مثبطات acetyltransferases هيستون (HATs، المعروف أيضا باسم lysine أستيل ترانسفيراليس)، مثل CBP/p300، هي العلاجات المحتملة لعلاج السرطان. ومع ذلك، هناك حاجة إلى أساليب صارمة للتحقق من صحة هذه المثبطات. ثلاث طرق في المختبر للتحقق من الصحة وتشمل المقايسات HAT مع أسيتيل ترانسفيرات المؤتلف، المناعية لاستيل هيستون في ثقافة الخلية، وChip-qPCR.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مقايسات للتحقق من صحة مثبطات هيستون أسيتيل ترانسفيراز
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Lysine acetyltransferases (KATs) تحفيز أستيل من بقايا ليسين على histones والبروتينات الأخرى لتنظيم ديناميات الكروماتين والتعبير الجيني. تخضع الـ KATs، مثل CBP/p300، لتحقيق مكثف كأهداف علاجية بسبب دورها الحاسم في الأورام السرطانية المتنوعة. إن تطوير مثبطات جزيء صغير جديدة تستهدف وظيفة أسيتيلtransferase (HAT) من منتجات الطاقة المعدنية الكويتية (هات) يمثل تحدياً ويتطلب مقايسات قوية يمكنها التحقق من خصوصية وفاعلية المثبطات المحتملة.
توضح هذه المقالة خط أنابيب من ثلاث طرق توفر التحقق من صحة في المختبر الصارم لمثبطات HAT جديدة (HATi). وتشمل هذه الطرق اختبار اختبار أنبوب قبعة المقايسة, كروماتين فرط الacetylation تثبيط (ChHAI) اختبار, وChromatin المناعي-PCR الكمية (ChIP-qPCR). في مقايسة HAT، يتم احتضان HATs المؤتلف مع الهستونات في تفاعل أنبوب الاختبار، مما يسمح لالآستيل من بقايا ليسين محددة على ذيول الحجر. ويمكن منع هذا التفاعل بواسطة HATi ويمكن قياس المستويات النسبية من أسيتيل هينيستون محددة الموقع عن طريق المناعة. مثبطات محددة في قبعة المقايسة تحتاج إلى تأكيد في البيئة الخلوية.
يستخدم مقايسة ChHAI مناعيًا لفحص HATi رواية أن تخفيف فرط acetylation قوية من النغمات الناجمة عن مثبط deacetylase هيستون (HDACi). إضافة HDACi مفيد لأن مستويات القاعدية من أسيتيل هينيستون يمكن أن يكون من الصعب الكشف عن طريق المناعة.
ويقيس مقايستا هات وتشهاي التغيرات العالمية في أسيتيل الهيستون، ولكن لا تقدمان معلومات بشأن أسيتيل في مناطق جينية محددة. ولذلك، يتم استخدام ChIP-qPCR للتحقيق في آثار HATi على مستويات أستيل هيستون في العناصر التنظيمية الجينات. ويتم ذلك من خلال التحلل المناعي الانتقائي لمجمعات هيستون-دنا وتحليل الحمض النووي المنقى من خلال qPCR. معا، هذه المقايسات الثلاثة تسمح للتحقق الدقيق من خصوصية، قوة، وآلية العمل من رواية HATi.
المقدمة
ليسين أستيل ترانسفيراديس (KATs) تحفيز أستيل من بقايا ليسين على كل من البروتينات هيستون وغير هيستون1,2,3,4. كشفت الأبحاث الحديثة أن KATs ووظيفة الأسيتيل ترانسفيراز يمكن أن تعزز نمو الورم الصلب4،5،6،7،8،9. على سبيل المثال، بروتين الكريب الملزم (CBP)/p300 هما KATs البارالوجين التي تنظم العديد من مسارات الإشارات في السرطان2
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. في المختبر قبعة المقايسة
- إعداد المخزن المؤقت
ملاحظة: راجع الجدول 1 للحصول على وصفات المخزن المؤقت.- إعداد 5x مخزن مؤقت للمحسان و 6x دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) وتخزينها عند -20 درجة مئوية. Aliquot SDS في 1 مل aliquots.
- إعداد 10x هلام SDS تشغيل العازلة و 10x TBST وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 1x نقل العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
تنبيه: تحقق من ورقة بيانات السلامة لجميع المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول. SDS، DTT، وbroophenol الأزرق هي سامة وينبغي عدم تناولها، استنشاق، أو يتعرض للجلد أو العينين. الرجاء مراجعة ورقة بيانات السلامة لإجراءات المعالجة الصحيحة. يرجى اس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في المختبر acetyltransferase (HAT) يمكن استخدام مقايسة للتحقيق في المركبات التي تمنع p300 هات النشاط نحو الركيزة حجر. الشكل 1A يوفر تخطيطيا تجريبيا لمقتايس HAT. تم استخدام حمض Anacardic ، وهو معروف HATi3،38، في هذا الفحص في نطاق تركيز من 12.5-100 μM. في 100 μM، حمض الأنكارديك downregulates p300 حفزت acetylation هيستون في هيستون 3، ليسين 9 و 18 مقابل العلاج DMSO التحكم(الشكل 1B،حارة 5 مقابل حارة 1). وقد ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ليسين أستيلtransferases (KATs) أسيتيلات عدة بقايا ليسين على ذيول هيستون وعوامل النسخ لتنظيم النسخ الجيني2,3. وقد كشف العمل في العقدين الماضيين أن KATs ، مثل CBP / p300 ، PCAF و GCN5 ، تتفاعل مع عوامل النسخ oncogenic وتساعد على دفع نمو الورم في العديد من أنواع الأورام الصلبة4،5،9،15،16،17
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يوجد لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح أو إفصاحات.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من جيمس واستير كينغ برنامج البحوث الطبية الحيوية (6JK03 و 20K07)، وبرنامج أبحاث السرطان Bankhead-Coley (4BF02 و 6BC03)، ووزارة الصحة في فلوريدا، ومؤسسة فلوريدا لسرطان الثدي، ومركز السرطان الصحي UF. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر الدكتور زاكاري أوكينغ والدكتور أندريا لين على دعمهما خلال عملية النشر.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنبوب 1.5 مل | فيشر ساينتفيك | 05-408-129 | لجميع الطرق |
| طبق 10 سم | Sarstedt AG & Co. | 83.3902 | لزراعة الخلايا لخلايا MCF-7 |
| 10 نصائح ul | فيشر Scientific | 02-707-454 | لجميع الطرق |
| 1000 ul نصيحة | Corning | 4846 | لجميع الطرق |
| 10X Glycine buffer | للطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| 10X تشغيل المخزن المؤقت | للطريقتين 1 و 2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| 10X TBST | للطريقتين 1 و 2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| 12 بئر لوحة | Corning | 3513 | للطريقة 2 |
| طبق 15 سم | Sarstedt AG & Co. | 83.3903 | للطريقة 3 |
| 15 مل أنبوب مخروطي | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | sc-200249 | للطريقتين 2 و 3 |
| 1X TBST مع 5٪ حليب و 0.02٪ أزيد | للطريقتين 1 و 2. يمكن استخدامها لتخفيف الأجسام المضادة الأولية التي سيتم استخدامها أكثر من مرة. يسمح بالتخزين قصير المدى لتخفيفات الأجسام المضادة الأولية. لا تستخدم لديلوتون الأجسام المضادة الثانوية. تنبيه: أزيد الصوديوم سام. | ||
| 1X TBST مع 5٪ حليب | للطريقتين 1 و 2. تستخدم لمنع غشاء PVDF ولتوسيع الأجسام المضادة. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| 200 نصيحة من | ال Corning | 4844 | لجميع الطرق |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | لإعداد المخزن المؤقت لعينة SDS |
| 4-20٪ جل بولي أكريلاميد | Thermo Fisher: Invitrogen | XP04205BOX | للطريقتين 1 و 2 |
| 5X المخزن المؤقت | للفحص للطريقة 1. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| 5X مخزن التحلل | للطريقة 2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| 6X كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | للطريقتين 1 و 2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| A-485 | MedChemExpress | HY-107455 | CBP / p300 Inhbitor للاستخدام في الطريقتين 2 و 3. تم حلها في DMSO. |
| Acetyl-CBP (K1535) / p300 (K1499) تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادة | 4771 | للطريقة 1 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2056 | للاستخدام في الطريقة 1 |
| Acetyl-Histone H3 (Lys 27) الجسم المضاد (H3K27ac) تقنية | إشارات الخلية | CST 8173 | الأجسام المضادة ل H3K27ac للبقع المناعية و ChIP |
| Acetyl-Histone H3 (Lys18) الأجسام المضادة (H3K18ac) | إشارات الخلية | CST 9675 | الأجسام المضادة ل H3K18ac للبقع المناعية |
| والأجسام المضادة ألفا توبولين | ChIP Millipore Sigma | T5168 | للطريقة 2. تمييع 1: 20،000 |
| حمض الأناكارديك | كايمان الكيميائية | 13144 | للطريقة 1 |
| المضادة للفأر IgG HRP المرتبط بتقنية إشارات الخلايا المضادة للجسم المضاد | الثانوي 7076 | للطريقتين 1 و 2. تمييع 1: 10,000 | |
| الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرانب | Jackson ImmunoResearch | 711-035-152 | للطريقتين 1 و 2. تمييع 1: 10،000 إلى 1: 20،000 |
| فيلم التصوير الشعاعي الذاتي | MIDSCI | BX810 | للطرق 1 و 2 |
| الراقصة الشرقية الدوارة | Stovall Life Science Incorporated | غير متوفرة | للطرق 1 و 2 |
| مصل ربلة الساق البقرية (BCS) | HyClone | SH30072.03 | وسائط زراعة الخلايا |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | لإعداد العازلة |
| بروموفينول بلو | سيجما-ألدريتش | B0126 | لإعداد المخزن المؤقت لعينة SDS |
| CDTA | Spectrum Chemical | 125572-95-4 | لمكشطة خلية التحضير العازلة |
| Millipore Sigma | CLS3010 | للطريقة 3 | |
| مؤقت | للطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| للتخلص من ChIP | للطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| DMEM كامل لخلايا | للطريقتين 2 و 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| كوفاريس 130 & ل microTUBE | Covaris | 520045 | أنبوب صوتنة للاستخدام مع Covaris S220 في الطريقة 3 |
| Covaris S220 Focused-ultrasonicator | Covaris | S220 | DNA sonicator للاستخدام في الطريقة 3 |
| ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | سيجما ألدريتش | 41639 | لتخفيف المخدرات وعلاج التحكم في المركبات |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | للمخزن المؤقت لعينة SDS تحضير |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | وسائط زراعة الخلايا |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | لإعداد المخزن المؤقت |
| مثال على خزان النقل وجهاز النقل | Bio-rad | 1704070 للطريقتين 1 و 2 | |
| EZ-Magna ChIP A / G طقم الترسيب المناعي للكروماتين | Millipore Sigma | 17-10086 | للطريقة 3 |
| FK228 ( Romidepsin) | Cayman Chemical | 128517-07-7 | مثبط HDAC للاستخدام في الطريقة 2 |
| محلول الفورمالديهايد | Sigma-Aldrich | F8775 | لتثبيت الخلايا |
| الجلسرين | فيشر Scientific | BP229-1 | لتحضير المخزن المؤقت |
| جلايسين | Sigma-Aldrich | G7126 | لإعداد العازلة |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54457 | ل تحضير العازلة |
| عازلة | عالية للطريقة 3 | ||
| IGEPAL (NP-40) | Sigma-Aldrich | I3021 | لإعداد العازلة |
| Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore Sigma | WBKLS0500 | للطرق 1 و 2 |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | لإعداد العازلة |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | لإعداد المخزن |
| LiCl wash | buffer للطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| مخزن مؤقت | بالملح للطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| مغناطيسي | Promega | Z5341 | للاستخدام في الطريقة 3 |
| 494437 الميثانول | سيجما ألدريتش | لتحضير العازلة | |
| هلام صغير | Invitrogen | A25977 | للطريقتين 1 و 2 |
| MS-275 (Entinostat) | Cayman Chemical | 209783-80-2 | مثبط HDAC للاستخدام في الطريقة 2. تم حلها في DMSO. |
| كلوريد الصوديوم | فيشر العلمي | 7647-14-5 | لإعداد المخزن المؤقت |
| هيدروكسيد الصوديوم | فيشر العلمي | S318-100 | لإعداد المخزن المؤقت في الطريقتين 1 و 2 |
| مختبرات الأرانب العادية IgG | Bethyl | P120-101 | التحكم في الجسم المضاد للأرانب للاستخدام في الطريقة 3 |
| عازلة | للطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| طقم تنظيف PCR | Qiagen | 28104 | للاستخدام في الطريقة 3 |
| Penicillin / Streptomycin 100X | Corning | 30-002-CI | وسائط زراعة الخلايا |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Corning | 21-040-CV | للطرق 2 و 3 |
| Sigma-Aldrich | 80635 | لتحضير الحليب | |
| المجفف | نستله قرنفل | ل الطريقتان 1 و 2 | |
| Power Pac 200 لنقل اللطخة الغربية | Bio-rad | للطريقتين 1 و 2 | |
| Power Pac 3000 لجل SDS الذي يعمل | Bio-rad | للطريقتين 1 و 2 | |
| البروتين الملون | Thermo Fisher | 26616 | للطريقتين 1 و 2 |
| كوكتيل مثبط البروتياز | Sigma-Aldrich | PI8340 | للاستخدام في الطريقة 3 |
| حبات البروتين A الأرجواني | New England BioLabs | S1425S | للاستخدام في الطريقة 3 |
| Proteinase K | New England BioLabs | P8107S | للاستخدام في الطريقة 3 |
| PTC-100 وحدة التحكم الحرارية القابلة للبرمجة | MJ Research Inc. | PTC-100 | للطريقة 1 |
| PVDF Transfer Membrane | Millipore Sigma | IEVH00005 | للطريقتين 1 و 2 |
| المؤتلف H3.1 | New England BioLabs | M2503S | للاستخدام في الطريقة 1 |
| المؤتلف p300 | ENZO Life Sciences | BML-SE451-0100 | للاستخدام في الطريقة 1 |
| SAHA (Vorinostat) | كايمان كيميكال | 149647-78-9 | مثبط HDAC للاستخدام في الطريقة 2 |
| لتحلل SDS | للطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| أزيد الصوديوم | فيشر العلمي | 26628-22-8 | للطريقتين 1 و 2. تنبيه: أزيد الصوديوم سام. انظر SDS للتعامل السليم. |
| بيكربونات الصوديوم | فيشر Scientific | S233-500 | لإعداد العازلة |
| ديوكسي كولات الصوديوم | سيجما-ألدريتش | D6750 | لتحضير العازلة |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | سيجما ألدريتش | 71725 | لإعداد عازلة عينة SDS |
| قياسي Heatblock | VWR المنتجات العلمية | MPN: 949030 | للطريقتين 1 و 2 |
| سطح الطاولة جهاز الطرد المركزي | Eppendorf | 5417R | لجميع الطرق |
| Buffer | للطريقة 3. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| المخزن المؤقت | للنقل للطريقتين 1 و 2. انظر الجدول 1 للحصول على وصفة. | ||
| Trichostatin A | Cayman Chemical | 58880-19-6 | مثبط HDAC للاستخدام في الطريقة 2 |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-5 | لإعداد المخزن المؤقت |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | لإعداد المخزن المؤقت |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | لتحضير المخزن المؤقت في الطريقتين 1 و 2 |
| معالج | فيلم الأشعة السينيةكونيكا مينولتا الطبية & أمبير شركة Graphic، Inc. | SRX-101A | للطريقتين 1 و 2 |
المراجع
- Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
- Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveal....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
