يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير داخل النواة أكتين رودز في الحرارة الحية وشدد الأجنة Drosophila

3.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61297

⸱

مايو 15, 2020

 ,  , 
1Integrative Molecular and Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine, 2Department of Cell and Molecular Biology, School of Molecular and Cellular Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذا البروتوكول هو حقن رودامين مترافقة في شكل اجناة دوزوفيليا وصورة إيننويا actin قضبان الجمعية بعد الإجهاد الحراري.

الملخص

الغرض من هذا البروتوكول هو تصور قضبان actin داخل النواة التي تجمع في الأجنة الزهرية الميلانوغاستر الحية بعد الإجهاد الحراري. قضبان Actin هي السمة المميزة لاستجابة الإجهاد Actin المحفوظة وغير القابلة للانكولوجيا (ASR) التي ترافق الأمراض البشرية ، بما في ذلك الأمراض العصبية. في السابق، أظهرنا أن ASR يساهم في فشل التشكلات المُرفَضة وتقليل قدرة الأجنة النامية على البقاء. يسمح هذا البروتوكول بالدراسة المستمرة للآليات الكامنة في تجميع القضيب ACTIN و ASR في نظام نموذجي قابل للغاية للتصوير وعلم الوراثة والكيمياء الحيوية. يتم جمع الأجنة وتركيبها على غطاء لإعدادها للحقن. يتم تخفيف رودامين مترافقة غلوبال أكتين (G-actinالأحمر)وتحميلها في microneedle. يتم إجراء حقنة واحدة في مركز كل جنين. بعد الحقن ، يتم احتضان الأجنة في درجة حرارة مرتفعة ويتم تصور قضبان actin داخل النواة عن طريق المجهر confocal. ويمكن إجراء عملية استعادة الفلوريسنس بعد تجارب التحسس الضوئي (FRAP) على قضبان أكتين؛ ويمكن أيضا أن تكون صورت غيرها من الهياكل أكتين الغنية في السيتوبلازم. نجد أن G-actinRedizes مثل G-actin الذاتية ولا تتداخل، من تلقاء نفسها، مع تطور الجنين الطبيعي. أحد القيود المفروضة على هذا البروتوكول هو أنه يجب توخي الحذر أثناء الحقن لتجنب الإصابة الخطيرة بالجنين. ومع ذلك، مع الممارسة، حقن G-actinالأحمر في الأجنة Drosophila هو وسيلة سريعة وموثوق بها لتصور قضبان actin ويمكن بسهولة أن تستخدم مع الذباب من أي نوع جيني أو مع إدخال ضغوط الخلوية الأخرى، بما في ذلك نقص الأكسجة والأكسدة.

المقدمة

يصف هذا البروتوكول كيفية حقن G-actinRed لتصور تجميع قضبان actin داخل النواة في الأجنة التي تعاني من الإجهاد الحراري التي تخضع لاستجابة الإجهاد Actin غير القابلة للتحميل (ASR)1. وضعنا هذا البروتوكول لمساعدة الدراسات من ASR، والتي في الأجنة يؤدي إلى انقطاع morphogenesis وانخفاض الجدوى، وفي أنواع الخلايا البشرية الكبار يرتبط مع الأمراض بما في ذلك الفشل الكلوي2, اعتلالات العضلات3, ومرض الزهايمر وهنتنغتون4,5,6,7,8. هذا ASR هو الناجم عن العديد من الضغوط الخلوية، بما في ذلك الصدمة الحرارية9،10،11، الإجهاد التأكسي4،6، انخفاض ATP التوليف12، وغير طبيعي Huntingtin أو β-amyloid oligomerization4،5،6،7،9،13،14،16. السمة المميزة لـ ASR هي تجميع قضبان actin الشاذة في إما السيتوبلازم أو نواة الخلايا المصابة ، والتي تحركها فرط النشاط الناجم عن الإجهاد من بروتين التفاعل actin ، Cofilin1،5،6،10. ولسوء الحظ، لا تزال هناك فجوات معرفية رئيسية فيما يتعلق بـ ASR. على سبيل المثال، وظيفة قضبان actin غير معروف. نحن لا نفهم لماذا قضبان تشكل في السيتوبلازم لبعض أنواع الخلايا، ولكن نواة الآخرين. كما أنه ليس من الواضح ما إذا كان ASR وقائيًا أو غير مُبطِل للخلايا أو الأجنة التي تخضع للإجهاد. وأخيرا، ما زلنا لا نعرف الآليات التفصيلية الكامنة في Cofilin فرط التنشيط أو actin قضبان الجمعية. وهكذا، يوفر هذا البروتوكول فحص سريع ومتعدد الاستخدامات للتحقيق في ASR عن طريق تصور تشكيل قضيب actin وديناميكية في النظام التجريبي القابلة للتصرّف للغاية من جنين ذبابة الفاكهة الحية.

تم تطوير بروتوكول microinject G-actinRed في أجنة دروسوفيليا الحية في البداية لدراسة ديناميات هياكل cytoplasmic الطبيعية17 خلال أحداث بناء الأنسجة. في تلك الدراسات، وجدنا أنحقنة G-actin Red لم تؤثر سلبًا على عمليات النمو المبكرة في الجنين، بما في ذلك تحلل السيتوكينات أو17،18. ثم قمنا بتعديل البروتوكول ، وتكييف معالجة الجنين وحقن G-actinRed للسماح بتصوير قضبان actin في الأجنة المجهدة الحرارية التي تخضع لـ ASR1. يمكن استخدام طرق أخرى إلى جانب حقن G-actinRed لتصور actin في الأجنة. هذه الأساليب تعتمد على التعبير عن البروتينات الفلورية (FPs) الموسومة إلى actin أو إلى مجالات البروتينات الملزمة actin ، مثل Utrophin- mCherry ، Lifeact ، F-tractin -GFP ، وMoesin -GFP (استعرضت في19). ومع ذلك، فإن استخدام هذه المسابير FP يتطلب الحذر لأنها يمكن أن تستقر أو تعطل بعض الهياكل actin، لا تسمية على قدم المساواة جميع الهياكل actin20، وفي حالة actin-GFP، هي مفرطة جدا - إشكالية لتحليل الجمعية قضيب الذي لا يقتصر على الإجهاد تعتمد ولكن أيضا actin التركيز تعتمد1. وهكذا، G-actinالأحمر هو المسبار المفضل لدراسات قضيب في الأجنة تطير، وحجم كبير من الجنين يسمح حقنه سهلة.

سير عمل هذا البروتوكول مشابه لتقنيات الحقن المجهرية الأخرى الراسخة التي استخدمت لحقن البروتينات والأحماض النووية والعقاقير والمؤشرات الفلورية في الأجنة الدروسوفيا 21،22،23،24،25،26،27. ومع ذلك، بعد الحقن المجهري من G-actinالأحمر هنا، والأجنة تتعرض لضغوط الحرارة خفيفة للحث على ASR وداخل النواة actin قضبان التجميع. بالنسبة للمختبرات التي والحصول على الذباب وتلاعب الحقن، ينبغي أن تكون هذه الطريقة قابلة للتنفيذ بسهولة وقابلة للتكيف مع خطوط محددة للدراسة فيما يتعلق بـ ASR، بما في ذلك تحريضها من خلال ضغوط مختلفة أو تعديل في خلفيات جينية متميزة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد أكواب جمع الأجنة وألواح عصير التفاح أجار

  1. قبل خمسة أيام من تجربة الحقن، قم ببناء28 أو شراء كأسين صغيرين على الأقل لجمع الأجنة. جعل الطازجة 60 مم عصير التفاح أجار لوحات لاستخدامها مع أكواب جمع صغيرة28. لوحات تخزين في صناديق بلاستيكية مغطاة بمناشف ورقية رطبة عند 4 °C.
    ملاحظة: سوف توفر أكواب جمع الأجنة الصغيرة، المُلَغَلة بأرقام الذبابة كما هو موضح في الخطوة 1.3، أعدادًا كافية من الأجنة لكل تجربة، مع ضمان إمكانية إجراء معالجة الجنين وحقنه في وقت قصير بما يكفي للسماح بتصوير مراحل النمو المبكرة.
  2. سخّن أطباق عصير التفاح إلى 18 درجة مئوية وأضف داب من معجون الخميرة إلى وسط اللوحة. معجون الخميرة هو عجينة بسيطة من الخميرة النشطة والمياه المقطرة.
  3. لتعزيز زرع البيض الأكثر سخاء، إعداد أكواب جمع مع الذباب 2 أيام قبل التجربة. إضافة ما لا يقل عن 100 الإناث و 50 ذباب الذكور إلى أكواب جمع، وأعلى مع طبق عصير التفاح المعدة (الشكل 1، الخطوة 1). في الأيام التي تسبق تجربة الحقن تغيير لوحات عصير التفاح على الأقل مرتين كل يوم، مرة واحدة في الصباح ومرة واحدة في المساء.
    ملاحظة: يتم الحصول على أفضل نتائج الحقن والتصوير عندما يتم الاحتفاظ بأكواب جمع الأجنة عند درجة حرارة 18 درجة مئوية مع ضوء 12 ساعة/ دورة ضوء.

2. إعداد حل الأسهم العاملة من G-actinالأحمر للمجهر

ملاحظة: هذا الإعداد يجعل فقط 2 ميكرولتر من 5 ملغ / مل المخزون العامل من G-actinالأحمر، لذلك إذا كان المستخدمون غير معتادين على تقنية الحقن المجهري ، فمن المفيد أن تتخطى إلى الخطوة 3 وممارسة الحقن المجهرية مع عازلة محايدة لدرجة اللون اله PH للحفاظ على المخزون العامل الثمين. يمكن تخزين مخزون 10 ميكروغرام من G-actinRed من البائع في عبوته الأصلية في وعاء علوي 16 أوقية مع 500 غرام من الزهاء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

  1. إعداد حل الأسهم G-العازلة مقدما: 5 M تريس-HCl, 0.2 mM CaCl2,pH 8.0. تصفية وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  2. في يوم الحقن، وإعداد 1 مل من حل العمل G-العازلة في أنبوب جديد المفاجئة سقف microcentrifuge على الجليد باستخدام المخزون G-العازلة من الخطوة 2.1، تستكمل بما يلي في التركيزات النهائية المشار إليها: 1 mM dithiothreitol (DTT) و 0.2 mM ATP، درجة النقح الانبعاثات 8.0.
    ملاحظة: حجم 1 مل من حل العمل G-buffer هو أكثر من ما هو مطلوب لتجربة ولكن يبسط إعداد. يمكن التخلص من الفائض بعد التجربة أو يمكن للمستخدمين تقليصها وفقًا لتفضيلاتهم.
    1. حفظ 10 ميكروغرام G-actinالأحمر المخزون على الجليد، أولا إضافة 1 ميكرولتر من تصفية، والمياه المقطرة إلى الجزء العلوي من قطرة الوردي من G-actinالأحمر داخل الأنبوب.
    2. بعد ذلك، إضافة 1 μL من الباردة، أعدت حديثا G-العازلة حل العمل من الخطوة 2.2. Pipet صعودا وهبوطا ~ 20 مرة لخلط جيدا مع حجم ماصة تعيين إلى 1 ميكرولتر. الأسهم G-actinالأحمر سيكون الآن في التخفيف النهائي من 5 ملغ / مل.
  3. احتضان إعداد G-actinالأحمر لمدة 30 دقيقة على الجليد دون عائق.
  4. جهاز طرد مركزي إعداد G-actinالأحمر في 16,000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية في microcentrifuge لإزالة أي عجل.
  5. بعناية pipet 1.5 μL من supernatant في أنبوب قبعة صغيرة صغيرة جديدة على الجليد ، وتجنب بيليه الوردي الداكن.
  6. تخزين إعداد G-actinالأحمر فوق على الجليد لمدة تصل إلى 6 ساعة حتى تصبح جاهزة لتحميل في microneedle.
    ملاحظة: يمكن سحب Microneedles من أنابيب الشعيرات الدموية مقدما على جرة ميكروبيبيت، ثم تخزينها في درجة حرارة الغرفة على شريط من الطين النمذجة في طبق بيتري 100 × 20 ملم. يمكن العثور على المعلمات المقترحة لسحب microneedle في كتاب الطبخ الماص29.

3. جمع الأجنة وجبل للحقن

  1. السماح للذباب لوضع الأجنة لمدة 30 دقيقة على أطباق عصير التفاح مع معجون الخميرة في 18 درجة مئوية.
  2. في حين أن الذباب يتم وضع، قبل الدافئة لوحة عصير التفاح أجار دون معجون الخميرة إلى درجة حرارة الغرفة، وقطع 4 سم × 1 سم إسفين مستطيلة من عصير التفاح أجار مع شفرة حلاقة، ومكان على شريحة زجاجية 25 مم × 75 ملم.
    1. حصاد لوحة من جمع 30 دقيقة وأجنة مُصفّح عن طريق صب التبييض الطازج، المخفف 1:1 مع الماء المقطر، على لوحة ويحوم لوحة لمدة 1 دقيقة، كما هو موضح في28 (الشكل 1، الخطوة 2).
      ملاحظة: تباع ماركات مختلفة من التبييض بتركيزات مختلفة. التبييض المستخدمة هنا هو 6٪ هيبوكلوريت الصوديوم من الزجاجة ويتم تخفيفها إلى تركيز نهائي من هيبوكلوريت الصوديوم 3٪. سوف العلامات التجارية التبييض الأخرى بتركيزات أقل قليلا تعمل بشكل جيد على قدم المساواة.
    2. صب التبييض والأجنة المصفحة في سلة جمع (مصفاة خلية 70 ميكرومتر) وشطف اللوحة مرتين بالماء المقطر من زجاجة بخ، مضيفا هذه يغسل إلى سلة جمع.
    3. شطف بقوة الأجنة المفحتة في سلة جمع مع الماء المقطر حتى لا كتل الخميرة مرئية والسلة لا يترك علامات وردية من التبييض الزائد عندما لطخت على منشفة ورقية.
  3. باستخدام فرشاة الطلاء مع شعيرات مبللة بالماء المقطر، ونقل الأجنة المطهرة والمغسلة من سلة جمع على عصير التفاح إعداد أجار إسفين على الشريحة الزجاجية.
  4. استخدام زوج من ملاقط تلميح غرامة أو إبرة تشريح لترتيب عشرة أجنة في خط مستقيم على طول المحور الطويل من إسفين أجار مستطيلة (الشكل 1, الخطوة 3). ترتيب الأجنة وجها إلى الذيل، بحيث القطب الأمامي يواجه إلى الجانب الأيمن والدوسل تواجه الباحث(الشكل 1، الخطوة 3 ، تضخيم).
  5. قطع 0.5 سم من نهاية تلميح P200 ماصة مع شفرة حلاقة وتراجع في "الغراء الجنين" (وصفها في28). معطف بسخاء منطقة 5 ملم في العرض(الشكل 1، الخطوة 4)على طول الحافة الطويلة من 24 مم × 50 مم مستطيلة الأغطية ، والسماح الجافة ، ولصق الجانب حتى. سوف يستغرق التجفيف ~ 30 ثانية، ويكتمل بمجرد أن تظهر المنطقة المغلفة بالغراء كامل غير لامع بدلاً من الرطب أو لامعة.
    ملاحظة: إعداد "الغراء الجنين" على الأقل 48 ساعة مقدما. أضف ن-هيبتان إلى شرائط من الشريط على الوجهين في قارورة متألقة كما هو موضح في28.
  6. بمجرد أن جفف "الغراء الجنين" ، ضع بلطف جانب الغراء الأغطية لأسفل على قمة صف الأجنة المنحازة على agar ، مما يترك 2-3 مم من المساحة بين حافة الغطاء وصف الأجنة.
    ملاحظة: قد يؤدي لصق الأجنة القريبة جدًا من حافة الغطاء إلى جفاف الأجنة أكثر من اللازم أثناء التجربة.
  7. قم بقلب الغطاء حتى تواجه الأجنة الآن. وينبغي أن تكون عالقة في خط على طول حافة واحدة طويلة من الغطاء، ومنطقة البطن التي تواجهها أقرب حافة الغطاء (الشكل 1، الخطوة 4 ، مكبرة).
  8. قم بتخريب الأجنة عن طريق وضع الغطاء مع الأجنة بلطف فوق 150 غرام من المجففات الزرقاء الطازجة المخزنة في جرة 16 أوقية برغي أعلى. المسمار بإحكام على غطاء واحتضان لمدة 8-10 دقيقة(الشكل 1، الخطوة 5).
  9. بعد جفاف، وإزالة الأغطية من جرة مجفف والشريط كل جانب قصير من الأغطية إلى شريحة المجهر، جانب الجنين حتى،مع اثنين من 4 سم2 قطعة من الشريط على الوجهين بحيث يغطي الجنين سوف تناسب على مرحلة الحقن (الشكل 1، الخطوة 6).
  10. أضف 2-3 قطرات من زيت الهالكربون 27 مع ماصة باستير لتغطية الأجنة المنحازة وحمايتها من المزيد من الجفاف (الشكل 1، الخطوة 6).

4. حقن والحرارة الأجنة الإجهاد لتعزيز تشكيل قضيب actin

ملاحظة: يتم إجراء جميع الحقن في غرفة يتم التحكم فيها بدرجة حرارة عند 18 درجة مئوية.

  1. إعداد غرف الحضانة الرطبة من طبق بيتري الزجاج لا يقل عن 100 مم × 20 ملم في الحجم وخط الغرفة مع التقلبات من ماسحات الأنسجة المختبرية مبللة بالماء المقطر (الشكل 1, الخطوة 8). تدفئة ما قبل غرف الحضانة عند 32 درجة مئوية أو درجة حرارة الحضانة المطلوبة قبل حقن الأجنة.
  2. فتح صمام تدفق الهواء للمخنّغ الصغير وتشغيل على الميكروين (الهواء المضغوط أو الهواء المنزل مع ضغط لا يقل عن 90 psi هو مناسبة).
  3. في حين أن الأجنة هي المجففة، backload السابق إعداد G-actinالأحمر سوبرنات في microneedle باستخدام طرف محمل الصغرى. تعيين ماصة لرسم 1-1.5 μL.
    ملاحظة: بسبب اللزوجة actin قد لا تكون دقيقة تحميل وحدات التخزين وقد يكون هناك actin كافية اليسار لتحميل ما لا يقل عن واحد إلى اثنين من microneedles أكثر. يمكن حقن ما يصل إلى 60 جنينًا لكل ميكرونيدل تم تحميله إذا تم معايرة الميكرونسيدل بشكل صحيح ولم يتم انسداده أثناء التجربة.
  4. إرفاق microneedle إلى حامل إبرة وتشديد المسمار. توصيل أنبوب الهواء إلى الميكروين والتأكد من أن ضغط التدفق الخلفي على موازين microneedle إلى 30 ه ب.
  5. معايرة إعدادات الميكروين لطرد 100 μm قطر فقاعة من G-actinالأحمر (~ 500 pL) على ميكرومتر الشريحة. تدوير مقبض الضغط (500-1500 ه بي سي) وحقن نبض مقبض الوقت (0.1-0.5 s) على الحقن المجهري للحصول على حجم فقاعة الحق. ضبط هذه الإعدادات في كل مرة يتم تحميل microneedle جديدة لحساب التباين في اللزوجة actin وصغر الحجم تلميح.
    ملاحظة: إعداد G-actinالأحمر هو لزجة، وقد يكون هناك الهواء في غيض من microneedle التي ينبغي طرد قبل حقن الأجنة. إذا كان G-actinالأحمر لا يطرد بسهولة من غيض من microneedle، كسر بلطف تلميح microneedle ضد حافة ميكرومتر الشريحة.
  6. ضع الشريحة مع الأجنة المثبتة على مرحلة المجهر.
    ملاحظة: كل حقن إعداد سيكون مختلفا، لذلك سوف يكون الباحثون لضبط طريقة الحقن وفقا لذلك. هنا يتم نقل الأجنة فيما يتعلق ميكرونيدل ثابتة، وحقن كل جنين عن طريق تشغيل الجنين في microneedle.
  7. ضبط مرحلة micromanipulator والتركيز من الهدف 10x على المجهر الخفيف بحيث تكون الأجنة مرئية. الأجنة هي في الطائرة المحورية الصحيحة عندما الخطوط العريضة للغشاء ال vitelline هي الأكثر حدة والجنين يظهر أكبر. اختيار الأجنة لحقن التي هي في مرحلة النمو الصحيح، بحيث بحلول الوقت الذي يتم الانتهاء من الحضانة بعد الحقن، ومعظم مخلب تصل إلى مرحلة النمو المطلوب (على سبيل المثال، حقن الأجنة في مرحلة بوونيس 2-330 من أجل مراقبة قضبان في الخلية بعد الإجهاد الحراري في 32 درجة مئوية).
  8. استخدم أدوات التحكم الدقيقة لإدخال الإبرة إلى نفس المستوى البؤري الذي تستخدمه الأجنة.
    ملاحظة: إذا كان المصيد microneedle على غطاء بينما تتحرك المرحلة أو microneedle، ثم microneedle هو قريب جدا من الشريحة وليس في الطائرة البؤرية الصحيحة. يجب أن يكون microneedle موازية للأغطية ، وليس في زاوية كبيرة (الشكل 1، الخطوة 7).
  9. أدخل المايكرونيدل في الجنين بحيث يضرب الجنين في وسط منطقة البطن، عند "خط الاستواء" للجنين. حقن الزناد مع دواسة القدم أو "حقن" زر عندما تلميح microneedle مرئيا داخل منتصف الجنين (الشكل 1، الخطوة 7).
  10. حقن G-actinالأحمر مرة واحدة وإزالة ببطء microneedle. حرك المرحلة وكرر لكل جنين من المرحلة التنموية المناسبة.
    ملاحظة: توسيع الجنين أمر طبيعي كما يتم حقن G-actinالأحمر وقليلا من السيتوبلازم قد تسرب من الجنين.
  11. بعد حقن جميع الأجنة، ضع الشريحة مع الأجنة في غرفة الحضانة الرطبة المعدة، واغلق الغطاء (الشكل 1، الخطوة 8). إذا كان يحاول الحصول على الأجنة التي تصل إلى الخلية، والحرارة الإجهاد الأجنة في 32 درجة مئوية لمدة 60-75 دقيقة في غرفة الحضانة الرطبة.
    ملاحظة: لوحظ أن أوقات الحضانة تسمح بالتصور للقضبان في الأجنة المعالجة بالحرارة. وسوف يكون وقت الحضانة أطول للأجنة غير الإجهاد الحرارة السيطرة لأن التنمية ستكون أبطأ في درجة حرارة أقل31. ويمكن احتضان هذه الأجنة التحكم في غرف رطبة في درجات حرارة مثل 18 درجة مئوية أو 25 درجة مئوية، اعتمادا على تصميم تجربة محددة والسؤال الذي يتعين طرحه. الحد الأدنى من وقت الحضانة اللازملـ G-actin Red لنشره في جميع أنحاء الجنين هو 30 دقيقة.

5. صورة actin قضبان في الأجنة وشدد الحرارة عن طريق المجهر confocal

  1. في حين يجري الأجنة وشدد الحرارة، تشغيل المجهر confocal واختيار قناة الليزر 561 نانومتر.
  2. نقل عدسة الهدف (25x، 40x أو 63x الموصى بها) إلى موقف العمل.
  3. إذا كان التصوير حرارة وشدد الأجنة، ثم تعيين حاضنة مرحلة ساخنة لتحقيق درجة حرارة داخلية من 32 درجة مئوية. يمكن استخدام مقياس حرارة نقطة واطلاق النار أو الأشعة تحت الحمراء للتحقق من درجة الحرارة في أو بالقرب من الهدف.
  4. إزالة الشريحة مع الأجنة المحقونة من غرفة الحضانة الرطبة بعد اكتمال الحضانة (الشكل 1، الخطوة 9).
  5. تعمل بسرعة، برفق ابعاد قطع الشريط على الوجهين التي كانت تستخدم في التمسك الأغطية مع الأجنة شنت على الشريحة (الشكل 1، الخطوة 9).
    تنبيه: كن لطيفًا أثناء هذه الخطوات حيث يمكن أن تتحطم الأغطية بسهولة إذا تم تطبيق الكثير من القوة.
  6. عصا اثنين 2.5 سم طويلة قطعة من الشريط على الوجهين معا وقطع الشريط في نصف بالطول لجعل اثنين من شرائط، 2.5 × 0.5 سم طويلة (الشكل 1، الخطوة 10).
  7. عصا ثلثي طول كل شريط الشريط على الغطاء الأول، يحيط كل جانب من الأجنة في زيت الهالوكربون 27 (الشكل 1, الخطوة 10, البرتقالي), ترك ثلث الشريط شرائط تتدلى قبالة حافة الغطاء الأول حيث عالقون الأجنة. استخدمي اليدين القفازتين، وتوخي الحذر من لمس الأجنة خلال هذه الخطوة.
  8. ضع بلطف غطاء مستطيل ثان على رأس أشرطة الشريط لشطائر الأجنة بين الأغطية (الشكل 1، الخطوة 10 ، الأزرق). محاذاة حواف 25 ملم ولكن الحفاظ على حواف 50 مم إزاحة من بعضها البعض بمقدار 1 سم في العرض.
    ملاحظة: هذا الغطاء الثاني 'ق السطح الكامل سوف تصبح سطح التصوير الجديد الذي سوف يواجه عدسة الهدف، لذلك الحرص على عدم الحصول على بصمات الأصابع أو زيت الهالكربون 27 على هذا السطح يغطي الثاني. الإزاحة ضروريّة أنّ أنّ إضافيّة هالوكاربون 27 زيت يستطيع كنت أضفت أن يزجّت أجنة بتعادل. إذا لزم الأمر، إضافة زيت الهالكربون 27 في التماس حيث يغطي اثنين يجتمع في الجزء العلوي من شطيرة وسوف معطف الأجنة عن طريق عمل الشعرية (انظر خطوط متقطعة في الشكل 1، الخطوة 10).
  9. اضغط بلطف على المناطق من الأغطية التي هي مباشرة على رأس الشريط الشريط مع الجانب الحاد من razorblade للحصول على غطاء للتمسك الشريط.
  10. اقلب ساندويتش الأغطية وضعه على ممسحة نسيج معملية للحفاظ على سطح التصوير نظيفًا وتحمله إلى المجهر confocal (الشكل 1، الخطوة 11). تأكد من أن الشريط عالق تمامًا في كل من الأغطية قبل التصوير.
  11. تأكد من أن المرحلة الساخنة في درجة الحرارة وإذا كان استخدام المجهر المقلوب، إضافة السائل الغمر على عدسة الهدف المحدد.
  12. ضع ساندويتش الأغطية على المسرح بعناية لضمان أن سطح التصوير الجديد(2 nd coverslip) هو واحد لمس السائل الغمر(الشكل 1، الخطوة 11).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بلصق شطيرة الأغطية على المسرح بقطعتين صغيرتين من الشريط المزدوج الجانب لمنع الحركة غير الضرورية أثناء التصوير إذا لم تكن الأغطية مناسبة بشكل جيد في المرحلة الساخنة.
  13. التركيز على الجنين الذي هو في الخلية (Bownes المرحلة 4a30) أو مرحلة النمو المطلوب باستخدام إما الضوء المنقولة أو الفلوريس.
  14. بمجرد أن يتم التركيز على الجنين، انتقل إلى وضع اقتناء الليزر على المجهر confocal وضبط قوة الليزر والمكاسب، وحجم الإطار، والتبليط، وإعدادات الإسقاط حسب الرغبة.
  15. خذ صورًا للعرض السطحي عبر الأسطح المحورية لنويات الجنين للعثور على قضبان أكتين داخل النواة. يجب أن تظهر قضبان في اتجاهات متعددة كما الشرائط أو النقاط الساطعة داخل نواة مظلمة نسبيا (الشكل 2A, 2C).

6- تجارب التصوير البديلة

  1. أداء FRAP للتحقيق في دوران actin على طول قضبان actin داخل النواة أو في هياكل أكتين السيتوبلازمي, مثل نصائح من الشقوق غشاء البلازما أثناء خلوية.
  2. في برنامج التصوير، اختر منطقة مستطيلة حول نصائح جفن أو قضبان actin التي للحصول على التجربة.
  3. اختيار منطقة صغيرة مربعة من مركز قضيب actin داخل منطقة اقتناء مستطيلة لتبييض. تأكد من أن نصائح قضيب actin مرئية ولا يتم تبييضها أثناء التجربة للسماح بالتتبع الدقيق للقضيب داخل النواة.
  4. تعيين ليزر التبييض لتكفير 50x وتعيين قوة الليزر التبييض إلى أقصى حد.
  5. اختر دورة زمنية للحصول على الصور كل ثانية بإجمالي يصل إلى 120 ثانية بأقصى سرعة بكسل وتعيين الليزر على التبييض بعد أول ثانيتين من الحصول على الصور.
  6. كمّيّة البيانات لتحديد نصف الوقت من ال [فلويسنسّنسّا ريستنس1].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم تصوير سير عمل تخطيطي للتعامل مع الأجنة في الشكل 1، ويتم عرض جدول زمني لتجربة نموذجية في الجدول 1. تقدير لنتيجة تجريبية جيدة هو أنه لكل 10 أجنة حقن، ما لا يقل عن نصف الأجنة ينظر إليها سيكون في مرحلة النمو الصحيح، غير التالفة، وتظهر ASR قوية مع الإجهاد الحراري في 32 درجة مئوية. وسوف يتضح هذا ASR من خلال تجميع قضبان actin داخل النواة كما هو مبين في صورة عرض سطحية تمثيلية للجنين في الشكل 2A (اللوحة اليمنى). سوف تظهر قضبان أكتين في عدة اتجاهات (...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أهمية هذه الطريقة هي أنها تستخدم بروتوكول راسخ من الحقن المجهري في الأجنة دروسوفيليا 21,22,23,24,25,26,27 لتمكين البحوث الجديدة بشأن ASR و المرافقة actin قضبان التجميع. من المزايا الرئيسية لحقن G-actinRed في الأجنة الحية أنه يمكن دراسة ASR في ظل مجموعة متنوعة من السياقات....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يعلن عن تضارب المصالح.

شكر وتقدير

يعترف المؤلفان بامتنان بعمل ليوليو تشنغ وتسنغ هوي شيويه، اللذين ساعدا في ريادة هذه التقنية في مختبر سوكاك، وكذلك حسن سيد الذي ساعد في التحليل. يتم تمويل العمل لهذه الدراسة من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة (R01 GM115111).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)Millipore-SigmaA23835Gمكون من عصير التفاح G Buffer
، Mott's ، 64 أونصة سائلة014800000344أطباق عصير
Bacto AgarBD214010مكون من أطباق عصير التفاح
مبيض ، مبيد للجراثيم PureBright ، 6.0٪ هيبوكلوريت الصوديومKIK International059647210020للأجنة dechorionating
كلوريد الكالسيومMillipore-SigmaC1016500Gمكون مصفاة الخلية العازلة
G ، 70 & mu ؛ mFalcon352350لجمع الأجنة منزوعة الغضب
المجهر متحد البؤر ، LSM 880 34 قناة مع AiryscanZeiss 0000001994956للتصوير قضبان الأكتين داخل النواة
المجففDrierite24001لتجفيف الأجنة
تشريح المجهر ، Stemi 508 Stereoscope مع تكبير 8: 1Zeiss4350649000000لترتيب الأجنة على إسفين أجار
تشريح إبرة ، 5 فيفيشر Scientific08965Aلترتيب الأجنة على أجار إسفين
Dithiothreitol (DTT)Fisher ScientificBP1725مكون من
G عازلة على الوجهين ، سكوتش دائم ، 0.5 بوصة × 250 في3M021200010323لصنع غراء الجنين
قفص جمع الأجنةGenessee Scientific59100لإسكان الذباب البالغ وجمع الأجنة
ملاقط ذات طرف ناعم ، ملاقط دومون ، علومالمجهر5 72701Dلترتيب الأجنة على أجار إسفين
الشعيرات الدموية الزجاجية ، زجاج بوروسيليكات ، رقيق 1 مم × 0.75 ممWorld Precision Instruments، Inc.TW1004للإبر الدقيقة
زيت الهالوكربون 27Millipore-SigmaH8773100MLلترطيب الأجنة
حاضنة المرحلة الساخنةZeiss4118579020000 ، 4118609020000 ، 4118609010000للتصوير متحد البؤر
مساحات الأنسجة المختبرية ، KimWipesKimBerly-Clark34155مساحات الأنسجة المختبرية
المجهر الضوئي ، تباين الطور المقلوب Invertoskop 40C مجهر ،مجهر حقنZeissالمعاد
تجديده Methyl-4-hydroxybenzoateMillipore-SigmaH36471KGمكون من ألواح عصير التفاح
Microinjector ، FemtoJet4xEppendorf5253000025Microinjector
نصائح اللودر الصغير ، epT.I.P.S. 20 & mu ؛ LEppendorf5242956003لتحميل Microneedles
Micromanipulator ومرحلة الحقن مع أقراص x و y و z لتعديل الإبرةBernard Instruments، Inc (هيوستن ، تكساس)مخصصلأداء
مجتذب الماصات الدقيقة ، موديل P-97 ، Flaming / BrownSutter InstrumentsP97لسحب الأنابيب الشعرية لصنع زجاج
غطاء مجهر دقيق 24x50-1.5فيشر Scientific12544Eلتركيب الأجنة
شرائح المجهر ، أرجواني Colorfrost ، منظف مسبقا ، 25 × 75 × 1 مم22037081 فيشر العلميلتركيب الأجنة للحقن
n-HeptaneFisher ScientificH3601مكون غراء الجنين
الهدف ، 10xZeissتم إيقافالهدف 10x لمجهر
الحقنالهدف ، C-Apochromat 40x / 1,2 W Korr. FCSZeiss4217679971711هدف مائي 40x للهدف متحد البؤر
، LD LCI Plan-Apochromat 25x / 0.8 Imm Cor DIC M27 للزيت أو الماء أو زيت السيليكون أو الغمر بالجلسرين (D = 0-0.17 مم) (WD = 0.57 مم عند D = 0.17 مم)Zeiss4208529871000هدف الغمر المختلط 25x للهدف متحد البؤر
، Plan-Apocrhomat 63x / 1.40 Oil DIC f / ELYRAZeiss4207829900799هدف الزيت 63x للمتحد البؤر
فرشاة الرسم ، روبرت سيمونز إكسبريشن E85 دائري مدبب مقاس 2Daler-Rowney038372016954لنقل الأجنة
مناشف ورقية ، مناشف ورقية قابلة للطي Kleenex C ،884266344845كيمبرلي كلاركلمصفاة الخلايا النشاف
ماصة باستور ، 5 3/4 بوصةفيشر Scientific1367820Aلتغطية الأجنة بزيت
صحن بتري ، زجاج ، 100 × 20 ممكورنينج3160102لغرفة الحضانة الرطبة
طبق بتري ، بلاستيك ، 60 × 15 ممVWR25384092لأطباق عصير التفاح
الماصة ، مرجع Eppendorf 0.5-10 & LEppendorf2231000604لتحميل
طرف ماصة الإبرة الدقيقة ، xTIP4 250 & mu ؛ LBiotix63300006لإضافة غراء الجنين إلى غطاء
شفرة الحلاقةVWR55411050لقطع إسفين أجار ، الشريط ، أطراف الماصة
الأكتين الكروي المترافق بالرودامين ، الصفائح الدموية البشرية (غير العضلية ؛ 4x10 & mu ؛ ز)الهيكل الخلوي ، Inc.APHR-AG-actin ^
قارورة تلألؤ أحمر ، 20 مل زجاج بوروسيليكات مع بطانة بولي إيثيلين وأغطية اليوريافيشر 033377 العلميلصنع غراء الجنين
برغي برغي ، 16 أوقيةNalgene000194414195لتجفيف الأجنة
المرحلةميكرومتر علوم المجهر الإلكتروني602104PGلمعايرة حجم السكروز بحقن G-actin
Millipore-Sigma840971KGمكون من أطباق عصير التفاح قاعدة
TrizmaMillipore-Sigmaمكون T15031KGالعازلة G
، خميرة شركة Lesaffre ، Red Star Active Dry ، 32 أوقيةمن Lesaffre Yeast Corporation117929157002مكون من معجون الخميرة
من مكونات التفاح الإلكتروني النمط بيضاء من الخميرة

المراجع

  1. Figard, L., et al. Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos. Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).
  2. Ashworth, S. L., et al. ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion. American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).
  3. Vandebrouck, A., et al. In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).
  4. Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).
  5. Bamburg, J. R., et al. ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases. Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).
  6. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  7. Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).
  8. Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress. Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).
  9. Iida, K., Iida, H., Yahara, I. Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells. Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).
  10. Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).
  11. Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin. Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).
  12. Minamide, L. S., et al. Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods. Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).
  13. Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons. The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).
  14. Feldman, M. L., Peters, A. Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus. Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).
  15. Nishida, E., et al. Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells. Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).
  16. Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).
  17. Xue, Z., Sokac, A. M. Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage. The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).
  18. Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).
  19. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).
  20. Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. Formins filter modified actin subunits during processive elongation. Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).
  21. Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).
  22. Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).
  23. Carreira-Rosario, A., et al. Recombineering homologous recombination constructs in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (77), 50346(2013).
  24. Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection techniques for studying mitosis in the Drosophila melanogaster syncytial embryo. Journal of Visualized Experiments. (31), 1382(2009).
  25. Catrina, I. E., Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P. Visualizing and tracking endogenous mRNAs in live Drosophila melanogaster egg chambers. Journal of Visualized Experiments. (148), 58545(2019).
  26. Wessel, A. D., Gumalla, M., Grosshans, J., Schmidt, C. F. The mechanical properties of early Drosophila embryos measured by high-speed video microrheology. Biophysical Journal. 108 (8), 1899-1907 (2015).
  27. Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).
  28. Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).
  29. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 and P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instruments. Novato, CA. (2018).
  30. Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 33 (3), 789-801 (1975).
  31. Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).
  32. Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing. Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الإجهاد الحراريتقنية الحقن المجهريالمجهر البؤريتجارب استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي (FRAP)G-actin الأحمراستجابة الأكتين للإجهادتثبيت الأجنةاستعادة الفلورة
التصوير داخل النواة أكتين رودز في الحرارة الحية وشدد الأجنة Drosophila
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.