أستيل من بقايا ليسين على histones والبروتينات الأخرى لتنظيم ديناميات الكروماتين والتعبير الجيني. تخضع الـ KATs، مثل CBP/p300، لتحقيق مكثف كأهداف علاجية بسبب دورها الحاسم في الأورام السرطانية المتنوعة. إن تطوير مثبطات جزيء صغير جديدة تستهدف وظيفة أسيتيلtransferase (HAT) من منتجات الطاقة المعدنية الكويتية (هات) يمثل تحدياً ويتطلب مقايسات قوية يمكنها التحقق من خصوصية وفاعلية المثبطات المحتملة.

توضح هذه المقالة خط أنابيب من ثلاث طرق توفر التحقق من صحة في المختبر الصارم لمثبطات HAT جديدة (HATi). وتشمل هذه الطرق اختبار اختبار أنبوب قبعة المقايسة, كروماتين فرط الacetylation تثبيط (ChHAI) اختبار, وChromatin المناعي-PCR الكمية (ChIP-qPCR). في مقايسة HAT، يتم احتضان HATs المؤتلف مع الهستونات في تفاعل أنبوب الاختبار، مما يسمح لالآستيل من بقايا ليسين محددة على ذيول الحجر. ويمكن منع هذا التفاعل بواسطة HATi ويمكن قياس المستويات النسبية من أسيتيل هينيستون محددة الموقع عن طريق المناعة. مثبطات محددة في قبعة المقايسة تحتاج إلى تأكيد في البيئة الخلوية.

يستخدم مقايسة ChHAI مناعيًا لفحص HATi رواية أن تخفيف فرط acetylation قوية من النغمات الناجمة عن مثبط deacetylase هيستون (HDACi). إضافة HDACi مفيد لأن مستويات القاعدية من أسيتيل هينيستون يمكن أن يكون من الصعب الكشف عن طريق المناعة.

ويقيس مقايستا هات وتشهاي التغيرات العالمية في أسيتيل الهيستون، ولكن لا تقدمان معلومات بشأن أسيتيل في مناطق جينية محددة. ولذلك، يتم استخدام ChIP-qPCR للتحقيق في آثار HATi على مستويات أستيل هيستون في العناصر التنظيمية الجينات. ويتم ذلك من خلال التحلل المناعي الانتقائي لمجمعات هيستون-دنا وتحليل الحمض النووي المنقى من خلال qPCR. معا، هذه المقايسات الثلاثة تسمح للتحقق الدقيق من خصوصية، قوة، وآلية العمل من رواية HATi.

المقدمة

ليسين أستيل ترانسفيراديس (KATs) تحفيز أستيل من بقايا ليسين على كل من البروتينات هيستون وغير هيستون1,2,3,4. كشفت الأبحاث الحديثة أن KATs ووظيفة الأسيتيل ترانسفيراز يمكن أن تعزز نمو الورم الصلب4،5،6،7،8،9. على سبيل المثال، بروتين الكريب الملزم (CBP)/p300 هما KATs البارالوجين التي تنظم العديد من مسارات الإشارات في السرطان2،3. CBP/p300 لديها جيدا تتميز هييتيلترانزفيراز (HAT) وظيفة وتحفيز هيستون 3 Lysine 27 أستيل (H3K27ac)2,4,5,10,11, علامة هامة لمعززات النشطة, مناطق المروج والنسخ الجيني النشط12,13,14. CBP/p300 بمثابة المنشطات المشاركة الحرجة Pro-growth signals pathways في الأورام الصلبة عن طريق تفعيل النسخ من أونكوجين من خلال أستيل من histyles وعوامل النسخ الأخرى4,9,15,16,17,18.9 نظرا لدورها في تطور الورم، CBP/p300 وغيرها من الـ KATs هي قيد التحقيق لتطوير مثبطات الرواية التي تمنع وظيفتها oncogenic4,5,6,7,8,9,18,19,20. A-485 و GNE-049 تمثل محاولتين ناجحتين لتطوير مثبطات قوية ومحددة لCBP/p3004,9. ويجري حالياً فحص مثبطات إضافية لـ CBP/p300 وغيرها من الـ KATs.

ويجري الآن مسألة نوعية مثبطات KAT الموصوفة سابقا (KATi) في التشكيك، مع العديد من مثبطات الرياء الآثار المستهدفة وسوء توصيف21. ولذلك ، توصيف صارمة والتحقق من المرشحين المخدرات جديدة أمر ضروري لتطوير تحقيقات كيميائية عالية الجودة. المبينة هنا هي ثلاثة بروتوكولات التي تشكل خط أنابيب لفحص والتحقق بدقة من قوة وخصوصية رواية KATi ، مع التركيز بشكل خاص على تثبيط وظيفة HAT (HATi) من KATs. يستخدم CBP/p300 ومثبطاتها كأمثلة ، ولكن يمكن تكييف هذه البروتوكولات لغيرها من كاوت التي لها وظيفةHAT 7.

البروتوكول الأول هو في المختبر acetyltransferase (HAT) المقايسة التي تستخدم تنقية p300 وhistones في تفاعل أنبوب اختبار تسيطر عليها. هذا المقايسة بسيطة لأداء، هو فعالة من حيث التكلفة، ويمكن استخدامها لفحص المركبات في إعداد الإنتاجية المنخفضة، ولا تتطلب مواد مشعة. في هذا البروتوكول، يتم قياس p300 المؤتلفة lylyzes lysine acetylation على ذيول هيستون خلال فترة حضانة قصيرة ومستويات أسيتيل هيستون باستخدام إجراءات المناعة القياسية. يمكن إجراء التفاعل الأنزيمي في وجود أو عدم وجود مثبطات CBP/p300 لفحص المركبات التي تقلل من أستيلستون. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مقايسة HAT للتحقق مما إذا كانت المركبات الجديدة انتقائية لCBP/p300 من خلال تقييم نشاطها ضد غيرها من الكاتس المنقى، مثل PCAF. إن مقايسة HAT هي نقطة انطلاق ممتازة للتحقيق في مثبطات الرواية نظرًا لبساطتها ، وانخفاض تكلفتها ، والقدرة على تحديد فاعلية / انتقائية المانع. في الواقع، وغالبا ما يستخدم هذا البروتوكول في الأدب كشاشة في المختبر5،10. ومع ذلك، فإن مثبطات تحديد في اختبار HAT ليست فعالة دائما في ثقافة الخلية لأن رد فعل أنبوب الاختبار هو أبسط بكثير من نظام الخلايا الحية. ولذلك، فمن الضروري أن مزيد من تحديد خصائص مثبطات في تجارب ثقافة الخلية22،23.

البروتوكول الثاني في خط الأنابيب هو Chromatin Hyperacetylation تثبيط (ChHAI) المقايسة. هذه الخلية القائمة على المقايسة يستخدم مثبطات deacetylase هيستون (HDACi) كأداة لhyperacetylate الهستون في الكروماتين قبل المشاركة في الحضانة مع HATi24. يمكن أن يكون استيليه هينيلستون القاعدي منخفضًا في ثقافة الخلية ، مما يجعل من الصعب التحقيق فيه عن طريق التلطخ المناعي دون إضافة HDACi لزيادة الأسيتيلية. الغرض من مقايسة ChHAI هو تحديد رواية HATi التي يمكن أن تُثبِّت من الزيادة في أسيتيل هيستون الناجمة عن تثبيط HDAC. وتشمل مزايا هذا الفحص تكلفتها المنخفضة وسهولة الأداء النسبية واستخدام الخلايا في الثقافة، مما يوفر أهمية فسيولوجية أكثر من اختبار أنبوب الاختبار HAT. على غرار مقايسة HAT، يستخدم هذا البروتوكول مناعة معيارية لجمع البيانات.

تقدم مقايسات HAT و ChHAI بيانات حول قوة المركبات الجديدة لمنع أسيتيل الهيستون العالمي ، ولكنها لا توفر نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير هذه المركبات على التعديلات في مناطق جينومية محددة. ولذلك، فإن البروتوكول النهائي، Chromatin المناعية-الكمّي البوليميراز سلسلة التفاعل (ChIP-qPCR) هو تجربة ثقافة الخلية التي تحقق التفاعلات الحمض النووي البروتين في مناطق محددة من الجينوم. في بروتوكول ChIP، يتم ربط الكروماتين للحفاظ على تفاعلات الحمض النووي والبروتين. ثم يتم استخراج الكروماتين من الخلايا ويخضع مركب البروتينات الحمض النووي للمناعة الانتقائية للبروتين الذي يهم (على سبيل المثال، باستخدام جسم مضاد محدد لH3K27ac). ثم يتم تنقية الحمض النووي وتحليله باستخدام qPCR. على سبيل المثال، يمكن استخدام ChIP-qPCR لتحديد ما إذا كانت رواية HATi downregulates acetylation هينيستون في oncogenes الفردية، مثل Cyclin D125. في حين ChIP-qPCR هو أسلوب شائع يستخدم في هذا المجال، يمكن أن يكون من الصعب تحسين4،10،26. يوفر هذا البروتوكول تلميحات لتجنب المخاطر المحتملة التي يمكن أن تحدث أثناء تنفيذ إجراء ChIP-qPCR ويتضمن تدقيقات مراقبة الجودة التي يجب تنفيذها على البيانات.

عند استخدامها معا، وهذه البروتوكولات الثلاثة تسمح لتوصيف صارم والتحقق من صحة رواية HATi. بالإضافة إلى ذلك، هذه الأساليب توفر العديد من المزايا لأنها سهلة الأداء، رخيصة نسبيا وتوفير البيانات عن الأسيتيل هيستون العالمية وكذلك الإقليمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. في المختبر قبعة المقايسة

  1. إعداد المخزن المؤقت
    ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على وصفات المخزن المؤقت.
    1. إعداد 5x مخزن مؤقت للمحسان و 6x دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) وتخزينها عند -20 درجة مئوية. Aliquot SDS في 1 مل aliquots.
    2. إعداد 10x هلام SDS تشغيل العازلة و 10x TBST وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    3. إعداد 1x نقل العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      تنبيه: تحقق من ورقة بيانات السلامة لجميع المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول. SDS، DTT، وbroophenol الأزرق هي سامة وينبغي عدم تناولها، استنشاق، أو يتعرض للجلد أو العينين. الرجاء مراجعة ورقة بيانات السلامة لإجراءات المعالجة الصحيحة. يرجى استخدام غطاء الدخان الكيميائية للتعامل مع المواد الكيميائية الخطرة.
  2. رد فعل HAT
    ملاحظة: حمض Anacardic هو المانع P300 المعروفة3 ويستخدم كمثال لتوضيح كيف يمكن للمقايسة قبعة تحديد مثبطات p300 رواية. راجع البروتوكول التكميلي (التخطيطي 1) للاطلاع على مخطط للخطوة 1.2.1.
    1. إعداد رد فعل الأنزيمية التالية في أنبوب PCR 0.2 مل: 2 ميكرولتر من 5x العازلة المقايسة، 1 ميكرولتر من p300 المنقاة (0.19 ميكروغرام /ميكرولتر)، 1 ميكرولتر من حمض الأنكارد (HATi) أو مراقبة DMSO المخففة في 1x مخزن للمقايسة و2 ميكرولتر من ddH2O. قبل احتضان هذا الخليط لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم إضافة 3 ميكرولتر من 100 ميكرومتر أسيتيل-COA و 1 ميكرولتر من H3.1 النقي (0.2 ميكروغرام/ميكرولتر) إلى التفاعل.
    2. احتضان خليط التفاعل الكامل في 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في دورة حرارية PCR.
    3. إضافة 2-mercaptoethanol بنسبة 1:10 إلى المخزن المؤقت عينة 6x SDS.
    4. إزالة عينات من دورة حرارية PCR وإضافة 2 ميكرولتر من 6X SDS (مع 2-mercaptoethanol المضافة) إلى مزيج التفاعل.
      تنبيه: 2-mercaptoethanol هو سام وينبغي أن تستخدم داخل غطاء الدخان الكيميائية. الرجاء مراجعة ورقة بيانات السلامة للتعامل مع ذلك بشكل صحيح.
    5. عينات الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على كتلة الحرارة وتبرد على الجليد. تخزين العينات في -20 أو -80 درجة مئوية أو تنفيذ جل electrophoresis و المناعة على النحو المفصل أدناه.
  3. جل الكهرباء والمناعة
    ملاحظة: إذا لم تكن مألوفة مع جل electrophoresis و المناعة، راجع هذا الإجراء القياسي27 للحصول على تفاصيل إضافية حول كيفية تنفيذ الخطوات 1.3.1-1.3.17. ويمكن الاطلاع على معلومات إضافية هنا28,29,30,31,32,33.
    1. Pipette 10 ميكرولتر من العينات (من الخطوة 1.2.5.) إلى آبار هلام بولياكريلاميد متدرج بنسبة 4-20٪ . Pipette 5 ميكرولتر من سلم البروتين في واحدة من الآبار كمرجع الوزن الجزيئي. تشغيل هلام في 120 V لمدة 90 دقيقة باستخدام خزان هلام.
    2. نقل هلام إلى ثنائي فلوريد بولي فينيلايدين (PVDF) غشاء في 100 V لمدة 70 دقيقة باستخدام خزان نقل.
    3. إزالة الغشاء من جهاز نقل وضعه في حاوية بلاستيكية. سد الغشاء بإضافة 1X TBST (التي تحتوي على 5٪ الحليب) للحاوية ويهز بلطف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة 1x TBST من الخطوة 1.3.3. احتضان الغشاء بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة أسيتيل محددة الموقع (على سبيل المثال، H3K18ac أو H3K27ac الأجسام المضادة الأولية في تخفيف 1:5،000 في 1X تبت يحتوي على 5٪ الحليب) في 4 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.
    5. إزالة الحل الأجسام المضادة الأساسية. اغسل الغشاء 2x مع 1x TBST (بدون حليب) في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمدة 15 دقيقة لكل غسل.
    6. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في 1:20,000 في 1X TBST (تحتوي على 5% حليب) واحتضان الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
    7. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية. اغسل الغشاء 2x مع 1x TBST (بدون حليب) في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمدة 15 دقيقة لكل غسل.
    8. استنزاف 1X تبست من الغشاء. مزيج هكسيد البيرستر هكسيد الهروة هكسيد حل و هكسيد هروة إذاعة هروة في نسبة 1:1 (1 مل من كل) وماص 2 مل من الحل المشترك لسطح الغشاء.
    9. احتضان الحل مع الغشاء لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    10. استنزاف الركازة chemiluminescent الزائدة من الغشاء على منشفة ورقية ووضع الغشاء في غلاف بلاستيكي داخل حامل كاسيت الأشعة السينية.
    11. الانتقال إلى غرفة مظلمة مخصصة لمعالجة فيلم الأشعة السينية. يعرض الغشاء لغشاء الأشعة السينية عن طريق وضع الفيلم على أعلى الغشاء وإغلاق كاسيت لمدة 30 s.
      ملاحظة: يجب تحديد وقت الاتصال بين الفيلم والغشاء تجريبيًا. وسوف تحتاج الإشارات القوية إلى التعرض لمدى قصير (ثواني) وقد تحتاج الإشارات الأضعف إلى التعرض لفترة أطول.
    12. قم بإزالة فيلم الأشعة السينية من الكاسيت وعالج الفيلم عن طريق تشغيله من خلال معالج أفلام الأشعة السينية. راجع أدلة الشركة المصنعة للحصول على إرشادات محددة حول كيفية معالجة فيلم الأشعة السينية.
    13. إزالة الغشاء من البلاستيك التفاف وغسلها مع ddH2O لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
    14. احتضان الغشاء مع 0.2 M NaOH لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
    15. اغسل الغشاء بالديش2O لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
    16. سد الغشاء بإضافة 1X TBST (التي تحتوي على 5٪ الحليب) للحاوية ويهز بلطف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    17. أضف تخفيف الأجسام المضادة الأساسية التالية (على سبيل المثال، مسبار H3K27ac إذا كان أول جسم مضاد يستخدم H3K18ac) واهتزاز بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. كرر الخطوات 1.3.4-1.3.17 حتى يتم إكمال كافة تحقيقات الأجسام المضادة.

2. Chhai المقايسة

  1. في المختبر العلاج بالعقاقير وتحليل histones الأسيتلات
    ملاحظة: A-485 هو P300 HATi قوية وتتميز بشكل جيد2,4 . سيتم استخدام هذا المانع في الأقوال المتبقية بسبب فعاليتها وخصوصيتها في زراعة الخلية. MS-275 (إنتينوستات)24 هو HDACi أن يزيد بشكل ملحوظ مستويات أسيتيل هيستون ويستخدم لتسهيل اكتشاف أسهل من مسابير أسيتيل مع المناعة القياسية. انظر البروتوكول التكميلي (التخطيطي 2) لـ تخطيطي لتخفيفات المخدرات المستخدمة في الخطوة 2.1.
    1. بذور 100،000 خلايا MCF-7 في لوحة 12 جيدا والسماح للخلايا لتنمو إلى 80-90٪ التقاء في 1 مل من خلية ثقافة المتوسطة. وضع علامة على الآبار للتصميم التجريبي التالي: بئر 1: مراقبة DMSO (نقطة مرجعية)؛ جيدا 2: A-485 (3 μM)؛ بئر 3: A-485 (10 μM); جيدا 4: MS-275 (3 μM)؛ حسنا 5: MS-275 (3 μM) + A-485 (3 μm); جيدا 6: MS-275 (3 μM) + A-485 (10 μM).
      ملاحظة: بالنسبة لاستزراع خلايا MCF-7، استخدم وسائط DMEM كاملة وتسمح للخلايا بالنمو عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة DMEM كاملة.
    2. في 24 ساعة بعد البذر، ماص 4 مل من وسائل الاعلام DMEM كاملة إلى أنبوب مخروطي مخروطي 15 مل معقم. مايليت 2 ميكرولتر من MS-275 (6 مل في DMSO) إلى 4 مل من المتوسط لتركيز نهائي من 3 ميكرومتر MS-275.
    3. ماصة 2 μL من DMSO إلى 4 مل من المتوسط في منفصلة معقم 15 مل أنبوب مخروطي.
      تنبيه: يرجى التحقق من ورقة بيانات السلامة للتعامل السليم مع نظام إدارة الوجهات السياحية. لا يتم تصنيف بعض أنواع القفازات للتعامل مع DMSO.
    4. استلهم متوسط ثقافة الخلية من الآبار 4-6 والماصات 1 مل من 3 ميكرومتر MS-275 في المتوسط (الخطوة 2.1.2) إلى كل بئر. تجاهل غير المستخدمة المخفف MS-275.
    5. استلهم متوسط ثقافة الخلية من الآبار 1-3 والماصات 1 مل من DMSO المخفف (الخطوة 2.1.3) إلى كل بئر. تجاهل DMSO المخفف غير المستخدم.
    6. إعادة الخلايا إلى الحاضنة واحتضان لمدة 4 ح للسماح تراكم الهستونات الأسيتلات في الخلايا المعرضة لMS-275 (الآبار 4-6).
      ملاحظة: MS-275 هو HDACi وسوف يسبب hyperacetylation هيستون24. هذا 4 ح قبل الحضانة ضروري للسماح MS-275 للحث على فرط acetylation قبل إضافة A-485، مما يقلل من أسيتيل هيستون2،,4.
    7. بعد 4 ح من الحضانة مع MS-275، وإعداد التخفيفات التالية في أنابيب معقمة منفصلة 1.5 مل عن طريق الأنابيب: 1.0 μL من DMSO إلى 1 مل من وسائل الإعلام DMEM؛ 0.5 ميكرولتر من DMSO و0.5 ميكرولتر A-485 (6 مل) إلى 1 مل من وسائل الاعلام DMEM؛ 0.5 ميكرولتر من DMSO و0.5 ميكرولتر من A-485 (20 mM) إلى 1 مل من وسائل الإعلام DMEM؛ 0.5 ميكرولتر من DMSO و0.5 ميكرولتر من MS-275 (6 مل) إلى 1 مل من وسائل الإعلام DMEM؛ 0.5 ميكرولتر من A-485 (6 مل) و0.5 ميكرولتر من MS-275 (6 مللي م) إلى 1 مل من وسائل الإعلام DMEM؛ 0.5 ميكرولتر من A-485 (20 mM) و 0.5 ميكرولتر من MS-275 (6 mM) إلى 1 مل من وسائل الإعلام DMEM.
    8. التعرق ثقافة الخلية المتوسطة من الآبار 1-6 والماصة 1 مل من التخفيف 1 إلى بئر 1، وتمييع 2 إلى بئر 2، وتمييع 3 إلى بئر 3، وتمييع 4 إلى بئر 4، وتمييع 5 إلى بئر 5، وتمييع 6 إلى بئر 6.
      ملاحظة: القاعدة العامة هي موازنة محتوى DMSO (المذيب) بين المجموعات التجريبية وعدم تجاوز محتوى DMSO بنسبة 0.1٪ في ثقافة الخلايا لتجنب السمية الخلوية والتغيرات في الانتشار.
    9. إعادة الخلايا إلى الحاضنة والثقافة لمدة 20 ساعة.
    10. بعد 20 ح، التعرق متوسطة ثقافة الخلية من الآبار 1-6.
    11. غسل الخلايا عن طريق pipetting 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى الآبار 1-6. الطامح برنامج تلفزيوني.
    12. إضافة 100 ميكرولتر من 1x العازلة السلبية التحلل (انظر الجدول 1)إلى الآبار 1-6. تخزين لوحة ثقافة الخلية (مع عينات في العازلة التحلل السلبي) في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتجميد ذوبان وتحلل الخلايا.
      تنبيه: يرجى التحقق من ورقة بيانات السلامة لجميع المواد الكيميائية قبل إجراء المخازن المؤقتة. يمكن أن يسبب CDTA تلف العين خطيرة وتهيج.
    13. تذوب العينات في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمدة 10 دقيقة. نقل العينات إلى أنابيب 1.5 مل منفصلة ووضعها على الفور على الجليد.
    14. قياس تركيز البروتين لكل عينة. ويمكن تحديد تركيز البروتين باستخدام عدة بروتوكولات راسخة34.
    15. تركيز البروتين اكويريبرات بين العينات 1-6 (في وحدة تخزين متساوية) باستخدام 1x العازلة الانحلال السلبي لتخفيف، حسب الضرورة.
    16. إضافة 2-mercaptoethanol بنسبة 1:10 إلى 6x المخزن المؤقت SDS.
    17. إضافة 6x المخزن المؤقت عينة SDS مع 2-mercaptoethanol إلى العينات 1-6 إلى تركيز نهائي من 1x SDS عينة المخزن المؤقت.
    18. عينات الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على كتلة الحرارة وتبرد على الجليد. يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى الخطوة 2.1.19.
    19. Pipette حجم يحتوي على 30 ميكروغرام من البروتين للعينات 1-6 إلى الآبار في هلام بولياكريلاميد متدرج 4-20٪. إجراء عملية مناعة وفقا للبروتوكول الموصوف في البروتوكول 1.

3. ChIP-qPCR

ملاحظة: البروتوكول أدناه هو وصف لمثبطات p300 كمثال.

  1. إعداد المخزن المؤقت
    ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على وصفات المخزن المؤقت. الخطوات العامة لبروتوكول ChIP (مثل وصفات العازلة وأوقات الغسيل وأوقات الطرد المركزي) أدناه يتم تعديلها وتكييفها من توصيات الشركة المصنعة لمجموعة متاحة تجاريا (انظر جدول المواد)ومن الأدب35،36.
    1. تحضير العازلة تخفيف ChIP، نوات تورم العازلة، انخفاض الملح غسل العازلة، وارتفاع العازلة غسل الملح، LiCl العازلة غسل وTE العازلة. يُخزن عند 4 درجة مئوية.
    2. إعداد المخزن المؤقت SDS تحلل، 10x العازلة الجليسين و المخزن المؤقت Elution ChIP. يُخزن في درجة حرارة الغرفة.
      تنبيه: يرجى التحقق من ورقة بيانات السلامة لجميع المواد الكيميائية قبل إجراء المخازن المؤقتة لضمان المناولة السليمة.
  2. العلاج من المخدرات
    ملاحظة: راجع البروتوكول التكميلي (التخطيطي 3) للحصول على تخطيطي لتخفيفات المخدرات المستخدمة في الخطوة 3.2.
    1. بذور MCF-7 الخلايا في اثنين من أطباق ثقافة 15 سم وتنمو الخلايا إلى 90٪ التقاء في 12 مل من المتوسط DMEM كاملة. وضع علامة على الأطباق للتصميم التجريبي التالي: الطبق 1: تحكم DMSO (نقطة مرجعية)؛ الطبق 2: A-485 (3 ميكرومتر).
      ملاحظة: لاستزراع MCF-7 الخلايا، واستخدام وسائل الاعلام DMEM كاملة وتنمو في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة DMEM كاملة.
    2. في أنبوب مخروطي معقم 15 مل، ماصة 12 مل من وسائل الاعلام DMEM والماصات 6 ميكرولتر من DMSO. مزيج جيد.
    3. في أنبوب مخروطي معقم منفصل 15 مل، ماصة 12 مل من وسائل الاعلام DMEM والماصات 6 ميكرولتر من A-485 (6 مل في DMSO) للحصول على تركيز النهائي من 3 μM A-485. مزيج جيد.
    4. الطامح وسائل الإعلام من الطبق 1 و 2.
    5. أضف 12 مل من DMSO المخفف في DMEM (الخطوة 3.2.2.) إلى الطبق 1.
    6. أضف 12 مل من 3 ميكرومتر A-485 في DMEM (الخطوة 3.2.3.) إلى الطبق 2.
    7. إعادة أطباق ثقافة الخلية إلى الحاضنة واحتضان لمدة 24 ساعة.
  3. تثبيت الخلية
    1. ماصة 330 μL (27.5 μL لكل مل) من 37٪ الفورمالديهايد إلى وسائل الإعلام كاملة ودوامة بلطف لوحة لخلط.
      تنبيه: الفورمالديهايد سام. الرجاء مراجعة ورقة بيانات السلامة لإجراءات المعالجة الصحيحة.
    2. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. ماصة 2 مل من 10x جليكين إلى لوحة ودوامة لخلط.
    4. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    5. بعد الحضانة، ضع الأطباق على الجليد وذوبان aliquot من كوكتيل مثبطات البروتياز.
    6. إعداد الحلول التالية لكل من DMSO و A-485 عينات باستخدام المخازن المؤقتة إعداد في الخطوة 3.1.
      1. 2 مل من برنامج تلفزيوني مع تخفيف 1:1000 من كوكتيل مثبطات البروتياز
      2. 1 مل من تورم النوى العازلة مع 1:1000 تخفيف من كوكتيل مثبطات البروتياز
      3. 0.5 مل من المخزن المؤقت SDS مع تخفيف 1:1000 من كوكتيل مثبطات البروتياز
    7. التعرق وسائل الإعلام من الأطباق ثقافة الخلية وغسل الخلايا مرتين مع 15 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
    8. مايette 2 مل من برنامج تلفزيوني مع كوكتيل مثبطات البروتياز (الخطوة 3.3.6.1) لأطباق ثقافة الخلية. ارفع الخلايا إلى حل باستخدام مشطة الخلايا.
    9. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب microcentrifuge. جمع الخلايا المتبقية مع برنامج تلفزيوني إضافي إذا لزم الأمر.
    10. تدور أنابيب في 800 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إلى بيليه الخلايا.
    11. استلهمي المنتفخ والماصة 1 مل من النويات تورم العازلة مع كوكتيل مثبطات البروتياز (الخطوة 3.3.6.2) إلى بيليه. Resuspend بيليه واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    12. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 2700 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إلى بيليه نويتي.
    13. التعرق والماصات 0.5 مل من SDS تحلل العازلة مع كوكتيل مثبطات البروتياز (الخطوة 3.3.6.3) إلى بيليه. Resuspend بيليه واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
    14. تخزين عينات الكروماتين في -80 درجة مئوية حتى الخطوة 3.4.1 أو المضي قدما على الفور إلى الخطوة 3.4.
  4. سونيكيشن الحمض النووي
    1. نقل 130 ميكرولتر من الكروماتين من عينة DMSO (الخطوة 3.3.14) إلى أنبوبين سونيكيشن الحمض النووي باستخدام ماصة (130 ميكرولتر لكل منهما).
    2. نقل 130 ميكرولتر من الكروماتين من A-485 عينة (الخطوة 3.3.14) إلى اثنين من أنابيب سونيكيشن الحمض النووي باستخدام ماصة (130 ميكرولتر لكل منهما).
    3. سونيكات الحمض النووي إلى ما يقرب من 150-200 شظايا زوج قاعدة باستخدام إعدادات sonicator التالية: ذروة الحادث السلطة (W) من 175، عامل واجب من 10٪، 200 دورات لكل انفجار و 430 وقت العلاج.
      ملاحظة: قد تختلف إعدادات Sonication بين النماذج وقد تحتاج الإعدادات إلى ضبطها لتحقيق حجم جزء مناسب لخطوط الخلايا المختلفة.
    4. الاحتفاظ بالعينات على الجليد بعد سونيكيشن.
    5. نقل الكروماتين سونيكاتيد إلى أنبوب 1.5 مل باستخدام ماصة والطرد المركزي في 10000 س ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة إلى بيليه الحطام.
    6. الماصات المابسة (يحتوي على الكروماتين سونيكاتيد) إلى أنبوب جديد والتخلص من الحطام. يمكن تخزين الكروماتين سونيكاتيد في -80 درجة مئوية.
  5. Chromatin المناعي (ChIP)
    ملاحظة: راجع البروتوكول التكميلي (3 التخطيطي) للحصول على مخطط مجموعات IP في الخطوة 3.5.
    1. قياس محتوى البروتين من الكروماتين سونيكاتيد لعينات DMSO و A-485 من الخطوة 3.4.6. يمكن قياس محتوى البروتين باستخدام البروتوكولات الراسخة34.
      ملاحظة: للبساطة، وهذا البروتوكول يفترض محتوى البروتين على قدم المساواة وسيتم استخدام 100 ميكرولتر من الكروماتين سونيكاتيد. خلاف ذلك، محتوى البروتين سوف تحتاج إلى أن تكون توازن بين جميع العينات في حجم متساو.
    2. ماصة 100 μL من دمسو سونيكاتيد كروماتين إلى اثنين 1.5 مل أنابيب (100 ميكرولتر لكل منهما). Pipette 400 ميكرولتر من مانع تخفيف ChIP (التي تحتوي على تخفيف 1:1000 من كوكتيل مثبطات البروتياز) إلى كل أنبوب لجلب الحجم الإجمالي يصل إلى 500 ميكرولتر. إزالة 5 ميكرولتر من الحل من أحد الأنابيب وتخزينها في -20 درجة مئوية كإدخال DMSO.
    3. ماصة 100 ميكرولتر من كروماتين سونيكيد A-485 إلى اثنين من أنابيب 1.5 مل (100 ميكرولتر لكل منهما). Pipette 400 ميكرولتر من مانع تخفيف ال ChIP (التي تحتوي على تخفيف 1:1000 من كوكتيل مثبطات البروتياز) إلى كل أنبوب لجلب الحجم الإجمالي يصل إلى 500 ميكرولتر.
    4. باستخدام ماصة، إضافة الأجسام المضادة المناعية (IP) (مثل التحكم غير محددة IgG أو الأجسام المضادة H3K27ac محددة) إلى الأنابيب المقابلة لعينات DMSO و A-485: IP #1 chromatin DMSO مع الأجسام المضادة IgG (5-10 ميكروغرام)؛ IP #2 كروماتين DMSO مع الأجسام المضادة H3K27ac (5-10 ميكروغرام); IP #3 كروماتين A-485 مع الأجسام المضادة IgG (5-10 ميكروغرام); IP #4 كروماتين A-485 مع الأجسام المضادة H3K27ac (5-10 ميكروغرام).
    5. إضافة 20 ميكرولتر من البروتين الخرز المغناطيسي لكل أنبوب. تأكد من أن الخرز يتم إعادة اعتمادها بشكل جيد.
    6. تدوير العينات بين عشية وضحاها في 4 °C.
    7. بيليه البروتين الخرز المغناطيسي باستخدام فاصل المغناطيسي وإزالة supernatant. لا تزعج الخرز.
    8. غسل الخرز مع 500 μL إلى 1 مل من العازلة غسل الملح المنخفض وتدوير لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. أداء تدور سريعة أسفل، بيليه الخرز باستخدام فاصل المغناطيسي، وإزالة supernatant.
    9. غسل الخرز مع 500 μL إلى 1 مل من العازلة غسل الملح عالية وتدوير لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. أداء تدور سريعة أسفل، بيليه الخرز باستخدام فاصل المغناطيسي، وإزالة supernatant.
    10. غسل الخرز مع 500 μL إلى 1 مل من مخزن غسيل LiCl وتدوير لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. أداء تدور سريعة أسفل، بيليه الخرز باستخدام فاصل المغناطيسي، وإزالة supernatant.
    11. اغسل الخرز بـ 500 ميكرولتر إلى 1 مل من عازل TE وتناوب لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تنفيذ سريع تدور لأسفل. الاحتفاظ بالخرزات في المخزن المؤقت TE حتى الخطوة 3.5.14.
    12. إزالة عينات الإدخال (من الخطوة 3.5.2 و 3.5.3) من الفريزر والحفاظ على الجليد.
    13. ذوبان aliquot من البروتينات K.
    14. بيليه الخرز باستخدام فاصل المغناطيسي وإزالة العازلة TE من الخرز (من الخطوة 3.5.11).
    15. إضافة 100 μL μL غلوتيون العازلة + 1 ميكرولتر من البروتينات K إلى كل عينة، بما في ذلك عينات المدخلات. عينات احتضان مع اهتزاز في 62 درجة مئوية لمدة 2 ساعة باستخدام ثيرموسيكلير.
    16. بعد 2 ساعة، عينات الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق باستخدام ثيرموسيكلير.
    17. تبريد العينات إلى درجة حرارة الغرفة.
    18. بيليه الخرز المغناطيسي باستخدام فاصل المغناطيسي ونقل فائقة (يحتوي على الحمض النووي من الفائدة) إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
    19. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف PCR القياسية.
    20. يمكن تخزين الحمض النووي المنقى في -20 درجة مئوية ويمكن استخدامها كقوالب في بروتوكولات qPCR القياسية. اتبع بروتوكولات الشركة المصنعة لتشغيل qPCR.
  6. تحليل بيانات ChIP-qPCR
    ملاحظة: طريقتان شائعتان لتحليل نتائج ChIP-qPCR هي إثراء طي فوق الأجسام المضادة IgG وطريقة إدخال 1%. يتم توفير قالب ممتاز لكلا الأساليب التحليل من قبل مصدر تجاري يمكن استخدامها لحساب التخصيب أضعاف بسرعة لكل الأجسام المضادة IP / الهدف من الفائدة37.
    1. لحساب الإثراء أضعاف و% الإدخال، نسخ ولصق القيم ΔCt من البيانات qPCR التي تم الحصول عليها عن كل الأجسام المضادة (غير محددة IgG، وIP H3K27ac الأجسام المضادة، و 1٪ الإدخال) في المنطقة المقابلة في قالب التحليل و الإثراء أضعاف و% سوف الإدخال ملء تلقائياً.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في المختبر acetyltransferase (HAT) يمكن استخدام مقايسة للتحقيق في المركبات التي تمنع p300 هات النشاط نحو الركيزة حجر. الشكل 1A يوفر تخطيطيا تجريبيا لمقتايس HAT. تم استخدام حمض Anacardic ، وهو معروف HATi3،38، في هذا الفحص في نطاق تركيز من 12.5-100 μM. في 100 μM، حمض الأنكارديك downregulates p300 حفزت acetylation هيستون في هيستون 3، ليسين 9 و 18 مقابل العلاج DMSO التحكم(الشكل 1B،حارة 5 مقابل حارة 1). وقد ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ليسين أستيلtransferases (KATs) أسيتيلات عدة بقايا ليسين على ذيول هيستون وعوامل النسخ لتنظيم النسخ الجيني2,3. وقد كشف العمل في العقدين الماضيين أن KATs ، مثل CBP / p300 ، PCAF و GCN5 ، تتفاعل مع عوامل النسخ oncogenic وتساعد على دفع نمو الورم في العديد من أنواع الأورام الصلبة4،5،9،15،16،17

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يوجد لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح أو إفصاحات.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من جيمس واستير كينغ برنامج البحوث الطبية الحيوية (6JK03 و 20K07)، وبرنامج أبحاث السرطان Bankhead-Coley (4BF02 و 6BC03)، ووزارة الصحة في فلوريدا، ومؤسسة فلوريدا لسرطان الثدي، ومركز السرطان الصحي UF. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر الدكتور زاكاري أوكينغ والدكتور أندريا لين على دعمهما خلال عملية النشر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب 1.5 ملفيشر ساينتفيك05-408-129لجميع الطرق
طبق 10 سمSarstedt AG & Co.83.3902لزراعة الخلايا لخلايا MCF-7
10 نصائح ulفيشر Scientific02-707-454لجميع الطرق
1000 ul نصيحةCorning4846لجميع الطرق
10X Glycine bufferللطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
10X تشغيل المخزن المؤقتللطريقتين 1 و 2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
10X TBSTللطريقتين 1 و 2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
12 بئر لوحةCorning3513للطريقة 2
طبق 15 سمSarstedt AG & Co.83.3903للطريقة 3
15 مل أنبوب مخروطيسانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc-200249للطريقتين 2 و 3
1X TBST مع 5٪ حليب و 0.02٪ أزيدللطريقتين 1 و 2. يمكن استخدامها لتخفيف الأجسام المضادة الأولية التي سيتم استخدامها أكثر من مرة. يسمح بالتخزين قصير المدى لتخفيفات الأجسام المضادة الأولية. لا تستخدم لديلوتون الأجسام المضادة الثانوية. تنبيه: أزيد الصوديوم سام.
1X TBST مع 5٪ حليبللطريقتين 1 و 2. تستخدم لمنع غشاء PVDF ولتوسيع الأجسام المضادة. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
200 نصيحة منال Corning4844لجميع الطرق
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148لإعداد المخزن المؤقت لعينة SDS
4-20٪ جل بولي أكريلاميدThermo Fisher: InvitrogenXP04205BOXللطريقتين 1 و 2
5X المخزن المؤقتللفحص للطريقة 1. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
5X مخزن التحللللطريقة 2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
6X كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)للطريقتين 1 و 2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP / p300 Inhbitor للاستخدام في الطريقتين 2 و 3. تم حلها في DMSO.
Acetyl-CBP (K1535) / p300 (K1499) تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادة4771للطريقة 1
Acetyl-CoASigma-AldrichA2056للاستخدام في الطريقة 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) الجسم المضاد (H3K27ac) تقنيةإشارات الخليةCST 8173الأجسام المضادة ل H3K27ac للبقع المناعية و ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) الأجسام المضادة (H3K18ac)إشارات الخليةCST 9675الأجسام المضادة ل H3K18ac للبقع المناعية
والأجسام المضادة ألفا توبولينChIP Millipore SigmaT5168للطريقة 2. تمييع 1: 20،000
حمض الأناكارديككايمان الكيميائية13144للطريقة 1
المضادة للفأر IgG HRP المرتبط بتقنية إشارات الخلايا المضادة للجسم المضادالثانوي 7076للطريقتين 1 و 2. تمييع 1: 10,000
الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرانبJackson ImmunoResearch711-035-152للطريقتين 1 و 2. تمييع 1: 10،000 إلى 1: 20،000
فيلم التصوير الشعاعي الذاتيMIDSCIBX810للطرق 1 و 2
الراقصة الشرقية الدوارةStovall Life Science Incorporatedغير متوفرةللطرق 1 و 2
مصل ربلة الساق البقرية (BCS)HyCloneSH30072.03وسائط زراعة الخلايا
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma-AldrichA2153لإعداد العازلة
بروموفينول بلوسيجما-ألدريتشB0126لإعداد المخزن المؤقت لعينة SDS
CDTASpectrum Chemical125572-95-4لمكشطة خلية التحضير العازلة
Millipore SigmaCLS3010للطريقة 3
مؤقتللطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
للتخلص من ChIPللطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
DMEM كامل لخلاياللطريقتين 2 و 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
كوفاريس 130 & ل microTUBECovaris520045أنبوب صوتنة للاستخدام مع Covaris S220 في الطريقة 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicatorCovarisS220DNA sonicator للاستخدام في الطريقة 3
ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتش41639لتخفيف المخدرات وعلاج التحكم في المركبات
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815للمخزن المؤقت لعينة SDS تحضير
DMEMCorning10-013-CVوسائط زراعة الخلايا
EDTAFisher ScientificBP120-1لإعداد المخزن المؤقت
مثال على خزان النقل وجهاز النقلBio-rad1704070 للطريقتين 1 و 2
EZ-Magna ChIP A / G طقم الترسيب المناعي للكروماتينMillipore Sigma17-10086للطريقة 3
FK228 ( Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7مثبط HDAC للاستخدام في الطريقة 2
محلول الفورمالديهايدSigma-AldrichF8775لتثبيت الخلايا
الجلسرينفيشر ScientificBP229-1لتحضير المخزن المؤقت
جلايسينSigma-AldrichG7126لإعداد العازلة
HEPESSigma-Aldrich54457ل تحضير العازلة
عازلةعالية للطريقة 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021لإعداد العازلة
Immobilon Chemiluminescent HRP SubstrateMillipore SigmaWBKLS0500للطرق 1 و 2
KClFisher ScientificBP366-500لإعداد العازلة
LiClSigma-AldrichL9650لإعداد المخزن
LiCl washbuffer للطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
مخزن مؤقتبالملح للطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
مغناطيسيPromegaZ5341للاستخدام في الطريقة 3
494437 الميثانولسيجما ألدريتشلتحضير العازلة
هلام صغيرInvitrogenA25977للطريقتين 1 و 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2مثبط HDAC للاستخدام في الطريقة 2. تم حلها في DMSO.
كلوريد الصوديومفيشر العلمي7647-14-5لإعداد المخزن المؤقت
هيدروكسيد الصوديومفيشر العلميS318-100لإعداد المخزن المؤقت في الطريقتين 1 و 2
مختبرات الأرانب العادية IgGBethylP120-101التحكم في الجسم المضاد للأرانب للاستخدام في الطريقة 3
عازلةللطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
طقم تنظيف PCRQiagen28104للاستخدام في الطريقة 3
Penicillin / Streptomycin 100XCorning30-002-CIوسائط زراعة الخلايا
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Corning21-040-CVللطرق 2 و 3
Sigma-Aldrich80635لتحضير الحليب
المجففنستله قرنفلل الطريقتان 1 و 2
Power Pac 200 لنقل اللطخة الغربيةBio-radللطريقتين 1 و 2
Power Pac 3000 لجل SDS الذي يعملBio-radللطريقتين 1 و 2
البروتين الملونThermo Fisher26616للطريقتين 1 و 2
كوكتيل مثبط البروتيازSigma-AldrichPI8340للاستخدام في الطريقة 3
حبات البروتين A الأرجوانيNew England BioLabsS1425Sللاستخدام في الطريقة 3
Proteinase KNew England BioLabsP8107Sللاستخدام في الطريقة 3
PTC-100 وحدة التحكم الحرارية القابلة للبرمجةMJ Research Inc.PTC-100للطريقة 1
PVDF Transfer MembraneMillipore SigmaIEVH00005للطريقتين 1 و 2
المؤتلف H3.1New England BioLabsM2503Sللاستخدام في الطريقة 1
المؤتلف p300ENZO Life SciencesBML-SE451-0100للاستخدام في الطريقة 1
SAHA (Vorinostat)كايمان كيميكال149647-78-9مثبط HDAC للاستخدام في الطريقة 2
لتحلل SDSللطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
أزيد الصوديومفيشر العلمي26628-22-8للطريقتين 1 و 2. تنبيه: أزيد الصوديوم سام. انظر SDS للتعامل السليم.
بيكربونات الصوديومفيشر ScientificS233-500لإعداد العازلة
ديوكسي كولات الصوديومسيجما-ألدريتشD6750لتحضير العازلة
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)سيجما ألدريتش71725لإعداد عازلة عينة SDS
قياسي HeatblockVWR المنتجات العلميةMPN: 949030للطريقتين 1 و 2
سطح الطاولة جهاز الطرد المركزيEppendorf5417Rلجميع الطرق
Bufferللطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
المخزن المؤقتللنقل للطريقتين 1 و 2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة.
Trichostatin ACayman Chemical58880-19-6مثبط HDAC للاستخدام في الطريقة 2
TrisFisher ScientificBP152-5لإعداد المخزن المؤقت
Triton X-100Sigma-AldrichT8787لإعداد المخزن المؤقت
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5لتحضير المخزن المؤقت في الطريقتين 1 و 2
معالجفيلم الأشعة السينيةكونيكا مينولتا الطبية & أمبير شركة Graphic، Inc.SRX-101Aللطريقتين 1 و 2
الصوديوم السلبي تقنية منصة مخزن لتخفيف ChIP المخزن المؤقت MCF-7 ثنائي غسيل الملح المؤقت منخفض للغسيل فاصل خزان تورم النوى أنابيب سلم المخزن المؤقت TE

المراجع

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539(2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47(2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527(2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), Melville, N.Y. 054702(2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , Cambridge, MA. (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , Wiley. (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020).
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland. , Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020).
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047(2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HAT ChHAI ChIP qPCR Proteinase K qPCR

مقالات ذات صلة