يقدم هنا بروتوكول محدد كيميائيا اشتات خلايا الكلى البشرية من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ذات الكفاءة العالية (>90٪) ومستقلة عن التلاعب الجيني أو اختيار السكان الفرعيين. ينتج هذا البروتوكول نوع الخلية المطلوب في غضون 26 يوما ويمكن أن يكون مفيدا لاختبار السمية الكلوية ونمذجة المرض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التمايز الموجه لخلايا بودوسيت الكلى الناضجة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان في ظل ظروف محددة كيميائيا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أمراض الكلى تؤثر على أكثر من 10٪ من سكان العالم ويكلف مليارات الدولارات في النفقات الاتحادية. غالبا ما تحدث أشد أشكال أمراض الكلى والفشل الكلوي في المرحلة النهائية بسبب الأضرار التي لحقت بالخلايا الكبيبية ، وهي الخلايا الظهارية المتخصصة للغاية التي تعمل جنبا إلى جنب مع الخلايا البطانية وغشاء الطابق السفلي الكبيبي لتشكيل حاجز ترشيح الكلى. وقد أعاقت التقدم في الطب الكلوي بسبب محدودية توافر الأنسجة الأولية وعدم وجود طرق قوية لاستخلاص خلايا الكلى البشرية الوظيفية، مثل podocytes. ويمكن أن تساعد القدرة على اشتقاق الخلايا الجذعية من مصادر متجددة، مثل الخلايا الجذعية، على تعزيز الفهم الحالي لآليات نمو الكلى البشرية والمرض، فضلا عن توفير أدوات جديدة للاكتشاف العلاجي. كان الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة لاشتقاق الخلايا الجذعية الناضجة بعد الميتوتية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا بكفاءة عالية وخصوصية عالية ، وفي ظل ظروف محددة كيميائيا. الخلايا المشتقة من الخلايا hiPS التي تنتجها هذه الطريقة تعبر عن علامات النسب محددة (بما في ذلك الكليفرين، بودوسين، والورم ويلم 1) ويحمل الخصائص المورفولوجية المتخصصة (بما في ذلك عمليات القدم الأولية والثانوية) المرتبطة podocytes ناضجة والوظيفية. ومن المثير للاهتمام أن هذه الميزات المتخصصة غائبة بشكل ملحوظ في خط خلايا البودوسيت الخالد المستخدم على نطاق واسع في هذا المجال ، مما يشير إلى أن البروتوكول الموصوف هنا ينتج خلايا الكلى البشرية التي لها نمط الظاهري أكثر نضجا من خطوط خلايا podocyte الموجودة المستخدمة عادة لدراسة بيولوجيا الكلى البشرية.
المقدمة
ومن المتوقع أن يؤدي التقدم في زراعة الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات إلى إحداث ثورة في الطب التجديدي، ونمذجة الأمراض، وفحص الأدوية من خلال تزويد الباحثين بمصدر متجدد وقابل للتطوير للمواد البيولوجية التي يمكن هندستها للحصول على أي نوع من الخلايا تقريبا داخل جسم الإنسان1. هذه الاستراتيجية مفيدة بشكل خاص لاستخلاص أنواع الخلايا المتخصصة والوظيفية التي سيكون من الصعب الحصول عليها. الإنسان المستحثة متعدد القدرات الجذعية (hiPS) خلايا2،3،4،5 جذابة بشكل خاص بسبب أصل الخلايا الجسدية والإمكانات التي تمثلها للطب الشخصي. و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف
- تمييع thawed 5x hiPS الخلية الثقافة وسائل الإعلام (CCM) الملحق في hiPS الخلية ثقافة المتوسط القاعدي للحصول على حل 1x من HIPS CCM.
ملاحظة: المجمدة 5x hiPS CCM الملحق يتطلب عملية ذوبان بطيئة, من الناحية المثالية في 4 °C لليلة واحدة. يمكن تخزين الاقتباسات من 1x hiPS CCM لمدة تصل إلى 6 أشهر عند -20 درجة مئوية. - إعداد مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BM) 1-المغلفة لوحات لثقافة الخلية hiPS: Thaw BM مصفوفة 1 بين عشية وضحاها على الجليد في 4 °C. مرة واحدة إذابة، وإعداد aliquots مع عوامل التخفيف المناسبة كما اقترح من قبل الشركة المصنعة.
ملاحظة: عادة، يتم إعداد aliquots لتخفيف لاحقة في 25 مل من DMEM/F12 الباردة في أنبوب مخروطي 50 مل تليها خلط ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كان الهدف من هذا البروتوكول هو إثبات أن الخلايا البشرية الناضجة يمكن اشتقاقها من خلايا hiPS في ظل ظروف محددة كيميائيا. تم إنشاء البيانات المعروضة في هذه المخطوطة باستخدام خط الخلية17من DU11 hiPS ، والتي تم اختبارها لأول مرة ، ووجدت أنها خالية من الميكوبلازما. كما تم إجراء تحليل كروموسومي، وتبين أن الخلايا طبيعية بشكل كاريوتيبيكي. بدءا من خلايا DU11 hiPS غير المتمايزة، استراتيجية التمايز (الشكل 1) المبينة في هذا التقرير تم استخدامها للتمييز أولا الخلايا الجذعية (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا التقرير، ونحن نصف بروتوكول لتوليد الخلايا الكبيبية الكلى من خلايا hiPS. وs podocytes hiPS المستمدة من الخلية معرض السمات المورفولوجية والجزيئية المرتبطة بالنمط الظاهري podocyte الكلي ناضجة13. في المنشورات السابقة، أظهرنا أن الخلايا البودوسيات المشتقة من خلية hiPS يمكن أن تحاكي بنية ووظيفة الترشيح الانتقائية لكبيبي الكلى عندما تشارك في زراعة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الكبيبية في جهاز الفلوريد الدقيق القابل للتشويه على رقاقة8،11
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
S.M. هو مؤلف على براءة اختراع معلقة لأساليب توليد podocytes الكلى من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (طلب براءة الاختراع في الولايات المتحدة 14/950859). ويعلن المؤلفون الباقون أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل كلية برات للهندسة في جامعة ديوك، وشعبة أمراض الكلى في كلية الطب ديوك، وجائزة أبحاث كرسي من قسم الطب في جامعة ديوك، وجائزة مخصصة الانتقال الوظيفي PDEP صندوق بوروز ويلكوم لS.M.. M.B تحظى بدعم برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم. نشكر مختبر بورساك على تزويدنا بسخاء بخط الخلايا الجذعية DU11، ومختبر فارغيز في جامعة ديوك لمشاركته مؤقتا منشأة زراعة الأنسجة الخاصة بهم مع مجموعتنا. هذا المنشور مخصص للبروفيسورة لورا ل. كيسلينغ، أستاذة الكيمياء في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، احتفالا بعيدميلادها الستين.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية>Cells | |||
| DU11 خلايا | تم إنشاء خط خلايا iPS DU11 (استنساخ جامعة ديوك # 11) في مرفق iPSC الأساسي بجامعة ديوك وقدمه لنا مختبر Bursac في جامعة ديوك. تم اختبار هذا الخط بحثا عن الميكوبلازما وتم آخر تنويط في يوليو 2019 من قبل مختبرنا ، ووجد أنه طبيعي في النمط النووي. | ||
| <قوي > عوامل النمو ومكملات الوسائط < / قوي > | |||
| حمض الريتينويك المتحول بالكامل (500 مجم) | 72262 | مكمل غذائي | |
| خال من المصل B27 | 17504044 | Thermo / Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | قد يظهر Stemgent | تباينا |
| مجموعة كاملة متوسطة مع CultureBoost-R | 4Z0-500-R | أنظمة الخلايا وسائط | صيانة الخلايا البودوية |
| DMEM / F12 | 12634028 | Thermo / Life Technologies | |
| DMEM / F12 مع مكمل GlutaMAX | 10565042 | Thermo / Life Technologies | DMEM / F12 مع مكمل الجلوتامين |
| FBS المعطلة | بالحرارة 10082147 | Thermo / Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo / Life تقنيات | |
| Human BMP7 | PHC9544 | تقنيات الحرارة / الحياة البشرية | |
| VEGF | PHC9394 | تقنيات | |
| mTeSR1 متوسط | 05850 | تقنيات الخلايا الجذعية وسائط | زراعة الخلايا hiPS (CCM) |
| البنسلين & ndash ؛ الستربتومايسين ، سائل (100 مرة؛) | 15140-163 | Thermo / Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| < قوي > الأجسام المضادة < / قوي > | |||
| Alexa Fluor 488 & ndash ؛ و Alexa Fluor 594 & ndash ؛ الأجسام المضادة الثانوية المترافقة | A32744 ؛ أ 32754 ؛ أ -11076 ؛ A32790 | Thermo / Life Technologies | |
| Brachyury (T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R & D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| <قوية > جزيئات ECM < / قوية > | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) جزء | N-892012 | Iwai | أمريكا الشمالية الغشاء القاعدي (BM) مصفوفة 2 |
| مصفوفة مؤهلة من Matrigel hESC ، قارورة 5 مل | 354277 | BD | مصفوفة الغشاء القاعدي للعلوم البيولوجية (BM) 1. قد يظهر تباينا من الكثير إلى الدفعة |
| < قوي > الإنزيمات والكواشف الأخرى < / قوي > | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo / Life | Technologies حل انفصال الخلية |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO سام. يجب التعامل معها في غطاء السلامة |
| الكيميائية المخزن المؤقت لتفكك الخلايا الخالي من الإنزيم ، هانك s الملح المتوازن | 13150016 | الإيثانول الحرارية / Life Technologies | |
| ، 70٪ (vol / vol) ، درجة التكنولوجيا الحيوية | 97065-058 | VWR | الإيثانول قابل للاشتعال وسام |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo / Life Technologies | يجب التعامل مع PFA في غطاء دخان كيميائي مع معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر ونظارات العين الآمنة. تجنب الاستنشاق والتلامس مع الجلد. |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | 14190-250 | تقنيات الحرارة / الحياة | |
| الماء المقطر المعقم | 15230162 | تقنيات الحرارة / الحياة Triton | |
| X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA ، 0.05٪ | 25300-120 | Thermo / Life Technologies | |
| < قوي > معدات < / قوي> | |||
| ماصات الشفط ، ملفوفة بشكل فردي | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R جهاز طرد مركزي | B99516 | بيكمان كولتر | |
| مخروطي 352097 | 15 مل | Corning | |
| ، 50 مل | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo / Life Technologies | لتخزين المجمدة aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo / Life Technologies | المجهر الفلورسنتي يستخدم للحصول على صور لخلايا iPS الثابتة والملطخة ومشتقاتها |
| مقياس الدم | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i حاضنة CO2 | 51030403 | تقنيات Thermo / Life | للثقافة الروتينية وصيانة خلايا iPS ومشتقاتها |
| مقلوب Zeiss Axio Observer مجهز بكاميرا AxioCam 503 | 491916-0001-000 (مجهر) ؛ 426558-0000-000 (كاميرا) | زايس المجهر | يستخدم للحصول على صور تباين الطور لخلايا iPS الحية ومشتقاتها في كل مرحلة من مراحل تمايز الخلايا البودوسياتي |
| قفازات النتريل كيمبرلي كلارك | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes ، كبير | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes ، صغير | 21905-026 | VWR | |
| P10 نصائح ماصة حاجز الدقة | P1096-FR | حاجز Denville Scientific | |
| P100 | P1125 | أطراف ماصة حاجز Denville Scientific | |
| P1000 | P1126 | حاجز Denville Scientific | |
| P20 | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 نصائح | ماصة حاجزP1122 | دينفيل Scientific | |
| Serological ، 10 مل ، ملفوفة بشكل فردي | 356551 | Corning | |
| المصلية ، 25 مل ، ملفوفة بشكل فردي | 356525 | Corning | |
| Serological ، 5 مل ، ملفوفة بشكل فردي | 356543 | Corning | |
| Steriflip ، 0.22 مو ؛ م ، PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة | 1138W14 | Thomas Scientific | لنقل عوامل النمو |
| ثقافة الأنسجة &ndash ؛ معالجة 12 بئر لوحات | 353043 | Corning | |
| Tissue Culture & ndash ؛ ألواح سداسية الآبار المعالجة | 353046 | Corning | |
| VWR معطف مختبر techuni أبيض | 10141-342 | VWR | |
| رافع خلية مشطوف عريض | 3008 | كورنينج |
المراجع
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
