Method Article

التركيز المسبق المستند إلى الورق وعزلة الميكروفيسلات واكسوسوم

DOI:

10.3791/61292

⸱

April 29th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical Engineering, Kwangwoon University, 2Korea Institute of Science and Technology (KIST), 3School of Biomedical Engineering, Korea University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول لتصنيع جهاز ورقي لإثراء وعزل الميكروبات والكوسومات بشكل فعال.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

microvesicles وicssosomes هي الحويصلات membranous الصغيرة التي تم إصدارها إلى البيئة خارج الخلية وتعميمها في جميع أنحاء الجسم. ولأنها تحتوي على جزيئات بيولوجية مشتقة من خلايا أبوية مختلفة مثل الحمض النووي، والميرنا، والميرنا، والبروتينات، والدهون، فإن إغناءها وعزلها هما خطوتان حاسمتان لاستغلالهما كمعلمات بيولوجية محتملة للتطبيقات السريرية. ومع ذلك، فإن طرق العزل التقليدية (مثل الطرد الشديد) تسبب خسائر كبيرة وأضرار في الميكروسات الدقيقة. تتطلب هذه الطرق أيضًا خطوات متكررة متعددة للطرد الشديد التركيز والتحميل وإهدار الكواشف. توضح هذه المقالة طريقة مفصلة لاختلاق جهاز الورق اوريغامي القائم على (Exo-PAD) مصممة لإثراء فعالة وعزلة من microvesicles و exosomes بطريقة بسيطة. إن التصميم الفريد لـ Exo-PAD، الذي يتكون من طبقات متعددة الطبقات الشبيهة بالأكورديون مع مناطق عينة متقاربة، مدمج مع تقنية استقطاب تركيزات الأيونات، مما يتيح إثراء خمسة أضعاف من الطبقات الدقيقة والأكسوسوم على طبقات محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عزل microvesicles المخصب واكسوسوم ببساطة من خلال تتكشف إكسو-PAD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدقيقة والويسوس هي غشاء صغير الحويصلات قياس 0.2−1 ميكرومتر و 30-200 نانومتر، على التوالي. ويفرز في بيئة خارج الخلية من قبل عدة أنواع مختلفة من الخلايا1،2،3،4،5. أنها تحتوي على معلومات الخلية الأبوية في شكل مجموعات فرعية من الحمض النووي، مرنا، ميرنا، البروتينات، والدهون، وتدور في جميع أنحاء الجسم عن طريق سوائل الجسم المختلفة مثل المصل، والبلازما، والبول، والسوائل النخاعية، السائل الأمنيوسي، واللعاب6،,7،,8،,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع الأجهزة

  1. تحديد المنطقة التي سيتم طباعتها على الورق باستخدام برنامج الطابعة(جدول المواد).
    ملاحظة: يحتوي التصميم على 12 طبقة منقوشة بالشمع حيث تضيق أقطار مناطق العينة الدائرية تدريجياً من 5 ملم إلى 2 مم(الشكل 1A).
  2. طباعة الشمع الهيدروفوس على المناطق المعينة على جانبي ورقة السليلوز (جدول المواد) باستخدام طابعة شمعية تجارية (جدول المواد) (الشكل 1B).
  3. ضع الورق المطبوع بالشمع في فرن المختبر لمدة 80 درجة مئوية عند 120 درجة مئوية.
    ملاحظة: تسمح هذه الخطوة الشمع للوصول إلى داخل ورقة من خلال تحقيق إعادة تدفق الحرارية من الشمع ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن يكون الوقت عملية الأمثل لتحقيق أقصى عائد الانتعاش من microvesicles المخصب واكسوسوم. عدم كفاية الوقت لا يسمح هجرة كافية من microvesicles وicsssومات، مما يقلل من الإثراء، في حين أن الوقت المفرط يتدهور التركيز المكاني وبالتالي يثر microvesicles وicsss. وهكذا، من خلال خطوة التحسين الوقت، يمكن تحديد عامل التركيز المسبق الأقصى من microvesicles و exosomes والموقع النهائي حيث يتم تخصيب معظم microvesicles و exosomes. للعثور على الموقع النهائي للميكروسين، لوحظت الهجرة الفاصل الزمني من الفلورسنت المسمى microvesicles وicssoso.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن EXO-PAD استخدمت بنجاح لإثراء وعزل microvesicles وicsos، ينبغي النظر بعناية عدة نقاط حرجة: 1) وقت حضانة الفرن ودرجة الحرارة أثناء إعداد الجهاز، 2) وقت المعالجة، 3) تطبيق الجهد مع أرقام طبقة متفاوتة وأقطار منطقة العينة، و 4) إمكانية التطبيق على العينات السريرية.

وقت الحضانة ودرجة الحرارة المعطاة في البروتوكول هي الظروف الأمثل لتصنيع جهاز موثوق به. قد تتسبب أوقات الحضانة الأطول أو ارتفاع درجة الحرارة في تشويه التصميم المتقارب بسبب إعادة التدفق المفرط للشمع المطبوع. وهذا من شأنه أن.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا، منحة NRF-2018R1D1A1A090840444. تم دعم J. H. Lee بمنحة بحثية من جامعة كوانجون في عام 2019. 11- وقد تلقى هيرين كيم الدعم من "برنامج تطوير الكفاءة للمتخصصين في الصناعة" التابع لوزارة التجارة والصناعة والطاقة الكورية، الذي يديره المعهد الكوري للنهوض بالتكنولوجيا (KIAT) (رقم 1999). P0002397، HRD برنامج التقارب الصناعي للأجهزة الذكية القابلة للارتداء).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أقطاب Ag / AgCl أقطابAM Systems، Inc.5315000.15 "قطر
الألبومين من مصل الأبقار (BSA) ، Alexa Fluor 594 المترافقThermo Fisher ScientificA13101BSA مترافق مع Alexa Fluor 594 (Ex / Em: 590/617 nm)
كربونات بيكربونات عازلةSigma-AldrichC3041-50CAPكربونات عازلة
برنامج CorelDraw (شركة كورال ، كندا)Corel Corporationلتحديد طباعة الشمع المنطقة
ColorQube 8870Xerox Corporationطابعة الشمع
ورق الكروماتوغرافيا الصف 1Whatman3001-861ورق السليلوز ، الأبعاد: 20 * 20 سم
معايير الإكسوسوم ذات العلامات الفلوريةHansaBioMed Life Sciences، Ltd.HBM-F-PEP-100Exosome المسمى FITC (Ex / Em: 490/520 nm)
Keithley 2410 مقياس مصدر التيار / الجهدKeithley Instruments، Inc.التيار – نظام قياس مصدر الجهد
Nafion محلول الراتنج المشبع بالفلورSigma-Aldrich31175-20-9غشاء Permselective ، 20 wt.٪ في خليط الكحول الأليفاتي السفلي والماء ؛ يحتوي على 34٪ ماء
NanoSight LM10NanoSight Technologyتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، pH7.4)Thermo Fisher Scientific10010001
برنامج طابعة آلة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
  2. Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Paper Based DeviceMicrovesicle IsolationExosome EnrichmentIon Concentration PolarizationWax Patterned LayersPerm Selective MembraneElectrokinetic PreconcentrationFluorescence QuantificationSEM AnalysisProtein Rich Samples

Related Articles