مقالة منهجية

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

DOI:

10.3791/61298

⸱

يوليو 16, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University, 2Institute for Structural Biology, Drug Discovery and Development, School of Pharmacy, Virginia Commonwealth University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا هو بروتوكول لتحديد الدولة القلة من البروتينات الغشاء الذي يستخدم نظام غشاء الخلايا الأصلية نانو جسيمات بالاقتران مع المجهر الإلكتروني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات البروتينية البروتينية في أنظمة غشاء الخلية تلعب أدواراً حاسمة في مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية - من التفاعلات بين الخلايا إلى الخلية إلى تحويل الإشارة؛ من استشعار الإشارات البيئية إلى الاستجابة البيولوجية؛ من تنظيم التمثيل الغذائي إلى التحكم في النمو. إن المعلومات الهيكلية الدقيقة للتفاعلات البروتينية البروتينية أمر حاسم لفهم الآليات الجزيئية لمجمعات البروتينات الغشائية وتصميم جزيئات محددة للغاية لتعديل هذه البروتينات. وقد تم تطوير العديد من في الحي وفي المختبر النهج للكشف عن وتحليل التفاعلات البروتين البروتين. ومن بينها نهج البيولوجيا الهيكلية هي فريدة من نوعها من حيث أنه يمكن أن توفر معلومات هيكلية مباشرة من البروتين البروتين التفاعلات على المستوى الذري. ومع ذلك، لا يزال الغشاء الحالي البيولوجيا الهيكلية البروتين تقتصر إلى حد كبير على الأساليب القائمة على المنظفات. العيب الرئيسي للطرق القائمة على المنظفات هو أنها غالبا ما تتفكك أو تجزئة مجمعات البروتين غشاء مرة واحدة يتم إزالة البيئة ثنائية الطبقة الدهون الأصلية من قبل جزيئات المنظفات. لقد تم تطوير نظام جسيمات نانوية غشاء الخلية المحلية للغشاء البيولوجيا الهيكلية البروتين. هنا، ونحن نثبت استخدام هذا النظام في تحليل التفاعلات البروتين البروتين على غشاء الخلية مع دراسة حالة من الدولة القلة من AcrB.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب التفاعلات البروتينية (PPI) أدوارًا محورية في جميع أنحاء علم الأحياء ، من الحفاظ على بنية ووظيفة البروتينات إلى تنظيم الأنظمة بأكملها. تأتي مؤشرات أسعار المنتجين في أشكال مختلفة ويمكن تصنيفها استنادًا إلى أنواع التفاعلات التي تشكلها. أحد هذه التصنيفات هو هو homooligomeric أو هيترووليجومي، على أساس ما إذا كانت التفاعلات بين الوحدات الفرعية متطابقة أو بروتينات مختلفة تعمل كمكونات فرعية. ويستند تصنيف آخر على قوة التفاعل إذا كانت التفاعلات تؤدي إلى تشكيل مجمعات مستقرة أو حالات معقدة عابرة. المعلومات الهيكلية حول PPIs بين البروتينات أمر بالغ الأهمية في فهم الآلية التي البروتينات تنفيذ وظيفتها. وقد قدر أن أكثر من 80٪ من البروتينات تعتمد على تشكيل معقد من أجل القيام بأدوارهم الوظيفية1. وبالنظر إلى النسبة المئوية للبروتينات التي لوحظت أنها تعتمد على مؤشرات أسعار المنتجين من أجل الأداء الفطري السليم، فإن أهميتها في علم الأحياء واضحة بسهولة، ومع ذلك فإن القدرة على التحقيق بشكل صحيح في البروتينات التي تشارك في هذه التفاعلات ظلت صعبة بسبب القيود في التقنيات المتاحة لمراقبة تجريبية عندما تشكل البروتينات مؤشرات أسعار المنتجين.

هناك درجة عالية من الاختلاف بين النتائج للعديد من PPIs محددة تجريبيا بسبب كمية عالية من الضوضاء ، والإيجابيات الكاذبة ، والسلبيات الكاذبة التي هي مستمدة من العديد من التقنيات المتاحة حاليا تحديد مؤشر أسعار المنتجين. هذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة للخميرة اثنين الهجين (Y2H) النظام ، جنبا إلى جنب تقارب تنقية الطيف الكتلي (TAP - MS) ، ونقل الطاقة الرنين الفلوري (فريت) ، والتي تمثل ثلاثة من الأساليب الأكثر استخداما لتحديد PPI2،3،4،5،6،7. وبالمقارنة، يمكن استخدام تقنيات البيولوجيا البنيوية للبروتين، مثل الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والتصوير البلوري بالأشعة السينية والمجهر الإلكتروني (EM)، للحصول على معلومات هيكلية عالية الدقة حول تفاعلات البروتين والبروتين وصولاً إلى المستوى الذري والسماح بالتأكد البصري المباشر من التفاعلات التي تحدث لبروتين ذي فائدة مستهدفة. جميع المتاحة حاليا غير هيكل أساس PPI تحديد تقنيات البحث (على سبيل المثال، Y2H، TAP-MS، وFRET) تفتقر إلى هذه القدرة، ويعانون بالإضافة إلى ذلك من صعوبة في تحديد التفاعلات الضعيفة والعابرة بين البروتينات5. وتتعزز هذه النقائص عند دراسة البروتينات الغشاء بسبب التعقيد الإضافي الناجم عن المتغير الإضافي للبيئة الدهنية التي تؤثر على تشكيل الهيكل الرباعي السليم والتجميع المعقد غير الستيري.

تشكل بروتينات الأغشية جزءًا كبيرًا من البروتيوم ومن المعروف أنها تلعب العديد من الأدوار الحاسمة في عمل الخلايا السليمة داخل جميع الكائنات الحية. على الرغم من أن البروتينات الغشاء تقدر لتشكل 27٪ من الجينوم البشري وتشكل ~ 60٪ من جميع أهداف المخدرات الحالية هناك شذوذ كبير في عدد النماذج حلها للبروتينات الغشاء التي تشكل فقط ~ 2.2٪ من جميع الهياكل البروتينية المنشورة8،9،10. السبب الرئيسي للتباين في توافر المعلومات الهيكلية يكمن في الخصائص الجوهرية للبروتينات الغشاء أنفسهم. بسبب ضعف الذوبان، والاعتماد على التفاعلات مع بيئة الدهون للحفاظ على بنية ووظيفة الأم، والخصائص الفيزيائية الكيميائية المختلفة للغشاء الدهني نفسه، لا تزال البروتينات الغشاء يمثل مشكلة كبيرة عند تنفيذ تقنيات البيولوجيا الهيكلية لدراستها. من هذه الخصائص الجوهرية، أهم للحصول على معلومات هيكلية دقيقة هو شرط وجود تفاعلات مع البيئة الطبيعية للدهون بالنسبة لهم للحفاظ على هيكلها الأصلي ووظيفتها. البيئة الدهنية مثل هذا جزء لا يتجزأ من هيكل ووظيفة البروتينات الغشاء أن مفهوم memtein (مزيج من الكلمات غشاء والبروتين) وقد اقترح كوحدة أساسية من هيكل غشاء البروتين وظيفة11. على الرغم من أهمية التفاعلات البروتين الدهني المتوفرة حاليا على أساس هيكل PPI تقنيات تحديد غالبا ما تتطلب أن البروتينات التي يجري دراستها تكون قابلة للذوبان أو أن solubilized مع المنظفات. التعرض للمنظفات القاسية يمكن أن تشوه البروتينات أو تسبب ايجابيات وسلبيات كاذبة بسبب إزالة الليببيديشن، والتي يمكن أن تحفز التجميع، denaturation البروتين، تفكك التفاعلات غير التكافؤ، وتشكيل الدول القلوية الاصطناعية. نظرا لضرورة الحفاظ على بيئة الدهون الطبيعية لتحديد دقيق للدولة oligomeric الأصلي من البروتينات الغشاء وضعنا نظام جسيمات نانوية غشاء الخلايا الأصلية (NCMNs)12 استنادا إلى ذكر سابقا الستيرين حمض الجزيئات الدهنية (SMALP)13 طريقة.

SMALP يستخدم الستيرين حمض البيلومير حمض المالويك كما البوليمر غشاء نشط لاستخراج و solubilize البروتينات الغشاء. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) هو بوليمر أمفيفيلي فريد بسبب مويت الستيرين الماعور ويعارض تماماً حمض ماليك هيدروفيلي. وهو يشكل الجسيمات النانوية عن طريق التمصاص ، وزعزعة الاستقرار ، وتعطيل غشاء الخلية في آلية تعتمد على الأسى والh14. هذا النشاط الوظيفي من SMA هو ما يسمح لها أن تستخدم كنظام خال من المنظفات لاستخراج البروتين غشاء و solubilization. يتميز نظام NCMN عن نظام SMALP في عدة جوانب. الميزة الأكثر فريدة من نوعها من نظام NCMN هو أن لديها مكتبة البوليمر غشاء نشط مع العديد من البوليمرات التي لها خصائص فريدة من نوعها التي تجعلها مناسبة لعزل العديد من البروتينات الغشاء المختلفة التي تتطلب ظروف مختلفة للاستقرار والأداء الأصلي. كما أن نظام NCMN لديه بروتوكولات مختلفة مقارنة بطريقة SMALP عندما يتعلق الأمر بإعداد الجسيمات النانوية. ومن الأمثلة على ذلك أن الناصحات الوطنية للنقان تستخدم تنقية عمود تقارب النيكل أحادي الخطي لتحديد الهيكل عالي الدقة؛ ويمكن ملاحظة تأثير هذه البروتوكولات المختلفة عند مقارنة بروتوكول NCMNs ، الذي ولدت 3.2 و 3.0 Å Å كريو - م AcrB الهياكل ، مع دراسة مماثلة باستخدام طريقة SMALP ، مما أدى إلى هيكل 12 15 Åالقرار. هذه السمات الفريدة لنظام NCMN هي التحسينات التي أدخلت على طريقة SMALP التي تم إنشاؤها سابقاً وتجعلها مرشحًا مثاليًا لدراسة مؤشرات أسعار المنتجين.

و متعدد المخدرات efflux الناقل AcrB موجود كما homotrimer وظيفية في E. القولونية12. واقترح تحليل مطفرة أن طفرة نقطة P223G واحدة، وتقع على حلقة التي هي المسؤولة عن استقرار تريم AcrB، يزعزع استقرار حالة الثلث ويسفر عن مونومر AcrB عند إعدادها مع المنظفات DDM، والتي يمكن الكشف عنها مع الجيل الأزرق الأصلي الكهربائي16. ومع ذلك ، فإن تحليل FRET من AcrB - P223G متحولة اقترح أنه عندما في الخلية الأصلية غشاء الدهون bilayer البيئة ، وغالبية متحولة AcrB - P223G لا تزال موجودة كما تريم وأن مستويات التعبير عن كل من نوع البرية AcrB و AcrB - P223G متشابهة. ومع ذلك، وعلى الرغم من نتائج تحليل فريت، أظهرت مقايسة نشاط النقل متحولة أن النشاط انخفض بشكل كبير بالمقارنة مع نوع البرية16. على الرغم من أن تكنولوجيا فريت قد استخدمت شعبيا لتحليل البروتين البروتين التفاعلات, وقد أظهرت الأبحاث أنه يمكن أن تعطي في كثير من الأحيان ايجابيات كاذبة17,18,19,20.

في الآونة الأخيرة، تم تحديد عالية الدقة هياكل cryo-EM من تريمر AcrB الذي أظهر التفاعل مع AcrB مع غشاء الخلية الأصلية المرتبطة بها bilayer الدهون من خلال استخدام NCMNs12. من حيث المبدأ، يمكن بسهولة استخدام الـ NCMNs لتحليل تفاعلات البروتين والبروتين الموجودة على غشاء الخلية الأصلية. في اختبار لهذا النظام، أجريت تجارب لمراقبة حالة القلة في AcrB-P223G مباشرة باستخدام الجسيمات النانوية لغشاء الخلايا الأصلية والمجهر الإلكتروني السلبي الملطخ. من أجل مقارنة مع نوع البرية AcrB الجسيمات النانوية، استخدمنا نفس البوليمر النشط غشاء (SMA2000 المحرز في مختبرنا، والتي يتم فهرستها كما NCMNP1-1 في مكتبة NCMN) تستخدم لتحديد هيكل عالي الدقة كريو EM من AcrB والبوليمرات البديلة الموجودة في مكتبة NCMNs12. استنادا إلى النتائج التي تم الإبلاغ عنها سابقا، كان من المتوقع أن غالبية متحولة AcrB-P223G موجودة في شكل جسيمات نانوية غشاء الخلايا الأصلية ثلاثية الكرسية21. ومع ذلك، لم يتم العثور على أي تقليم AcrB موجودة في العينة، مثل تلك التي لوحظت مع نوع البرية AcrB. وهذا يشير إلى أن غالبية AcrB-P223G لا تشكل تقليم على غشاء الخلية الأصلية كما اقترح سابقا.

هنا نبلغ عن تحليل مفصل لـ E. coli AcrB-P223G في مقارنة مع النوع البري E. القولونية AcrB باستخدام NCMNs. هذه الدراسة الحالة من AcrB تشير إلى أن الـ NCMNs هو نظام جيد لتحليل التفاعل بين البروتين والبروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تعبير البروتين

  1. تلقيح 15 مل من رائع مرق (السل) وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية المحددة لbsmids مع BL21 (DE3) pLysS الخلايا التي تحتوي على AcrB التعبير عن plasmids في 50 مل أنابيب بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة.
  2. تحقق من الكثافة البصرية للثقافة بين عشية وضحاها في 600 نانومتر (OD600) وتأكد من أن أكثر من 2.0.
  3. تمييع 5 مل من خلية الثقافة في 1 L من وسائل الإعلام السل التي تحتوي على المضادات الحيوية محددة لplsmids واحتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز حتى OD600= 0.8 ثم حث مع IPTG التي لديها تركيز النهائي من 1 mM.
  4. تنفيذ التعريفي في 20 درجة مئوية مع اهتزاز لمدة 20 ساعة.
  5. بيليه أسفل الخلايا باستخدام الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية و 4000 س ز.

2. تحلل الخلايا وعزل الغشاء

  1. Resuspend بيليه الخلية في العازلة A(الجدول 1، استخدم DDM العازلة A أو NCMNs العازلة اعتمادا على نظام تنقية الذي هو لمتابعة) باستخدام 80 مل لكل 20 غرام من بيليه الخلية.
  2. التجانس الكريات الخلية resuspended باستخدام التجانس Dounce الزجاج في 4 درجة مئوية أو إذا كان في درجة حرارة الغرفة تأكد من وضع على الجليد مباشرة بعد.
  3. نقل العينة إلى كقار معدني على الجليد وفك الخلايا عن طريق تحميلها في التجانس الضغط العالي في 4 درجة مئوية و 1500 بار.
    1. كرر عملية تحميل الخلايا في المهيج والسماح لهم بالمرور من خلال التجانس لدورات 3-4 أو حتى يبدأ lysate في التوضيح.
  4. الطرد المركزي في 15،000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 °C.
  5. جمع supernatant وتحميل في أنابيب الطرد الفائقة والطرد المركزي في 215000 × ز ل 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
  6. تجاهل supernatant وجمع الكريات الغشاء من أنابيب فائقة التركيز. تخزين أي بيليه غشاء الزائدة في -80 درجة مئوية.

3. إعداد الجسيمات النانوية غشاء الخلية الأصلية

  1. Resuspend 1 غرام من بيليه غشاء في 10 مل NCMNs العازلة A(الجدول 1).
  2. التجانس عينة غشاء الخلية resuspended مع التجانس Dounce الزجاج في 20 درجة مئوية.
  3. نقل عينة الغشاء المعلق إلى أنبوب البولي بروبلين 50 مل وإضافة غشاء البوليمرات النشطة حل الأسهم إضافية NCMNs العازلة A لتحقيق التركيز النهائي من 2.5٪ (ث / الخامس) غشاء البوليمر النشط (NCMNP1-1 أو NCMNP5-2).
    ملاحظة: يجب أن يتم إجراء حلول المخزون من البوليمرات النشطة الغشاء في الماء المقطر المزدوج ويمكن الاحتفاظ بها بتركيزات مختلفة، ولكن عادة 10٪ (ث / الخامس).
  4. هز العينة لمدة 2 ساعة في 20 درجة مئوية.
  5. قم بتحميل العينة إلى طارد فائق التركيز وتدور عند 150,000 x غم مقابل 1 ساعة عند 20 درجة مئوية.
  6. في حين يجري العينة فائقة الطرد تبدأ في اكويات عمود 5 مل ني NTA مع 25 مل من NCMNs العازلة A.
  7. جمع سوبراتين بعد الطرد الفائق اكتمال وتحميله على 5 مل من العمود NI-NTA في درجة حرارة الغرفة مع معدل تدفق 0.5 مل / دقيقة باستخدام مضخة حقنة.
  8. غسل البروتين السائل الكروماتوغرافيا (FPLC) خطوط مع ما يكفي NCMNs المخزن المؤقت B(الجدول 1)لطرد النظام تماما ومن ثم ربط العمود إلى الجهاز FPLC.
  9. غسل العمود مع 30 مل من NCMNs المخزن المؤقت B مع معدل تدفق 1 مل / دقيقة وجمع تدفق من خلال.
  10. غسل العمود مع 30 مل من NCMNs العازلة C(الجدول 1) مع معدل تدفق 1 مل / دقيقة وجمع تدفق من خلال.
  11. Elute البروتين مع 20 مل من NCMNs العازلة D(الجدول 1)بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة وجمع العينة باستخدام جامع كسر والكسور التي يتم تعيين كل إلى 1.0 مل.
  12. تخزين عينات البروتين في 4 درجة مئوية.
  13. تشغيل مقايسة كهرباء هلام SDS-PAGE من أجل التحقق من العينات التي تتوافق مع القمم التي لوحظت على الرسم البياني FPLC elution.

4. SDS-PAGE هلام الكهرباء

  1. إعداد غرفة الصب عن طريق لقط الزجاج إلى جهاز الصب.
  2. إعداد هلام الفصل بنسبة 12٪ وفقا للوصفة المذكورة في الجدول 1.
    ملاحظة: مرة واحدة يتم إضافة TEMED سوف هلام البلمرة بسرعة حتى أضيف هذا مرة واحدة فقط على استعداد لصب الجل.
  3. صب الجل، وترك 2 سم تحت الجزء السفلي من المشط لجل التراص.
  4. إزالة أي فقاعات عن طريق طبقات الجزء العلوي من هلام مع isopropanol 100٪ وانتظر هلام الفصل البلمرة.
  5. إزالة الايزوبروبانول وغسل أي آثار من ايزوبروبانول مع الماء المقطر.
  6. إعداد هلام التراص وفقا لوصفة المذكورة في الجدول 1.
    ملاحظة: مرة واحدة يتم إضافة TEMED سوف هلام البلمرة بسرعة حتى أضيف هذا مرة واحدة فقط على استعداد لصب الجل.
  7. صب هلام التراص على رأس هلام الفصل.
  8. إضافة مشط إلى الغرفة لتشكيل الآبار والانتظار لجل التراص البلمرة تماما.
  9. مكان 1 ميكرولتر من 1 M DTT في أنبوب microcentrifuge لكل عينة الكسر التي تحتاج إلى أن يتم تشغيلها على الجل.
  10. إضافة 7 ميكرولتر من 4x تحميل العازلة لكل أنبوب كذلك.
  11. إضافة 20 ميكرولتر من عينة من الكسور التي تحتاج إلى أن يتم تشغيلها على هلام إلى كل أنبوب microcentrifuge.
  12. دوامة الأنابيب التي تحتوي على العينات.
  13. تدور أسفل أنابيب العينة باستخدام الطاولة microcentuge لمدة 3 ق وتأكد من أن جميع العينة قد عاد إلى أسفل الأنابيب.
  14. تحضير الخلية الكهربائية هلام عن طريق تأمين 12٪ الكاسيت هلام polyacrylamide في مكان وملء الغرف الداخلية والخارجية للخلية مع تريس-خلات-EDTA (تاي) العازلة(الجدول 1).
  15. قم بتحميل علامة الوزن الجزيئي في الممر الأول من الجل مع الحجم المناسب المطلوب من خلال تعليماته.
  16. تحميل 28 ميكرولتر من العينة من كل أنبوب مختلطة مع DTT وتحميل العازلة.
  17. ضع غطاء الخلية الكهربائية فوق الصندوق وقم بتوصيل الغطاء بمزود الطاقة.
  18. بدوره على امدادات الطاقة وتعيينه إلى 100 V والسماح لها لتشغيل لمدة 20 دقيقة.
  19. بعد 20 دقيقة، وزيادة التيار امدادات الطاقة إلى 140 V والاستمرار في تشغيله لآخر 30-40 دقيقة أو حتى الفرقة من صبغة العازلة تحميل تصل إلى الجزء السفلي من الكاسيت هلام.
  20. بعد الانتهاء من تشويه البقعة و de-stain الجل لتصور عصابات البروتين الواردة داخل الجل.

5. تنقية البروتين باستخدام DDM

ملاحظة: الغرض من تنفيذ عملية التنقية هذه هو أن تكون بمثابة عنصر تحكم للتجارب باستخدام البوليمرات النشطة الغشاء.

  1. Resuspend 6-10 غرام من بيليه غشاء، من الخطوة 2.6، في DDM العازلة(الجدول 1)باستخدام 5 مل / غرام من بيليه غشاء.
  2. التجانس العينة resuspended مع التجانس Dounce الزجاج في 4 درجة مئوية أو إذا كان في درجة حرارة الغرفة تأكد من وضع على الجليد مباشرة بعد.
  3. نقل عينة إلى 50 مل من أنبوب البولي بروبلين وإضافة DDM وDDM إضافية العازلة A لتحقيق العينة إلى تركيز النهائي من 2٪ DDM.
  4. هز العينة لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية.
  5. تحميل العينة في أنابيب الطرد الفائق والطرد المركزي لمدة 1 ساعة في 4 °C و 150،000 x ز.
  6. بينما يتم تشغيل نموذج الطرد المركزي فائقة لإعداد 5 مل من العمود ني NTA عن طريق غسل مع 25 مل من DDM العازلة A(الجدول 1).
  7. بعد اكتمال الطرد الفائق، وجمع المغرور وتحميله على العمود 5 مل ني NTA في 4 درجة مئوية مع معدل تدفق 0.5 مل / دقيقة باستخدام مضخة حقنة.
  8. غسل خطوط FPLC مع ما يكفي من DDM المخزن المؤقت ب + 0.05٪ DDM(الجدول 1)لمسح النظام تماما ثم إرفاق العمود إلى الجهاز FPLC.
  9. غسل العمود مع 30 مل من DDM العازلة ب + 0.05٪ DDM مع معدل تدفق 1 مل / دقيقة وجمع تدفق من خلال.
  10. غسل العمود مع 30 مل من DDM العازلة C + 0.05٪ DDM(الجدول 1)مع معدل تدفق 1 مل / دقيقة وجمع تدفق من خلال.
  11. Elute البروتين مع 20 مل من DDM العازلة D + 0.05٪ DDM(الجدول 1)بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة وجمع تدفق من خلال استخدام جامع كسر والكسور التي يتم تعيين كل إلى 1.0 مل.
  12. حدد الكسور التي تحتوي على ذروة elution لتجميع والتركيز باستخدام تركيز الطرد المركزي والطرد المركزي في 4000 × ز و 4 درجة مئوية حتى تصل إلى 500 ميكرولتر.
  13. باستخدام حلقة 500 μL تحميل العينة في الجهاز FPLC ومن ثم على حجم 25 مل عمود الاستبعاد في 4 درجة مئوية. Elute باستخدام 30 مل من DDM العازلة E + 0.05٪ DDM(الجدول 1)بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة وجمع ككسور مع أحجام الكسور تعيين إلى أن تكون 0.5 مل لكل كسر.
  14. خذ الكسور و قم بقياس تركيز البروتين باستخدام امتصاص 280 نانومتر لتأكيد منحنى الأشعة فوق البنفسجية-فيس من الرسم البياني FPLC elution.
  15. جمع 20 ميكرولتر من كل كسر عينة التي تتوافق مع القمم لوحظت على الرسم البياني FPLC elution وتأكد أن تكون دقيقة مع اختبار الامتصاص.
  16. تجميد ما تبقى من تلك الكسور عينة باستخدام النيتروجين السائل أو الجليد الجاف في aliquots المطلوب وتخزين عينات البروتين في -80 درجة مئوية.
  17. تشغيل مقايسة كهرباء هلام SDS-PAGE كما هو موضح سابقا للتحقق من العينات التي تتوافق مع القمم التي لوحظت على الرسم البياني FPLC elution.

6. الإعداد السلبي شبكة وصمة عار

  1. ضع الشبكات التي سيتم استخدامها لإعداد العينة على شريحة زجاجية ملفوفة في ورق التصفية مع جانب الكربون الذي يواجه ما يصل.
  2. ضع الشريحة الزجاجية مع شبكات المجهر الإلكتروني في غرفة مُتفري التوهج بين القطبين واستبدل الغطاء الزجاجي مع التأكد من أن المركز ومغلق بشكل جيد.
  3. تشغيل آلة التفريغ توهج وتأكد من أن الضوء الأرجواني التي تولدها البلازما مرئية.
  4. عندما يتم تشغيل الجهاز، انتظر حتى وصلت الغرفة إلى الضغط الجوي لإزالة الغطاء الزجاجي ومن ثم إعادة الشريحة مع الشبكات إلى مقاعد البدلاء حيث سيتم تحميل العينات عليها.
  5. ضبط تركيز عينات البروتين المنقى إلى حوالي 0.1 ملغ / مل عن طريق إما تخفيف العينة مع المخزن المؤقت المناسب أو التركيز باستخدام مكثف الطرد المركزي.
  6. تحميل 3.5 ميكرولتر من عينة البروتين على شبكة الكربون سميكة 10 نانومتر وانتظر لمدة 1 دقيقة.
  7. إزالة السائل من سطح شبكة م مع ورقة مرشح.
  8. اغسل سطح الشبكة 3x عن طريق التقاط 3 ميكرولتر من قطرات الماء مع الشبكة وإزالة المياه من الشبكة بورق التصفية بين التقاط كل قطرة.
  9. غسل سطح الشبكة 2x عن طريق التقاط 3 ميكرولتر قطرات من الطازجة، تمت تصفيتها 2٪ خلات اليورانيوم وإزالة حلول الغسيل على الشبكة مع ورقة التصفية في ما بين التقاط كل قطرة.
  10. وصمة عار الشبكة مع 3 ميكرولتر قطرات من الطازجة، وتصفيتها 2٪ خلات اليورانيوم لمدة 1 دقيقة.
  11. إزالة محلول خلات اليورانيوم على سطح شبكة م مع ورقة فلتر والهواء الجافة الشبكة لمدة 1 دقيقة على الأقل.
  12. تخزين الشبكة في مربع شبكة للاستخدام لاحقاً.

7. التصوير EM

  1. قم بتحميل الشبكة المعدة إلى حامل الشبكة في منضدة آمنة.
  2. إعداد المجهر عن طريق وضع dewar المجاهر في مربع البوليسترين وملء ديوار 3/4th كامل من النيتروجين السائل.
  3. تأكد من أن الغطاء المطاطي من نافذة المجهر يغطيه ثم قم بتحميل ديوار على المجهر عن طريق وضع الأسلاك النحاسية في الوَرَد حتى تلائمه على المنصة.
  4. ملء ما تبقى من ديوار مع النيتروجين السائل ووضع سقف على رأس ديوار لتغطية ذلك.
  5. بدوره على التوتر العالي، شرط المجهر، وانتظر المجهر للاحماء وإنشاء مستوى فراغ آمن للاستخدام.
  6. مرة واحدة في المجهر هو استعداد فتح صمام العمود وتأكيد شعاع موجود عن طريق إزالة الغطاء المطاطي على نافذة المجهر.
  7. تحقق من وصمة شعاع عن طريق انتشار داخل وخارج عن طريق ضبط شدة الحزمة. إذا كان الاستجماتيزم موجوداً فإن الشعاع سيكون له شكل بيضاوي الشكل بينما يتحرك المرء بعيدًا عن العبور وينبغي أن يكون الشعاع هو نفس الشكل البيضاوي على كلا الجانبين.
  8. ضبط مناظير المجهر لتكون الارتفاع الصحيح والمسافة وفقا لعينات المراقب.
  9. تحقق من تحديد موضع شعاع للبحث، التركيز، وسائط التعرض عن طريق ركوب الدراجات من خلال جميع الأوضاع الثلاثة حتى شعاع هو مركز في كل.
  10. أغلق صمام العمود واشرع في تحميل حامل الشبكة في المجهر الإلكتروني.
  11. ضبط المجهر إلى ارتفاع eucentric باستخدام المجاهر متذبذب ميزة وضبط حركة المرحلة باستخدام Z-محور حتى لا يكون هناك حركة جنبا إلى جنب من العينة في المركز.
  12. باستخدام وضع البحث جرعة منخفضة على المجهر البحث الشبكة لمنطقة مرغوب فيه من الجزيئات معقولة مع عينة موجودة للتركيز على العينة.
  13. التركيز على العينة في وضع التركيز باستخدام حجم خطوة عالية حتى يتم مشاهدة العينة ثم قم بتقليل الخطوات للبحث عن مستوى التركيز الصحيح.
  14. صفر وفارغة شعاع ومن ثم تأكد من وسادة المطاط يغطي نافذة المجهر.
  15. باستخدام وضع التعرض تأخذ صورة منطقة الشبكة المطلوبة للتعرض 1 s في 62،000x التكبير والتحقق من الصورة التي تم الحصول عليها.
  16. عند الانتهاء من تصوير شبكة إغلاق صمامات العمود وإزالة حامل الشبكة من العمود.
  17. عند الانتهاء من تصوير جميع الشبكات من الفائدة اغلاق المجهر عن طريق إيقاف السلطة خيوط وإزالة ديوار النيتروجين السائل من المجهر.
  18. مكان شيء لامتصاص الرطوبة على المنصة حيث جلس ديوار للقبض على التكثيف من لفائف النحاس من المجهر.
  19. قم بتنشيط وضع دورة التبريد وتأكد من إيقاف تشغيل مضخة التوربو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام الإجراءات المعروضة هنا، تم تنقية عينات من نوع E. القولونية AcrB البرية و E. القولونية متحولة AcrB-P223G. ثم تم امتصاص العينات إلى شبكات المجهر الإلكتروني السلبي للصبغة الكربونية والملطخة باستخدام خلات أورانيل مع طريقة النشاف الجانبية22. تم جمع صور البقع السالبة باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال. صورة البقعة السلبية لعينة نوع AcrB البرية تنقيتها مع DDM يكشف عن حل متجانس من الجسيمات أحادية مع البروتين عرض هيكل ثلاثي البروتين المعري محددة جيدا (الشكل 1...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتين البروتين التفاعلات مهمة لسلامة هيكل ووظيفة البروتينات الغشاء. وقد تم تطوير العديد من النهج لدراسة التفاعلات البروتينية البروتينية. عند مقارنتها مع البروتينات القابلة للذوبان، البروتينات الغشائية و PPIs الخاصة بهم هي أكثر صعوبة في الدراسة بسبب الخصائص الجوهرية الفريدة للبروتينات الغشاء. هذه الصعوبة تأتي أساسا من شرط من البروتينات الغشاء لتكون جزءا لا يتجزأ في بيئة ثنائية الدهون الأصلية للاستقرار الهيكلية والوظائف. هذا يصبح إشكالية لأنه من أجل تحديد هياكل عالية الدقة من البروتينات يجب استخراجها من غشاء الخلية. وقد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم سرد Y.G كمخترع للغشاء النشط البوليمر NCMNP5-2 ونظام NCMN.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا البحث من قبل صندوق بدء العمل VCU (إلى Y.G.) والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R01GM132329 (إلى Y.G.) والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. ونشكر مونتسيرات سامسو وكيفن ماك روبرتس على دعمهما السخي لتسجيل الفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > مواد كيميائية < / قوي >
30٪ أكريلاميد / BIS SOL (37.5: 1)Bio-Rad161-0158
4x Laemmli عينة عازلة (عازلة تحميل)Bio-Rad1610747
حمض الخليك الجليديThermoFisher ScientificA38S-212
بيرسلفات الأمونيوم (APS)Bio-Rad161-0700
صبغة البروتين ChloramphenicolGoldbioC-105-5
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad161-0400
DTT (Dithiothreitol) (> 99٪ نقي) خالي من البروتيازGoldbioDTT10
GlycerolThermoFisher ScientificG33-4
HEPESThermoFisher ScientificBP310-1
إيميدازولأفيميتريكس17525 1 كجم
IPTGGoldbioI2481C100
كاناميسينجولدبيوK-120-25
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتثيرموفيشر AA3622636
الميثانولثيرموفيشر العلميA412-4
N ، N-dimethylethylenediamine (EDTA)Merck8.03779.0100
NCMNS-P5-2غير متوفر تجاريا حتى الآنتقديم طلب للحصول على المؤلف
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم)Bio-Rad161-0301
SMA2000Cray Valleyتقديم طلب للحصول على المؤلف
كلوريد الصوديومThermoFisher ScientificS271-10
TCEP-HClGoldbioTCEP25
TEMEDBio-Rad161-0800
Terrific Broth MediaAffymetrix75856 1 كجم
تريس بيسبيو راد161-0719
أسيتات اليورانيلأمبينترAmb22348393
<قوي> المعدات< / قوي>
أفانتي J-26S XPIبيكمان كولترB14538
أفانتي JXN-30بيكمان كولترB34193
شبكات مجهر إلكتروني الكربون (10 نانومتر)علوم المجهر الإلكترونيCF300-Cu-TH
خالط الأنسجة المخدعEberbachE7265
Corning LSE Mini MicrocentrifugeThermoFisher Scientific07-203-954
EmulsiFlex-C3Avestin
Fraction Collector F9-RGE Healthcare LifeSciences 29003875
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresle CellBio-Rad165-8004
NanoDrop 2000 مقياس الطيفالضوئي ThermoFisher ScientificND-2000
Optima L-90K جهاز طرد مركزي فائقبيكمان كولترPN LL-IM-12AB
PELCO easiنظام تنظيف تفريغ التوهجالمتوهج تيد بيلا91000S-230
بوتر إلفيهجم مطحنة مناديل مطحنة مناديلآمنة Wheaton358013
PowerPac مصدر الطاقة الأساسيBio-Rad164-5050
Razel R99-E مضخة حقنةمتغيرة السرعةRazel Scientific Instruments
Superdex 200 زيادة 10/300 GLGE Healthcare LifeSciences 28990944
Tecnai F20 200kVFEI
Type 70 Ti دوار بزاويةثابتة بيكمان كولتر
< قوي > مواد عامة < / قوي >
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيق ThermoFisher Scientific05-408-129
4 مل Amicon Ultra-4 30 kDaMillipore SigmaUFC803024
AKTA pure 25 L1 FPLCGE Healthcare Life Sciences29018225
BL21 (DE3) PLysS CellsThermoFisher ScientificC606003
Falcon 50 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطيThermoFisher Scientific14-959-49A
HisTrap HP 5 مل عمودGE Healthcare LifeSciences 17524802
pET-24aEMD Biosciences69749-3
مسحوق المراسل المراسل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  2. Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
  3. Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
  4. Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
  5. Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
  6. Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
  7. Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
  8. Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50(2009).
  9. Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
  10. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
  11. Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
  12. Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
  13. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  14. Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
  15. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
  16. Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390(2011).
  17. Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
  18. Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
  19. Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
  20. Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
  21. Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
  22. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199(2018).
  23. Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
  24. Lebon, G. Structure and Function of GPCRs. , Springer International Publishing. 229-230 (2019).
  25. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087(2014).
  26. Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
  27. Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
  28. Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Membrane Protein InteractionsElectron Microscopy AnalysisOligomeric State DeterminationMembrane Active PolymerNickel NTA ChromatographyNegative Stain GridsSize Exclusion ChromatographySDS PAGE AnalysisCryo Electron Microscopy

مقالات ذات صلة