يقدم هنا بروتوكول محدد كيميائيا اشتات خلايا الكلى البشرية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ذات الكفاءة العالية (>90٪) ومستقلة عن التلاعب الجيني أو اختيار السكان الفرعيين. ينتج هذا البروتوكول نوع الخلية المطلوب في غضون 26 يوما ويمكن أن يكون مفيدا لاختبار السمية الكلوية ونمذجة المرض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التمايز الموجه لخلايا بودوسيت الكلى الناضجة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان في ظل ظروف محددة كيميائيا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أمراض الكلى تؤثر على أكثر من 10٪ من سكان العالم ويكلف مليارات الدولارات في النفقات الاتحادية. غالبا ما تحدث أشد أشكال أمراض الكلى والفشل الكلوي في المرحلة النهائية بسبب الأضرار التي لحقت بالخلايا الكبيبية ، وهي الخلايا الظهارية المتخصصة للغاية التي تعمل جنبا إلى جنب مع الخلايا البطانية وغشاء الطابق السفلي الكبيبي لتشكيل حاجز ترشيح الكلى. وقد أعاقت التقدم في الطب الكلوي بسبب محدودية توافر الأنسجة الأولية وعدم وجود طرق قوية لاستخلاص خلايا الكلى البشرية الوظيفية، مثل podocytes. ويمكن أن تساعد القدرة على اشتقاق الخلايا الجذعية من مصادر متجددة، مثل الخلايا الجذعية، على تعزيز الفهم الحالي لآليات نمو الكلى البشرية والمرض، فضلا عن توفير أدوات جديدة للاكتشاف العلاجي. كان الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة لاشتقاق الخلايا الجذعية الناضجة بعد الميتوتية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا بكفاءة عالية وخصوصية عالية ، وفي ظل ظروف محددة كيميائيا. الخلايا المشتقة من الخلايا hiPS التي تنتجها هذه الطريقة تعبر عن علامات النسب محددة (بما في ذلك الكليفرين، بودوسين، والورم ويلم 1) ويحمل الخصائص المورفولوجية المتخصصة (بما في ذلك عمليات القدم الأولية والثانوية) المرتبطة podocytes ناضجة والوظيفية. ومن المثير للاهتمام أن هذه الميزات المتخصصة غائبة بشكل ملحوظ في خط خلايا البودوسيت الخالد المستخدم على نطاق واسع في هذا المجال ، مما يشير إلى أن البروتوكول الموصوف هنا ينتج خلايا الكلى البشرية التي لها نمط الظاهري أكثر نضجا من خطوط خلايا podocyte الموجودة المستخدمة عادة لدراسة بيولوجيا الكلى البشرية.
المقدمة
ومن المتوقع أن يؤدي التقدم في زراعة الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات إلى إحداث ثورة في الطب التجديدي، ونمذجة الأمراض، وفحص الأدوية من خلال تزويد الباحثين بمصدر متجدد وقابل للتطوير للمواد البيولوجية التي يمكن هندستها للحصول على أي نوع من الخلايا تقريبا داخل جسم الإنسان1. هذه الاستراتيجية مفيدة بشكل خاص لاستخلاص أنواع الخلايا المتخصصة والوظيفية التي سيكون من الصعب الحصول عليها. الإنسان المستحثة متعدد القدرات الجذعية (hiPS) خلايا2،3،4،5 جذابة بشكل خاص بسبب أصل الخلايا الجسدية والإمكانات التي تمثلها للطب الشخصي. ومع ذلك، تطوير أساليب لاشتقاق أنساب الخلايا الأخرى من خلايا hiPS لا تزال صعبة بسبب الاستخدام المتكرر لظروف الثقافة سيئة التحديد مما يؤدي إلى انخفاض الكفاءة وتوليد غير محددة من مجموعات الخلايا غير المتجانسة6،7.
هنا هو وسيلة لاستخلاص podocytes الكلى ناضجة من خلايا hiPS مع خصوصية وكفاءة عالية في ظل ظروف محددة كيميائيا. من خلال النظر في أدوار عوامل متعددة داخل البيئة الخلوية الدقيقة ، تم تطوير استراتيجية تمايز الخلايا الجذعية التي تنطوي على تحسين العوامل القابلة للذوبان المقدمة في وسط ثقافة الخلية وكذلك العوامل غير القابلة للحل ، مثل مكونات المصفوفة خارج الخلية أو الركائز اللاصقة. ونظرا لأهمية إشارات integrin في تطوير podocyte ووظيفة، تم فحص التعبير عن مستقبلات integrin على سطح الخلية في البداية. β1 integrins وأعرب عنه للغاية ليس فقط في خلايا hiPS، ولكن أيضا في مشتقاتها بما في ذلك mesoderm والمتوسطة mesoderm الخلايا8،9،10. أكدت التجارب اللاحقة أن الليغندس التي ترتبط ب β1 integrins (بما في ذلك اللامينين 511 أو جزء laminin 511-E8) تدعم التصاق وتمايز خلايا hiPS إلى خلايا بودسيتس عند استخدامها بالتزامن مع الوسائط الاستقرائية القابلة للذوبان الموضحة أدناه.
بدأ تحريض التزام نسب الخلية من خلال التأكيد أولا على أن خلايا hiPS المستزرعة على الأسطح المغلفة باللمينين لمدة يومين في وجود وسيط يحتوي على Activin A وCHIR99021 وY27632 يمكن أن يفرق مثبط Rock إلى خلايا تعبر عن علامات mesoderm المبكرة HAND1 وgoosecoid وbrachyury8و11. علاج خلايا mesoderm لمدة 14 يوما مع المتوسطة تستكمل مع البروتين مورفوجيني العظام 7 (BMP-7) وCHIR99021 مكن اشتقاق الخلايا المتوسطة المتوسطة التي أعربت عن علامات الخلية nephron السلف ورم ويلم 1 (WT1), الغريب تخطي البروتين ذات الصلة 1 (OSR1)8,11, ويقترن مربع جين 2 البروتين (PAX2)12. لاشتقاق الخلايا الكبيبية الكلى ناضجة، عولجت الخلايا المتوسطة لمدة 4-5 أيام مع وسيطة جديدة تتكون من BMP-7، أكتيفين A، عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)، جميع حمض الريتينويكعبر، وCHIR99021. تم استخدام قياس التدفق الخلوي والتلطخ المناعي للتأكد من أن >90٪ من الخلايا الناتجة أظهرت الخصائص الجزيئية والمورفولوجية والوظيفية لخلايا الكلى الناضجة8و11و13. وتشمل هذه الخصائص تطوير عمليات القدم الأولية والثانوية؛ التعبير عن الجينات podocyte النسب محددة بما في ذلك SYNPO، PODXL، MAF، EFNB28 والتعبير عن البروتينات بما في ذلك بودوسين، النيفرين، وWT114،15،16. بالإضافة إلى ذلك ، وجد أنه يمكن الحفاظ على الخلايا المشتقة من hiPS في الثقافة لمدة تصل إلى أربعة أسابيع في المختبر باستخدام وسيط متاح تجاريا8،11 مما يوفر مرونة إضافية في توقيت تجارب المصب. لمزيد من المعلومات حول لوحات قياس التدفق الخلوي المستخدمة لتحديد نقاء hiPS-podocytes، يرجى الرجوع إلى منشورنا السابق11.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف
- تمييع thawed 5x hiPS الخلية الثقافة وسائل الإعلام (CCM) الملحق في hiPS الخلية ثقافة المتوسط القاعدي للحصول على حل 1x من HIPS CCM.
ملاحظة: المجمدة 5x hiPS CCM الملحق يتطلب عملية ذوبان بطيئة, من الناحية المثالية في 4 °C لليلة واحدة. يمكن تخزين الاقتباسات من 1x hiPS CCM لمدة تصل إلى 6 أشهر عند -20 درجة مئوية. - إعداد مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BM) 1-المغلفة لوحات لثقافة الخلية hiPS: Thaw BM مصفوفة 1 بين عشية وضحاها على الجليد في 4 °C. مرة واحدة إذابة، وإعداد aliquots مع عوامل التخفيف المناسبة كما اقترح من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: عادة، يتم إعداد aliquots لتخفيف لاحقة في 25 مل من DMEM/F12 الباردة في أنبوب مخروطي 50 مل تليها خلط شامل لإذابة تماما مصفوفة BM 1 وتجنب تشكيل بلورات المتبقية. - نقل 1 مل من BM مصفوفة 1 حل لكل بئر من لوحة بئر 6 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة أو في 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة، ملفوفة في فيلم البارافين. يمكن تخزين مصفوفة BM 1 -المغلفة لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
- إعداد مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BM) 2 - لوحات مغلفة: تمييع الكميات المناسبة من مصفوفة BM 2 في 9 مل من الماء المقطر العقيم لإعداد تركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل. إضافة 700 ميكرولتر من BM مصفوفة 2 حل لكل بئر من لوحة بئر 12 واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- إعداد حلول الأسهم 100 ميكروغرام / مل كل من BMP7، Activin A، و VEGF على النحو التالي: إعادة تشكيل BMP7 في الماء المقطر العقيمة التي تحتوي على 0.1٪ (wt/vol) BSA وإعادة تشكيل Activin A و VEGF بشكل منفصل في برنامج تلفزيوني معقم يحتوي على 0.1٪ (wt/vol) BSA. لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة، قم بإعداد 100 ميكرولتر من كل محلول مخزون وتخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- إعداد محلول مخزون 10 mM من Y27632 عن طريق حل 10 ملغ من Y27632 في 3.079 مل من الماء المقطر العقيم. Aliquot 100 ميكرولتر من المخزون وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
- حل 2 ملغ من CHIR99021 في 143.4 ميكرولتر من DMSO المعقمة لإعداد محلول الأسهم 30 mM. إعداد 5 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر (أو وفقا لتوصية الشركة المصنعة).
- حل 10 ملغ من حمض الريتينويكعبر جميع في 3.33 مل DMSO المعقمة. إعداد 500 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. إعداد وسائل الإعلام الثقافية
- إعداد المتوسطة التمايز mesoderm عن طريق إعادة تشكيل حلول الأسهم المقابلة لتركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل أكتيفين A, 3 μM CHIR99021, 10 ميكرومتر Y27632, و1x B27 تكملة خالية من المصل في حجم مناسب من DMEM/12 مع ملحق الجلوتامين.
ملاحظة: يجب أن تكون متوسطة التمايز mesoderm معدة حديثا قبل خطوات التمايز وفي حجم مناسب لحجم التجربة (عادة ، 50 مل من المتوسطة كافية لاثنين من لوحات الآبار 12). - إعداد المتوسطة المتوسطة التمايز mesoderm عن طريق إعادة تشكيل حلول الأسهم المقابلة لتركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل BMP7, 3 μM CHIR99021, و1x B27 تكملة خالية من المصل في DMEM/F12 مع ملحق الجلوتامين.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن تستكمل المتوسطة مع 1٪ (فول / فول) البنسلين-ستريبتوميسين. ضبط حجم المتوسط باستخدام DMEM/F12 مع الملحق الجلوتامين. يمكن إعداد هذه الوسيطة على دفعات كبيرة؛ ومع ذلك، فمن المستحسن لتخزين في aliquots أصغر (على سبيل المثال، 45 مل في أنابيب مخروطية 50 مل) لتجنب تكرار تجميد ذوبان الدورات. يمكن تخزين هذه الوسائط عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر ويمكن إذابتها عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل الاستخدام. - إعداد وسيط تحريض podocyte عن طريق إعادة تشكيل إلى تركيز النهائي 100 نانوغرام / مل BMP7، 100 نانوغرام/مل أكتيفين A، 50 نانوغرام/مل VEGF، 3 ميكرومتر CHIR99021، ملحق خال من مصل B27 1x، و0.1 ميكرومتر حمض الريتينويك المتحول بالكامل في DMEM/F12 مع ملحق الجلوتامين. حماية متوسطة من الضوء (على سبيل المثال، عن طريق التفاف الحاوية بورق احباط).
ملاحظة: يمكن إعداد هذه الوسيلة على دفعات كبيرة وتخزينها في الظلام عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. يجب إذابة المغذيات المجمدة بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية قبل الاستخدام. - إعداد 25 مل من حل تحييد التريبسين بإضافة 10٪ (vol/vol) الحرارة المعطل FBS في DMEM/F12 ومرشح في ظل ظروف معقمة.
- لصيانة ما بعد التمايز من podocytes المستمدة من الخلايا الجذعية، وإعداد المتوسطة كاملة مع وسائط الصيانة podocyte بإضافة الملحق إلى الوسط القاعدي وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة، وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
3. المغذية خالية hiPS ثقافة الخلية باستخدام hiPS خلية الثقافة المتوسطة
- يستنشق الحل المتبقي من مصفوفة BM 1 من الصفائح المغلفة مسبقا ويغسل الآبار 3 مرات مع 1 إلى 2 مل من DMEM/F12 الدافئ.
- قضى أسبيرات HIPS CCM من خلايا hiPS وشطف الخلايا 3 مرات مع DMEM/F12 الدافئة. أضف 1 مل من محلول مفرزة الخلايا الدافئة واحتضن لمدة دقيقة واحدة عند 37 درجة مئوية للمساعدة في فصل الخلايا. إجراء الفحص البصري للخلايا تحت مجهر زراعة الأنسجة والتأكد من أن حواف مستعمرات الخلية تبدو مستديرة ، ثم تستنشق بسرعة محلول انفصال الخلية عن الخلايا (ضمان أن مستعمرات الخلية لا تزال متصلة بالطبق ، وإن كان بشكل فضفاض). شطف الخلايا بلطف مرة واحدة مع DMEM/F12 لإزالة محلول مفرزة الخلية.
- إضافة 3 مل من HIPS CCM إلى خلايا hiPS (في كل بئر من لوحة 6-جيدا) التي تم علاجها مع حل مفرزة الخلية. كشط المستعمرات باستخدام رافع الخلية، وتعليق الخلية ماصة بلطف صعودا وهبوطا لطرد الخلايا التمسك فضفاضة. غسل لوحة جيدا لضمان حصاد جميع الخلايا.
ملاحظة: ينصح باستخدام ماصة 5 مل لتجنب القص الزائد على الخلايا. - نقل 0.5 مل من تعليق الخلية في كل بئر من مصفوفة BM جديدة 1 المغلفة 6-جيدا لوحة تحتوي على 2 مل من CCM hiPS لكل بئر. نقل لوحة في الشكل ثمانية أزياء لتوزيع مستعمرات الخلايا داخل الآبار واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO2. تحديث متوسط يوميا حتى تكون الخلايا جاهزة للمرور أو استخدامها لتجربة التمايز (حوالي 70 ٪ التقاء).
ملاحظة: حجم مستعمرة مثالية لتمرير الروتينية من iPSCs بين 200-500 ميكرومتر تحت ظروف التغذية الحرة باستخدام HIPS CCM (دون مثبط ROCK). إذا تم تفرد الخلايا أثناء العلاج بإنزيمات أو مخازن فصام، يمكن استكمال HIPS CCM بمثبط ROCK (على سبيل المثال، 10 ميكرومتر Y27632) لتحسين صلاحية الخلية.
4. تمايز خلايا hiPS في خلايا mesoderm (أيام 0-2)
- في حين أن ثقافات خلايا hiPS في مرحلة النمو الأسي (تقريبا في غضون 4 أيام من الثقافة بعد التمرير ، وحوالي 70٪ التقاء) ، تفقد بصريا لوجود خلايا متمايزة تلقائيا داخل وحول حواف المستعمرات. إذا لزم الأمر، كشط بشكل مطهر قبالة مناطق التمايز.
- أسبيرات HIPS CCM من خلايا hiPS وشطف الخلايا 3 مرات مع DMEM/F12 الدافئة. احتضان الخلايا مع 1 مل من العازلة فصيلة الخلايا الخالية من الانزيم لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية والتحقق من الانفصال تحت المجهر. بسبب الاختلافات المتأصلة بين خطوط الخلية hiPS مختلفة، يجب تحديد وقت الحضانة الفعلي لحاجز فصافر الخلية لخط الخلية معين.
- كشط بلطف البئر مع رافع الخلية لطرد الخلايا المرتبطة فضفاضة ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل، تليها pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات لفرد خلايا hiPS.
- جلب تعليق الخلية إلى حجم 15 مل مع DMEM/F12 الدافئة والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 290 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- يستنشق بلطف supernatant وإعادة تثبيت الخلايا مع DMEM/F12 دافئة لجولة أخرى من الطرد المركزي لإزالة المتبقية مصفوفة BM 1 ومكونات العازلة التفكك.
- أسبيرات الخلايا الفائقة وإعادة الإنفاق في 1 مل من المتوسط التعريفي mesoderm كما هو موضح في أعلاه. عد العدد الإجمالي للخلايا باستخدام عداد الخلايا الهيموسيط أو كولتر لتحديد الحجم المناسب من المتوسط التمايز mesoderm اللازمة لتحقيق تركيز 1 × 105 خلايا / مل.
- أسبيرات ECM الحل من مصفوفة BM 2 المغلفة لوحات وشطف لوحات مرتين مع DMEM/F12 الحارة. خلط تعليق الخلية hiPS بلطف عن طريق pipetting عدة مرات. نقل 1 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من مصفوفة BM 2 المغلفة 12-جيدا لوحات ومن ثم يهز بلطف لوحات لتوزيع الخلايا بشكل أكثر بالتساوي.
- احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪. تحديث المتوسطة التعريفي mesoderm في اليوم التالي.
ملاحظة: بعد 2 أيام، خلايا mesoderm المشتقة من الخلية hiPS ستكون جاهزة للتحريض المتوسط mesoderm.
5. التمايز من خلايا mesoderm hiPS المستمدة من الخلية إلى mesoderm المتوسطة (أيام 2-16)
- في اليوم 2 من بروتوكول التمايز، يستنشق المتوسط التعريفي ميسودرم وتجديد مع 1 مل لكل المتوسطة المتوسطة جيدا المتوسطة التعريفي mesoderm.
- تحديث المتوسطة كل يوم للحفاظ على عتبة دقيقة من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة للخلايا النشطة الأيضية. إذا كان هناك نمو كبير في الخلايا والاستنفاد السريع لمغذيات الوسائط (المشار إليها باصفرار الوسائط) ، يمكن زيادة حجم وسيط التمايز المتوسط المتوسط إلى 1.3 مل لكل بئر من لوحات الآبار ال 12.
- خلايا الثقافة لمدة 14 يوما إضافية للحصول على خلايا mesoderm المتوسطة. بحلول اليوم 16، يمكن لهذه الخلايا أن تكون cryopreserved لاستخدامها في وقت لاحق.
6. التفريق بين خلايا الوسيطة المشتقة من الخلايا hiPS إلى خلايا بودوسيتي (أيام 16 إلى 21)
- شطف الخلايا المتوسطة mesoderm مع DMEM/F12 الحارة تليها حضانة الخلايا مع 0.5 مل لكل بئر من 0.05 ٪ تريبسين-EDTA لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية. إجراء الفحص البصري للتأكد من أن الخلايا بدأت في الانفصال.
- كشط الخلايا باستخدام رافع الخلية وماصة تعليق الخلية عدة مرات باستخدام تلميح ماصة 1000 ميكرولتر للحصول على خلايا فردية (أو كتل صغيرة من).
ملاحظة: في هذه المرحلة، تأكد من أن الخلايا فصل تماما كخلايا مجمعة قد تفشل في الحصول على النمط الظاهري المميز بشكل نهائي ضمن الجدول الزمني للبروتوكول. - إضافة حوالي 2 مل لكل بئر من حل تحييد التريبسين لوقف نشاط التريبسين.
- نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل وبذلك يصل حجم إلى 50 مل باستخدام DMEM/F12، ومن ثم الطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 201 × ز في درجة حرارة الغرفة.
- يستنشق الخلايا الفائقة وإعادة الإنفاق في وسيط تحريض podocyte. للحصول على أفضل النتائج، تأكد من كثافة البذر النهائية التي تبلغ حوالي 100,000 خلية/بئر من لوحة بئر 12. أضف تعليق الخلية إلى مصفوفة BM 2-المغلفة لوحات وهز بلطف لوحة للمساعدة في توزيع الخلايا بشكل أكثر بالتساوي.
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 وتحديث المتوسطة يوميا لمدة تصل إلى 5 أيام للحصول على podocytes بحلول اليوم 21.
ملاحظة: يمكن الحفاظ على الخلايا المشتقة من خلايا hiPS الناتجة في الثقافة لمدة 2-4 أسابيع إضافية باستخدام وسيط كامل مع وسائط صيانة podocyte. مرة واحدة في وسائط الصيانة podocyte، يمكن تغذية الخلايا كل يومين، ويمكن استخدامها للدراسات اللاحقة أو التحليلات المصب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كان الهدف من هذا البروتوكول هو إثبات أن الخلايا البشرية الناضجة يمكن اشتقاقها من خلايا hiPS في ظل ظروف محددة كيميائيا. تم إنشاء البيانات المعروضة في هذه المخطوطة باستخدام خط الخلية17من DU11 hiPS ، والتي تم اختبارها لأول مرة ، ووجدت أنها خالية من الميكوبلازما. كما تم إجراء تحليل كروموسومي، وتبين أن الخلايا طبيعية بشكل كاريوتيبيكي. بدءا من خلايا DU11 hiPS غير المتمايزة، استراتيجية التمايز (الشكل 1) المبينة في هذا التقرير تم استخدامها للتمييز أولا الخلايا الجذعية (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا التقرير، ونحن نصف بروتوكول لتوليد الخلايا الكبيبية الكلى من خلايا hiPS. وs podocytes hiPS المستمدة من الخلية معرض السمات المورفولوجية والجزيئية المرتبطة بالنمط الظاهري podocyte الكلي ناضجة13. في المنشورات السابقة، أظهرنا أن الخلايا البودوسيات المشتقة من خلية hiPS يمكن أن تحاكي بنية ووظيفة الترشيح الانتقائية لكبيبي الكلى عندما تشارك في زراعة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الكبيبية في جهاز الفلوريد الدقيق القابل للتشويه على رقاقة8،11
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
S.M. هو مؤلف على براءة اختراع معلقة لأساليب توليد podocytes الكلى من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (طلب براءة الاختراع في الولايات المتحدة 14/950859). ويعلن المؤلفون الباقون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل كلية برات للهندسة في جامعة ديوك، وشعبة أمراض الكلى في كلية الطب ديوك، وجائزة أبحاث كرسي من قسم الطب في جامعة ديوك، وجائزة مخصصة الانتقال الوظيفي PDEP صندوق بوروز ويلكوم لS.M.. M.B تحظى بدعم برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم. نشكر مختبر بورساك على تزويدنا بسخاء بخط الخلايا الجذعية DU11، ومختبر فارغيز في جامعة ديوك لمشاركته مؤقتا منشأة زراعة الأنسجة الخاصة بهم مع مجموعتنا. هذا المنشور مخصص للبروفيسورة لورا ل. كيسلينغ، أستاذة الكيمياء في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، احتفالا بعيدميلادها الستين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية>Cells | |||
| DU11 خلايا | تم إنشاء خط خلايا iPS DU11 (استنساخ جامعة ديوك # 11) في مرفق iPSC الأساسي بجامعة ديوك وقدمه لنا مختبر Bursac في جامعة ديوك. تم اختبار هذا الخط بحثا عن الميكوبلازما وتم آخر تنويط في يوليو 2019 من قبل مختبرنا ، ووجد أنه طبيعي في النمط النووي. | ||
| <قوي > عوامل النمو ومكملات الوسائط < / قوي > | |||
| حمض الريتينويك المتحول بالكامل (500 مجم) | 72262 | مكمل غذائي | |
| خال من المصل B27 | 17504044 | Thermo / Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | قد يظهر Stemgent | تباينا |
| مجموعة كاملة متوسطة مع CultureBoost-R | 4Z0-500-R | أنظمة الخلايا وسائط | صيانة الخلايا البودوية |
| DMEM / F12 | 12634028 | Thermo / Life Technologies | |
| DMEM / F12 مع مكمل GlutaMAX | 10565042 | Thermo / Life Technologies | DMEM / F12 مع مكمل الجلوتامين |
| FBS المعطلة | بالحرارة 10082147 | Thermo / Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo / Life تقنيات | |
| Human BMP7 | PHC9544 | تقنيات الحرارة / الحياة البشرية | |
| VEGF | PHC9394 | تقنيات | |
| mTeSR1 متوسط | 05850 | تقنيات الخلايا الجذعية وسائط | زراعة الخلايا hiPS (CCM) |
| البنسلين & ndash ؛ الستربتومايسين ، سائل (100 مرة؛) | 15140-163 | Thermo / Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| < قوي > الأجسام المضادة < / قوي > | |||
| Alexa Fluor 488 & ndash ؛ و Alexa Fluor 594 & ndash ؛ الأجسام المضادة الثانوية المترافقة | A32744 ؛ أ 32754 ؛ أ -11076 ؛ A32790 | Thermo / Life Technologies | |
| Brachyury (T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R & D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| <قوية > جزيئات ECM < / قوية > | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) جزء | N-892012 | Iwai | أمريكا الشمالية الغشاء القاعدي (BM) مصفوفة 2 |
| مصفوفة مؤهلة من Matrigel hESC ، قارورة 5 مل | 354277 | BD | مصفوفة الغشاء القاعدي للعلوم البيولوجية (BM) 1. قد يظهر تباينا من الكثير إلى الدفعة |
| < قوي > الإنزيمات والكواشف الأخرى < / قوي > | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo / Life | Technologies حل انفصال الخلية |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO سام. يجب التعامل معها في غطاء السلامة |
| الكيميائية المخزن المؤقت لتفكك الخلايا الخالي من الإنزيم ، هانك s الملح المتوازن | 13150016 | الإيثانول الحرارية / Life Technologies | |
| ، 70٪ (vol / vol) ، درجة التكنولوجيا الحيوية | 97065-058 | VWR | الإيثانول قابل للاشتعال وسام |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo / Life Technologies | يجب التعامل مع PFA في غطاء دخان كيميائي مع معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر ونظارات العين الآمنة. تجنب الاستنشاق والتلامس مع الجلد. |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | 14190-250 | تقنيات الحرارة / الحياة | |
| الماء المقطر المعقم | 15230162 | تقنيات الحرارة / الحياة Triton | |
| X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA ، 0.05٪ | 25300-120 | Thermo / Life Technologies | |
| < قوي > معدات < / قوي> | |||
| ماصات الشفط ، ملفوفة بشكل فردي | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R جهاز طرد مركزي | B99516 | بيكمان كولتر | |
| مخروطي 352097 | 15 مل | Corning | |
| ، 50 مل | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo / Life Technologies | لتخزين المجمدة aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo / Life Technologies | المجهر الفلورسنتي يستخدم للحصول على صور لخلايا iPS الثابتة والملطخة ومشتقاتها |
| مقياس الدم | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i حاضنة CO2 | 51030403 | تقنيات Thermo / Life | للثقافة الروتينية وصيانة خلايا iPS ومشتقاتها |
| مقلوب Zeiss Axio Observer مجهز بكاميرا AxioCam 503 | 491916-0001-000 (مجهر) ؛ 426558-0000-000 (كاميرا) | زايس المجهر | يستخدم للحصول على صور تباين الطور لخلايا iPS الحية ومشتقاتها في كل مرحلة من مراحل تمايز الخلايا البودوسياتي |
| قفازات النتريل كيمبرلي كلارك | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes ، كبير | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes ، صغير | 21905-026 | VWR | |
| P10 نصائح ماصة حاجز الدقة | P1096-FR | حاجز Denville Scientific | |
| P100 | P1125 | أطراف ماصة حاجز Denville Scientific | |
| P1000 | P1126 | حاجز Denville Scientific | |
| P20 | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 نصائح | ماصة حاجزP1122 | دينفيل Scientific | |
| Serological ، 10 مل ، ملفوفة بشكل فردي | 356551 | Corning | |
| المصلية ، 25 مل ، ملفوفة بشكل فردي | 356525 | Corning | |
| Serological ، 5 مل ، ملفوفة بشكل فردي | 356543 | Corning | |
| Steriflip ، 0.22 مو ؛ م ، PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة | 1138W14 | Thomas Scientific | لنقل عوامل النمو |
| ثقافة الأنسجة &ndash ؛ معالجة 12 بئر لوحات | 353043 | Corning | |
| Tissue Culture & ndash ؛ ألواح سداسية الآبار المعالجة | 353046 | Corning | |
| VWR معطف مختبر techuni أبيض | 10141-342 | VWR | |
| رافع خلية مشطوف عريض | 3008 | كورنينج |
المراجع
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145(1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069(2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825(2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R. Wntβ-Catenin Signaling and Disease. Cell. 149, 1192-1205 (2012).
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
