مقالة منهجية

تحلل Proteolytically Alginate Hydrogels والميكروبات الهيدروفوبية ل Porcine Oocyte تغليف

5.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61325

⸱

يوليو 30, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Endocrinology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College, 3Department of Experimental Hematology, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University in Krakow

في هذه المقالة

ملخص

هنا هي بروتوكولين لتغليف البويضات porcine في ظروف ثقافة 3D. في الأول، يتم تغليف مجمعات الزُنَق (COCs) في الخرز الفيبرين-الجينات. وفي الثانية، يتم وضعها مع جزيئات مسحوق البروبيلين الإيثيلين المفلورة (ميكروبيراكات). يضمن كلا النظامين الظروف المثلى للحفاظ على تنظيمهما ثلاثي الأبعاد.

الملخص

وفي مجال البيولوجيا الإنجابية، أدت ثورة التكنولوجيا الأحيائية التي بدأت بالتلقيح الاصطناعي وتكنولوجيا نقل الأجنة إلى تطوير تقنيات المساعدة على الإنجاب مثل البويضة في نضوج المختبرات (IVM)، والتخصيب في المختبر (IVF) واستنساخ الحيوانات الأليفة عن طريق النقل النووي من الخلايا الجسدية. IVM هو الأسلوب خاصة من أهمية. بل هو منصة التكنولوجيا لتوريد ناضجة، جيدة الجودة البويضات لتطبيقات مثل الحد من الفاصل الزمني جيل في الأنواع الهامة تجاريا أو المهددة بالانقراض، والبحوث المتعلقة في المختبر التكاثر البشري، وإنتاج الحيوانات المعدلة وراثيا لعلاج الخلايا. مصطلح بويضة الجودة يشمل اختصاصها لاستكمال النضج، أن تكون المخصبة، مما يؤدي إلى نسل صحي. وهذا يعني أن البويضات ذات النوعية الجيدة هي ذات أهمية قصوى للتخصيب الناجح بما في ذلك إجراءات التلقيح الاصطناعي. وهذا يطرح صعوبات كثيرة لتطوير طريقة زراعة موثوقة من شأنها أن تدعم نمو ليس فقط من البويضات البشرية ولكن أيضا لأنواع الثدييات الكبيرة الأخرى. الخطوة الأولى في IVM هي ثقافة في المختبر من البويضات. يصف هذا العمل بروتوكولين لثقافة البويضات البورسين 3D. في الأول، يتم تغليف 3D نموذج كومبلوس-بويضة المجمعات (COCs) في شبكة توسط حبة الفيبرين alginate، حيث يتم هلام مزيج من الفيبرين و alginate في وقت واحد. وفي الثانية، يتم تعليق مركبات الكربون في قطرة متوسطة ومغلفة بروبيلين الإيثيلين المفلور (FEP؛ copolymer من سداسي فلوري بروبلين وتترافلور إيثيلين) جزيئات مسحوق لتشكيل ميكروبيورياكات تعرف بأنها كرات من الرخام السائل (LM). كلا النظامين ثلاثي الأبعاد يحافظان على البيئة الغازية في بيئة الاستزراع في المختبر. كما أنها تحافظ على منظمة COCs 3D من خلال منع تسطيحها وما يترتب على ذلك من تعطيل الوصلات الفجوة، وبالتالي الحفاظ على العلاقة الوظيفية بين البويضات، والخلايا الجريب المحيطة بها.

المقدمة

تطوير أنظمة الثقافة المختلفة، بما في ذلك ثلاثية الأبعاد (3D) منها، يهدف إلى توفير الظروف المثلى لنمو ونضج البويضات المعزولة من بصيلات حتى في المراحل الأولى من التنمية. وهذا أمر ذو أهمية كبيرة بالنسبة لتقنيات المساعدة على الإنجاب (ART)، خاصة بالنظر إلى العدد المتزايد من النساء اللواتي يكافحن مع العقم بعد علاج السرطان1. نضوج البويضات في ظروف في المختبر (IVM) هو بالفعل تقنية راسخة تستخدم أساسا لتوليد الجنين في المختبر لغرض تكاثر الماشية2. ومع ذلك، في معظم أنواع الثدييات، حتى لو كان يمكن تحقيق معدلات عالية من نضوج مجمعات الزبيب الكمولي (COCs) (تتراوح بين 60 و 90 ٪3، فإن كفاءتها التنموية لا تزال غير كافية لتلبية الاحتياجات. هذا لأنّ التطوير من الزّجوت ينال في هذا طريق حتّى حتّى إلى الوّحدة طور منخفضة وبعد الإنتقال داخل بديلة خفّض قدرتهم أن يكون عمليّة إلى عبارة. وبالتالي، هناك حاجة إلى زيادة الكفاءة التنموية للأجنة التي تم الحصول عليها من البويضات التي خضعت لإجراء IVM4. لذلك، يتم ابتكار وسائل الإعلام نضوج جديدة5 وفترات مختلفة من الثقافة في المختبر6,7 جنبا إلى جنب مع مكملات وسائل الإعلام الثقافة مع عوامل النمو المختلفة والجزيئات8,9.

الخطوة الأولى من أي نظام IVM كاملة هي خلق الظروف المثلى للنمو المستدام للبويضات خلال الثقافة في المختبر. نمو البويضة هو واحد من المؤشرات المحددة لقدرة البويضة على استئناف البويضات10،11. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون البويضة المناسبة في نظام ثقافة في المختبر قادرة على دعم نضوجها النووي والتمايز السيتوبلازمي12. مورفولوجيا مركب الزبيب الكمولي هو مؤشر مهم آخر يستخدم في عيادات العلاج بمضادات الفيروسات القهقرية لاختيار أفضل البويضات للخطوات اللاحقة من الإخصاب في المختبر (IVF) الإجراء في البشر والماشية12،13. ومن بين الخصائص المورفولوجية ل COCs التي تعتبر: قطر البويضة، حبيبات السيتوبلازم وأول نزاهة الجسم القطبي14،15. إلى جانب ذلك، يرتبط إمكانات النمو البويضية إلى مظهر وضغط الخلايا الركامية وعدد طبقاتها المحيطة البويضة. مهم جداً لبويضات مناسبة في نظام ثقافة فيترو هو أيضا الحفاظ على الخلايا البويضية-cumulus التفاعلات السليمة والاستقرار cytoskeleton16,17,18,19. حتى الآن، في في المختبر بويضة النمو داخل COCs الإنسان وقد ثبت20. كما نتج عن استخدام COCs البقر مع الولادات الحية. تم عزل هذه من بصيلات المبيض غير ناضجة ثم مثقف لمدة 14 يوما حتى البويضة كانت كبيرة بما فيه الكفاية للخضوع لعملية التلقيح الاصطناعي21. وبالمثل، COCs معزولة عن بصيلات البابون انترال، التي تعرضت لIVM بعد في ثقافة في المختبر أسفرت عن البويضات قادرة على إعادة الميوسيس إلى المرحلة الثانية metaphase مع هيكل المغزل العادي الظهور22. ومع ذلك ، في هذه الدراسة لم يحاول المؤلفون تخصيبها. ومع ذلك تشير هذه النتائج إلى أن إجراء مماثل يمكن تطبيقه ليس فقط على هذه الأنواع الثديية الخاصة ولكن أيضا على مجمعات الكومبولوس- البويضة البشرية التي يتم الحصول عليها من الجريبات ما ينبغي أن يسمح بالحصول على بويضات ذات نوعية جيدة مناسبة لتقنية التلقيح الصناعي الناجحة.

تم الحصول على النتائج المذكورة أعلاه مع تطبيق بروتوكولات IVM التقليدية التي تم خلالها استزراع البويضات في أنظمة ثنائية الأبعاد. الإجراء الروتيني في أنظمة الثقافة 2D يغطي البويضات، مغمورة في قطرة من وسائل الإعلام الثقافة المناسبة، مع النفط المعدني23،24. ومن المفترض أن تراكب النفط خلال في تربية البويض في المختبر يعمل على منع تبخر السائل، وبالتالي ضمان الحفاظ على درجة الهضاح السليمة والضغط التناضح في الثقافة. على الرغم من أن مثل هذا النظام ثقافة 2D يسمح للحصول على, حتى تصل إلى 87% من البويضات الخنازير ناضجة25, وقد ثبت أن تراكب النفط المعدني يسبب انتشار كبير من المواد القابلة للذوبان في الدهون التي هي ضرورية لتطوير البويضات السليم26. بالإضافة إلى ذلك، بسبب المنشطات (البروجسترون وهرمون الاستروجين) انتشار في الزيوت المعدنية خلال ثقافة البويض، لوحظ تأخير النضج النووي والحد من تحقيق الكفاءة التنموية من البويضات الخنازير. وهذا قد يؤدي إلى الحصول على عدد قليل من zygotes، والتي بالإضافة إلى ذلك تتميز القدرة التنموية المنخفضة لمرحلة الكيسة الأردية وبضعف الجدوى بعد نقلها إلى الحيوانات المتلقية27. لذلك، يتم بذل محاولات لزيادة الكفاءة التنموية للأجنة المشتقة من البويضات التي يتم تلقيها بعد إجراء IVM، من خلال خلق الظروف المثلى لتحقيق كل من النضج السيتوبلازمي والنووي للبويضات المستزرعة مع CCs كمجمعات، خاصة باستخدام أنظمة ثلاثية الأبعاد (3D). وقد تم تطوير مختلف النظم المبتكرة 3D في الثقافة في المختبر في العقدين الماضيين28,29. وقد صممت هذه للحفاظ على التنظيم المكاني الطبيعي للخلايا وتجنب تسطيحها في أطباق الثقافة ما لا يمكن تحقيقه في الثقافات التقليدية 2D. يمكن ضمان النشاط الهيكلي والوظيفي للCOCS مثقف من خلال الحفاظ على الهندسة المعمارية السليمة والاتصال دون عائق من خلال الفجوة - الوصلات بين مختلف المقصورات30. وقد تم تقييم ملاءمة سقالات حيوية لثقافة 3D في المختبر من مجمعات التراكمات البويضية باستخدام المواد الحيوية الطبيعية مثل مكونات مختلفة من المصفوفة خارج الخلوية (ECM؛ الكولاجين وحمض الهيالورونيكس)31 أو البوليمرات الخاملة (alginate)32. هذه المحاولات التي تم اختبارها في عدة أنواع جلبت نتائج واعدة من حيث استئناف البويضات meiosis وتحقيق كفاءتها الكاملة33,34,35. ولكن حتى الآن، لم يتم تطوير أي نظام ثلاثي الأبعاد مناسب لنضوج COCs المعزول عن الحيوانات الأليفة الكبيرة، بما في ذلك الخنازير.

يصف هذا العمل بروتوكولين يمكن استخدامهما لثقافة الـ 3D لـ PORcine COCs. يصف البروتوكول الأول التغليف في الخرز الفيبرين-ألجينات (FAB). يمكن تشكيل FAB عن طريق خلط محلول ألجينات والفيبرين في وقت واحد ، والتي تخضع لعملية هلام متزامن. يوفر هذا المزيج بيئة ميكانيكية ديناميكية لأن كلا المكونين يساهمان في صلابة المصفوفة. وقد استخدم حل مماثل سابقا لثقافة بصيلات المبيض الماوس ونضج36. في حالة البروتوكول المقدم، لتجنب التحلل المبكر لشبكة الفليبين، يتم استخدام تركيزات أعلى بشكل مناسب من محلول كلوريد الكالسيوم، مما يضمن عملية هلام سريعة ومستقرة. البيئة الميكانيكية الديناميكية تخلق ظروف مماثلة لهذه الظروف في البيئة الطبيعية داخل الجريب الذي تتواجد فيه COCs وتزيد في الحجم. بالإضافة إلى ذلك، يعرض العمل نتائج تمثيلية لنظم الثقافة ثلاثية الأبعاد COCs، حيث يتم تعليق هذه في قطرة متوسطة ومغلفة بروبلين الإيثيلين المفلور (FEP؛ copolymer من سداسي فلوريورو بروبلين وجسيمات رباعية الفلور إيثيلين) المسحوق، لتشكيل ميكروبيورياكتوريس (الرخام السائل، LM). LM هي شكل من أشكال 3D مفاعل حيوي التي ثبت سابقا لدعم, من بين أمور أخرى, نمو الكائنات الحية الدقيقة الحية37, الورم spheroids38 والخلايا الجذعية الجنينية39. وقد تم أيضا استخدام LMs بنجاح لتربية البويضات الأغنام40. في معظم التجارب باستخدام LMs، تم إعداد المفاعلات الحيوية باستخدام سرير مسحوق اثيلين متعددtetrafluoro (PTFE) بحجم جسيم 1 ميكرومتر41. البروتوكول المقدم يستخدم FEP، وهو مشابه جداً في التركيب وخصائص لـ PTFE الفلوروبوليمرات. ولكن FEP هو أكثر سهولة شكل ونعومة من PTFE وما هو مهم بشكل خاص، فمن شفافة للغاية.

كلا النظامين ثلاثي الأبعاد يحافظان على البيئة الغازية في بيئة الاستزراع في المختبر. كما أنها تحافظ على COCs 3D المنظمة من خلال منع تسطيح وما يترتب على ذلك من تعطيل الوصلات الفجوة، والحفاظ على علاقتهم الوظيفية بين البويضات والخلايا الجريب المحيطة بها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان في معهد علم الحيوان والبحوث الطبية الحيوية في جامعة جاجيلونيان على الإجراءات التالية.

1. عزل مجمعات الزبيب البويضية

  1. لجمع المواد لعزل بصيلات المبيض، والمبيضات المسامية المكوس من المذهبات قبل البوب (ما يقرب من 6-7 أشهر من العمر، وزنها 70 إلى 80 كجم) في مسلخ محلي. اختيار ما يقرب من 20 مبايض خنزير من 10 لعزل COCs في كل تجربة.
    ملاحظة: على افتراض أن كل مبيض ينتج 3-5 بصيلات، فإن العدد الإجمالي للجريبات يختلف من 60 إلى 100.
  2. وضع المبيضين في الترمس مع المالحة المعقمة الفوسفات المخزنة (PBS؛ درجة حرارة 7.4؛ 38 درجة مئوية) تحتوي على 1٪ AAS. تأكد من نقل المواد التجريبية إلى المختبر في غضون ساعة 1 حيث يتم شطفها مرتين مع برنامج تلفزيوني معقمة تحتوي على المضادات الحيوية.
  3. بعد شطف المبيضين، ونقلها إلى القارس مليئة HM المتوسطة وتخزينها في حاضنة في 38 درجة مئوية في الوقت من كل التلاعب.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج أثناء معالجة البويضة، تنفيذ جميع الإجراءات في DMEM /F12 المتوسطة (التعامل مع المتوسطة، جلالة الملك) مع إضافة 2.5٪ المضادات الحيوية / حل مضاد للعمى (AAS) و 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) والسيطرة على درجة ال H على مستوى CO2 في البيئة، على طاولة التدفئة مع التحكم في درجة الحرارة (38 درجة مئوية) وتحت غطاء محرك تدفق لارينار للحد من التلوث البكتيري.
  4. من بصيلات البورسيني الكبيرة (6-8 مم في القطر) جمع السائل الجريب (FF) عن طريق الطموح والطرد المركزي في 100 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تصفية عظمى باستخدام حقنة معقمة تعلق على 0.2 μm مرشحات المسام غشاء و المفاجئة تجميد في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدام حقنة الأنسولين (ش- 40) لتطلع السوائل الجريبية.
  5. تأكد من أن، وصحية فقط، بصيلات متوسطة الحجم (4-6 ملم في القطر) يتم اختيارها لعزل COCs42.
    ملاحظة: COCs من الدرجة الأولى، وامتلاك بويضة سليمة ومستديرة مع ooplasm متجانسة ومتعددة الطبقات (على الأقل 3-4) تعتبر cumulus المدمجة مناسبة لمزيد من 3D IVM الإجراء43.
  6. لعزل COCs، نقل 2-3 المبيضين إلى طبق بيتري قطره 10 سم معقمة مليئة HM. عزل COCs من بصيلات متوسطة الحجم باتباع أحد الإجراءات أدناه.
    1. قطع بلطف سطح بصيلات المبيض جاحظ مع شفرة الجراحية العقيمة 15C. وهذا سوف يسبب السائل الجريبي جنبا إلى جنب مع COCs لتدفقها إلى طبق بيتري.
    2. التعرق محتوى الجريبي باستخدام إبرة 28 G وجود حجم 5/8 "تعلق على حقنة يمكن التخلص منها ونقلها إلى طبق بيتري.
      ملاحظة: تخلص من بقايا أنسجة المبيض. يتم تنفيذ المراحل اللاحقة من العزل تحت منظار مجسم.
  7. إعداد 3-5 60 ملم IVF بتري أطباق.
    1. أضف 1 مل من HM إلى الآبار المركزية ووضع 3-4 قطرات من HM (50 ميكرولتر لكل قطرة) في حلقاتها الخارجية.
    2. ثم، وذلك باستخدام ميكروبيغيت البولي، نقل COCs التالفة إلى قطرات من HM في الحلقات الخارجية لشطف لهم لفترة وجيزة لمدة 3-4 مرات.
    3. في النهاية، نقلها بشكل فردي إلى البئر المركزية. تخزين هذه لوحات التلقيح الاصطناعي في حاضنة لمزيد من الإجراءات.
  8. بعد تجميع COCs، قم بتنفيذ خطوة الاختيار النهائية عن طريق تعيينها بشكل عشوائي في بروتوكولين تغليف IVM مختلفين مذكورين أدناه.

2. تغليف في فيبرين-ألجينات حبات هيدروجيل

  1. إعداد 1 مل من 50 وحدة دولية / مل ثرومبين في محلول ملحي تريس المخزنة (TBS؛ pH 7.4) مع 100 mM CaCl2 في أنبوب 2.0 مل معقم microcentrifuge.
  2. تحضير محلول الأسهم الفيبرينوجين (50 ملغ /مل في TBS) والاحتفاظ بها المجمدة.
    ملاحظة: لتجنب تكتل عند حل الفيبرينوجين في TBS، الحرارة TBS إلى 37 درجة مئوية.
    1. في يوم الإجراء ، ذوبانه ببطء على الجليد والحق قبل الاستخدام جلب إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. قبل استخدام مزيج في 1:1 نسبة 0.5٪ حل ألجينات و 50 ملغ / مل محلول الفيبرينوجين للحصول على أخيرا 2 مل (FA). في أنبوب microcentuge العقيمة دوامة بلطف الخليط. تجنب صنع الفقاعات.
  4. لإعداد "غرف الحضانة"، تطبيق شرائح رقيقة من أفلام البارافين على الشرائح المجهر الزجاجي.
    ملاحظة: مسح الشرائح مع 70 % EtOH قبل الاستخدام. يتم تشكيل غرفة حضانة واحدة مع اثنين من الشرائح. لفصلها، ضع 3 مم الفواصل على واحد منهم.
  5. Pipette 7.5 μL قطرات من خليط FA على هذا البارافين فيلم الزجاج المطلي الشريحة، والتي لديها أيضا فصل الفواصل. على مكان شريحة واحدة 8-10 قطرات، مرتبة في صفين.
  6. نقل، وذلك باستخدام micropipette، 3-5 COCs جنبا إلى جنب مع الحد الأدنى من حجم (ما يصل إلى 5 ميكرولتر) من متوسط النضج (MM)، ووضعها على وجه التحديد في وسط انخفاض FA. هذا الإجراء يتطلب مهارات يدوية جيدة والدقة.
    ملاحظة: يتكون متوسط النضج (MM) من DMEM/F12، مع 10 وحدة دولية/مل PMSG، 10 وحدة تخزين نفايات ثنائية الحجم 10% FBS و50% من السائل المسامي (FF) التي تم جمعها في الخطوة 1.4.
  7. إضافة 7.5 μL من ثركمبين / كاليفورنيا2 + حل على كل قطرة FA، فقط لتغطية لهم. ليست هناك حاجة لخلطها لأن شكل الجل على الفور تقريبا.
  8. تغطية غرفة الحضانة عن طريق تطبيق الشريحة الزجاجية الثانية التي تم إعدادها مسبقًا على كبسولات FA. مع حركة حذرة جدا ولكن شركة، بدوره الغرفة رأسا على عقب ووضعها في طبق بيتري 100 ملم اصطف مع ورقة مرشح رطبة لتجنب التجفيف.
  9. ثم، نقل طبق بيتري إلى 5٪ CO2 حاضنة (38 درجة مئوية) لمدة 5-7 دقيقة. بعد ذلك، سوف تصبح كبسولات FA غائم بسبب هلام في وقت واحد من الفيبرين والأجينات.
  10. نقل كبسولات FA إلى 96 لوحات جيدا (كبسولة واحدة في بئر) تحتوي على 100 ميكرولتر MM في البئر.
    ملاحظة: عدم تلف كبسولات FA المشكلة، قم بتنفيذ هذه الخطوة بعناية مع استخدام ملقط جراحية.
  11. كل 2 أيام استبدال نصف MM (50 ميكرولتر) مع الطازجة، قبل التوازن واحد. صورة COCs باستخدام مجهر ضوء مقلوب (في التكبير 10x).
    ملاحظة: ظروف الثقافة لثقافة الاتحاد العالمي للانبعاثات: 38 درجة مئوية، تحت جو CO2 5٪ والرطوبة النسبية 95٪. بعد 4 أيام من IVM، hydrogels تظهر واضحة تقريبا بسبب التدهور التدريجي للمكون الفيبرين. وينبغي أن تتحلل alginate المتبقية انزيمية - بواسطة alginate-lyase، وهو إنزيم مشتق من النباتات التي تتحلل على وجه التحديد alginate ولا تؤثر على الخلايا الحيوانية.
    1. إزالة MM من الآبار التي تحتوي على كبسولات وإضافة 100 ميكرولتر من 10 وحدة دولية / مل alginate lyase في DMEM. اترك لوحة الثقافة في الحاضنة لمدة 25-30 دقيقة.
    2. إزالة COCs من كبسولات الذائبة.
      ملاحظة: يمكن القيام بذلك مع قطع ماصة تلميح.
    3. بعد عدة يغسل في DMEM الطازجة، ونقل COCs إلى حلقة الداخلية من طبق التلقيح الاصطناعي (5-10 COCs لكل طبق) التي تحتوي على برنامج تلفزيوني. الآن، استخدمها لمزيد من التحليل المورفولوجي أو البيوكيميائي.

3. تغليف في سوبر هيدروسيبيك مفلورة الإيثيلين البروبيلين (FEP) ميكروبيراكات.

ملاحظة: تأكد من أن جميع إجراءات IVM تتم على طاولة تسيطر عليها الحرارة وCOCS يتم الاحتفاظ بها عند 38 درجة مئوية طوال التعامل معها.

  1. إعداد 30 مم طبق بيتري تحتوي على 5 غرام من مسحوق FEP سرير متوسط حجم الجسيمات 1 ميكرومتر.
    ملاحظة: من المهم استخدام مسحوق FEP الطازج. يميل FEP الذي يعاد استخدامه إلى تجميع الكتل ويشكلها.
  2. توزيع قطرة واحدة من MM (~ 30 ميكرولتر في الحجم) تحتوي على 3-5 COCs معزولة في الخطوة 1.6 على سرير مسحوق FEP. تدوير لوحة بلطف في حركة دائرية للتأكد من أن هذه الجسيمات غطت تماما سطح قطرة السائل والرخام السائل شكلت (LM).
  3. التقط LM شكلت باستخدام ماصة مع 1000 μL تلميح.
    ملاحظة: قطع طرف ماصة على الحافة، لاستيعاب ذلك إلى قطر LM (4-5 مم). وينبغي أن يكون القطر التقريبي لهذه الحافة المعدة أكبر قليلا من ذلك من LM.
  4. إعداد عدة 60 مم IVF بتري أطباق. إضافة 3-4 مل من الماء المعقم إلى الحلقات الخارجية لإعداد غرفة الرطوبة. بعد ذلك، ضع LM واحد في البئر المركزي.
    ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء مهارات يدوية جيدة ودقة - إذا تم وضع الرخام بلا مبالاة أو يسقط حتى من ارتفاع منخفض سيتم تدميره.
  5. احتضان الرخام لمدة 4 أيام في 38 درجة مئوية في 5 ٪ CO2 حاضنة.
    1. تغيير المتوسط يوميا بعد الإجراء: تطبيق 30 ميكرولتر من MM على كل LM، والتي سوف تسبب انتشارها لأن الاتصال السائل المباشر يعطل hydrophobicity من مساحيق FEP المغلفة. عندما يذوب محتوى الرخام، نقل COCs الصادرة من مفاعل حيوي إلى قطرة من MM الطازجة في طبق بيتري.
      ملاحظة: لنقل COCs الذي تم إصداره بدقة، استخدم ميكروبيبات بوليكربونيت.
    2. بعد عدة يغسل في MM (3-4 مرات) لإزالة جزيئات FEP، نقلها مع 30 ميكرولتر من MM الطازجة على السرير مسحوق FEP. تدوير لوحة بلطف في حركة دائرية لضمان أن جزيئات مسحوق غطت تماما سطح قطرة السائل وتشكيل LM جديدة.
    3. ثم اتبع الإجراء من الخطوات 3.3-3.4.
      ملاحظة: يسمح طلاء شفاف من مسحوق FEP لمراقبة محتوى LM باستخدام المجهر الخفيف.

4. توصيف COCs بعد إجراء IVM 96-h باستخدام نظامين ثلاثي الأبعاد

ملاحظة: لتحديد كفاءة أنظمة IVM المستخدمة، قم بتسجيل COCs بشكل مورفولوجي تحت مجهر خفيف. بالإضافة إلى ذلك، استخدام الملصقات الفلورية المزدوجة مع CALCEIN AM و ethidium هسم (EthD-1) الأصباغ لتحليل القدرة على البقاء COCs44.

  1. الفحص المورفولوجي للبويضات بعد الـ IVM عن طريق المجهر الضوئي والفلوري.
    1. غسل COCs (كل من تلك المستمدة من الثقافة باستخدام FAB وتلك من LM) مع 38 درجة مئوية 1X PBS.
      ملاحظة: لتسهيل التعامل مع COCs وعدم الإضرار بها أثناء إجراء التلطيخ، استخدم لوحة 96 أو 48 بئرًا واؤدي كل خطوة تلطيخ عن طريق نقل COCs إلى آبار لاحقة.
    2. احتضان لهم في 100 ميكرولتر من 1.6 mM calcein AM و 5.5 mM EthD-1 لمدة 30-45 دقيقة في 37 درجة مئوية. تمييع كلا المواد في 1x PBS.
      ملاحظة: لأن هذا هو مقايسة الفلورين لونين، تنفيذ هذه الخطوة في الظلام.
    3. بعد الحضانة، وغسل COC مرتين في برنامج تلفزيوني ثم تزج في الضد تصاعد المتوسطة المصممة لمنع photobleaching السريع من البروتينات الفلورية والأصباغ الفلورية (جدول المواد).
      ملاحظة: حماية حواف الزجاج غطاء ضد التجفيف مع أي طلاء الأظافر.
    4. تصور العينات الملطخة تحت مجهر مسح الليزر confocal.
      ملاحظة: لإثارة الفلور من كلا المسبارين (أي، calcein و ethidium homodimer-1، EthD-1) لحن ليزر الأرجون إلى 488nm. ويفصل بين الفلورس المنبعث مرشح ثلاثي 488/561/633 ثم يقاس عند 505-570 نانومتر للثاني الأخضر (كالسين)، وعند 630-750 نانومتر للأحمر (EthD-1).
    5. تصنيف COCs إلى أربع فئات، وذلك باستخدام تصنيف المعدلة التي يتم تطبيقها على بصيلات المبيض في الثقافة على أساس التصوير الفلوري confocal اعتمادا على النسبة المئوية للخلايا الحبيبية الميتة35.  V1: COCs مع ما يقدر ب 100% قابلة للحياة CCs; V2: COCs مع 10٪ من CCs الميتة؛ V3: COCs مع 10-50٪ من CCs الميتة؛ V4: COCs مع 50٪ من CCs الميت.
      ملاحظة: من الناحية الفنية، من الصعب تقييم جدوى البويضة مع مقايسة حية ميتة؛ لذلك، ينبغي أن يقدر على سبيل المثال، عن طريق تحليل البنية الفائقة الميتوكوندريا أو النشاط.
  2. فحص البويضات ultrastructure بعد IVM عن طريق المجهر الإلكترون انتقال.
    1. إصلاح COCs في 100 ميكرولتر 2.5٪ glutaraldehyde في 0.1 M الصوديوم cacodylate العازلة (درجة الحرارة 7.2، درجة حرارة الغرفة) لمدة 2 ساعة.
    2. غمر COCs في 100 ميكرولتر 0.1 M cacodylate الصوديوم العازلة (بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية) وشطف في نفس المخزن المؤقت.
    3. بوستFix COCs مع 1٪ تتروكسيد أوسميوم في 0.1 M cacodylate الصوديوم العازلة (درجة حرارة الغرفة) لمدة 1 ساعة.
    4. بعد تلطيخ في خلات أورانيل (1 ٪، وتجفيف COCs في سلسلة متزايدة من التخفيفات الإيثانول (50٪، 60٪، 70٪، 90٪ و 100٪)، التسلل لهم بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، تليها اثنين من التغييرات القصيرة من الراتنج وأخيرا، تضمينها في LR الأبيض.
    5. بعد ذلك، لتوجيه وتقييم العينات، وصمة عار أقسام شبه رقيقة (1 ميكرومتر) مع الميثيلين الأزرق / اللازوردي الثاني.
    6. وأخيرا، دراسة ultrathin، المقاطع الملطخة بشكل مضاعف على مستوى ultrastruural مع TEM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في COCs باستخدام كلا أنظمة IVM ، التزمت خلايا الحبيبية بإحكام مع بعضها البعض ، وكان معظم COCs المستردة طبقات سليمة من خلايا الركام(الشكل 1A ، B). بالإضافة إلى ذلك، تم الاحتفاظ بنسبة كبيرة من خلايا الركام.

وأكدت النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل قابلية البقاء COCs أن كلا النظامين تطبيق التغليف من البويضات بورسين في ظروف 3D في المختبر ضمان ظروف النمو الأمثل(الشكل 2). في كلتا المجموعتين، لوحظ فقط البويضات ذات القدرة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إن القدرة على الحفاظ على نمو في المختبر ليس فقط من البويضة ولكن أيضاً خلايا الكمولو المحيطة به وفي نفس الوقت دعم نضوجه ضرورية للغاية لتكنولوجيات الإنجاب المساعدة الناجحة وتعزيز فهم تفاعلات الخلايا الجسدية/البويض خاصة في الأنواع التي تمر بنمو جراسي طويل مثل البشر أو الخنازير. تقنيات IVM المحسنة باستمرار أصبحت أداة مفيدة للحفاظ على الخيارات الإنجابية في حالات متلازمة المبيض المتعدد الكيسات (PCOS)، فشل المبيض المبكر، أو العقم النهائي (العلاج بالثدي). بالإضافة إلى ذلك، منذ بعض اختلالات المبيض قد يكون سببها نمو جرابي dysregul...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

الكتاب ممتنون جدا ل: الدكتور Waclaw Tworzydlo (قسم علم الأحياء التنموية والرففات مورفولوجيا، معهد علم الحيوان والبحوث الطبية الحيوية، جامعة Jagiellonian) للمرافق التقنية في TEM; السيدة بياتا ساكوسكا (قسم الغدد الصماء، معهد علم الحيوان والبحوث الطبية الحيوية، جامعة جاجيلونيان) للحصول على المساعدة التقنية؛ إلى قسم بيولوجيا الخلية والتصوير، معهد علم الحيوان والبحوث الطبية الحيوية، جامعة جاجيلونيان، JEOL JEM 2100HT (JEOL، طوكيو، اليابان). وقد تم دعم هذا العمل بمنحة 2018/29/N/NZ9/00983 من المركز الوطني للعلوم في بولندا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > عام < / قوي >
مضاد حيوي مضاد للفطريات (100x) 100 ملثيرموفيشر 15240062تركيز نهائي 2.5٪ للمناولة المتوسطة. 1٪ في PBS (الخطوة 1.2)
DMEM / F12 (500 مل)Sigma-AldrichD8062المناولة والنضج
DPBS (بدون الكالسيوم ، المجم) ، 1x ، 500 مل14190144
Thermo FisherFCS (100 مل)Thermo Fisher16140063تركيز نهائي 10٪ لكل من وسط المناولة ووسط النضج. (الخطوات: 1.5. 2.6.)
PBS (1x ، درجة الحموضة 7.4) 500 ملThermo Fisher10010023
TBS محلول مخزون (10x ، درجة الحموضة 7.4) 500 ملCayman Chemicals600232تركيز نهائي 1x. يمكن استخدام العلامة التجارية
الأخرى <قوية > متوسط النضج < / قوي >
hCG (1 قارورة من 10 000 U)Sigma-AldrichCG10
PMSGBioVendorRP1782721000 <
قوي > حبات الفيبرين ألجينات < / قوي >
الجينات ليازسيجما ألدريتشA1603(الخطوة 2.11.1)
الثرومبينسيجما ألدريتشT9326-150UN(الخطوة 2.1)
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتشC5670(الخطوة 2.1)
الفيبرينوجين (250 مجم)سيجما ألدريتشF3879(الخطوة 2.2)
ألجينات الصوديومسيجما ألدريتشW201502(الخطوة 2.3) تستخدم لمحلول الجينات
<قوي > رخام سائل < قوي>
FEPDyneon GmbH 3M AdMDA-66670
< قوي >فحص مورفولوجي < / قوي >
LIVE / DEAD للحياة / مجموعة السمية الخلوية ، لخلايا الثديياتThermo FisherL3224(الخطوة 4.1.) التألق المنبعث: 494 نانومتر للكالسين ، 528 نانومتر ل EthD-1 ؛ القياس: 517 نانومتر للكالسيين ، 617 نانومتر -
مختبرات ناقلاتمتصاعدة مضادة للتلاشي VECTASHIELDH-1000متوسطة
التركيب <قوية>فحص البنية الفوقية< / قوي>
محلول جلوتارالديهايدSigma-AldrichG5882تركيز نهائي 2.5٪ (الخطوة 4.2.1.)
راتينج LR الأبيضسيجما ألدريتشL9774(الخطوة 4.2.4.)
الميثيلين الأزرقسيجما ألدريتشM9140(الخطوة 4.2.5.)
رابع أكسيد الأوزميومسيجما-ألدريتشO5500(الخطوة 4.2.3.)
كاكوديلات الصوديوم ثلاثي هيدراتسيجما-ألدريتشC0250يستخدم لتحضير عازلة كاكوديلات الصوديوم 0.1 متر (درجة الحموضة 7.2)
أسيتات اليورانيلPOCH868540111(الخطوة 4.2.4.)
<أدوات وأدوات > أدوات < / قوية >
30 مم طبق PteriTPP93040
60 مم طبق بتري IVFFalcon353653
Ez-Grid Premium Cell Handling PipettorRI Life Sciences8-72-288
Ez-TipRI Life Sciences8-72-4155 / 20
التدفئةSEMICيمكن استخدام ماركات أخرى
حاضنةباناسونيكMCO-170AIC-PEيمكن استخدام ماركات أخرى
طبق بتري معقم (10 سم)NEST Biotechnology704002
مرشحات حقنة معقمة مع 0.2 & micro ؛ mGOOGLAB ScientificGB-30-022PES
ThermosQuechua5602589يمكن استخدام ماركات أخرى
المتوسطة متوسطة طاولة

المراجع

  1. Jeruss, J. S., Woodruff, T. K. Preservation of fertility in patients with cancer. The New England Journal of Medicine. 360 (9), 902-911 (2009).
  2. Paramio, M. T., Izquierdo, D. Current status of in vitro embryo production in sheep and goats. Reproduction in Domestic Animals. 49 (4), 37-48 (2014).
  3. Gilchrist, R. B., Thompson, J. G. Oocyte maturation: emerging concepts and technologies to improve developmental potential in vitro. Theriogenology. 67 (1), 6-15 (2007).
  4. Nogueira, D., Sadeu, J. C., Montagut, J. In vitro oocyte maturation: current status. Seminars in Reproductive Medicine. 30 (3), 199-213 (2012).
  5. Farsi, M. M., Kamali, N., Pourghasem, M. Embryological aspects of oocyte in vitro maturation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 2 (3), 99-109 (2013).
  6. You, J., et al. Treatment with the proteasome inhibitor MG132 during the end of oocyte maturation improves oocyte competence for development after fertilization in cattle. PLOS One. 7 (11), 48613(2012).
  7. Donnay, I., et al. Effect of prematuration, meiosis activating sterol and enriched maturation medium on the nuclear maturation and competence to development of calf oocytes. Theriogenology. 62 (6), 1093-1107 (2004).
  8. Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Calvia, P., Naitana, S. Influence of vasoactive intestinal peptide (VIP), atrial natriuretic peptide (ANP) and insulin-like growth factor-I (IGF-I) on in vitro maturation of prepubertal and adult sheep oocytes. Zygote. 4 (4), 343-348 (1996).
  9. Uhm, S. J., et al. Epidermal growth factor can be used in lieu of follicle-stimulating hormone for nuclear maturation of porcine oocytes in vitro. Theriogenology. 73 (8), 1024-1036 (2010).
  10. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
  11. Sirard, M. A. Follicle environment and quality of in vitro matured oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (6), 483-488 (2011).
  12. Banwell, K. M., Thompson, J. G. In vitro maturation of Mammalian oocytes: outcomes and consequences. Seminars in Reproductive Medicine. 26 (2), 162-174 (2008).
  13. de Smedt, V., Crozet, N., Gall, L. Morphological and functional changes accompanying the acquisition of the meiotic competence in ovarian goat oocyte. Journal of Experimental Zoology. 269 (2), 128-139 (1994).
  14. Luca, X., et al. Relationship between antral follicular size, oocyte diameters and nuclear maturation of immature oocyte in pigs. Theriogenology. 58 (5), 870-885 (2002).
  15. Abeydeera, L. R. In vitro production of embryo in swine. Theriogenology. 57 (1), 256-273 (2002).
  16. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).
  17. Hashimoto, S., et al. Effects of cumulus cell density during in vitro maturation of the developmental competence of bovine oocytes. Theriogenology. 49 (8), 1451-1463 (1998).
  18. Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. What does it take to make a developmentally competent mammalian egg. Human Reproduction Update. 17 (4), 525-540 (2011).
  19. Albertini, D. F., Barrett, S. L. Oocyte-somatic cell communication. Reproduction. Supplement. 61, 49-54 (2003).
  20. Cavilla, J. L., Kennedy, C. R., Byskov, A. G., Hartshorne, G. M. Human immature oocytes grow during culture for IVM. Human Reproduction. 23 (1), 37-45 (2008).
  21. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  22. Xu, M., et al. In vitro oocyte maturation and preantral follicle culture from the luteal-phase baboon ovary produce mature oocytes. Biology of Reproduction. 84 (4), 680-697 (2011).
  23. Ka, H., Sawai, K., Wang, W. H., Im, K. S., Niwa, K. Amino acids in maturation medium and presence of cumulus cells at fertilization promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biology of Reproduction. 57, 478-483 (1997).
  24. Shimada, M., Zeng, W. X., Terada, T. Inhibition of PI 3-kinase or MEK leads to suppression of p34cdc2 kinase activity and meiotic progression beyond the MI stage in porcine oocytes surrounded with cumulus cells. Biology of Reproduction. 65, 442-448 (2001).
  25. Coy, P., Romar, R. In vitro production of pig embryos: a point of view. Reproduction Fertility and Development. 14, 275-286 (2002).
  26. Reinsberg, J., Ackermann, D., Vander Ven, H. Pitfalls in assessment of progesterone production by granulosa cells cultured in contact with silicone rubber or paraffin oil. Archives Gynecology Obstetrics. 270, 174-178 (2004).
  27. Shimada, M., Kawano, N., Terada, T. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral oil overlay of in vitro maturation media. Reproduction. 124, 557-564 (2002).
  28. Cekleniak, N. A., et al. Novel system for in vitro maturation of human oocytes. Fertility and Sterility. 75, 1185-1193 (2001).
  29. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 14, 633-639 (2002).
  30. Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: Overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (119), (2010).
  31. Combelles, C. M., Fissore, R. A., Albertini, D. F., Racowsky, C. In vitro maturation of human oocytes and cumulus cells using a co-culture three-dimensional collagen gel system. Human Reproduction. 20, 1349-1358 (2005).
  32. Dorati, R., et al. Formulation and stability evaluation of 3D alginate beads potentially useful for cumulus-oocyte complexes culture. Journal of Microencapsulation. 33, 137-145 (2016).
  33. Morselli, M. G., Canziani, S., Vigo, D., Luvoni, G. C. A three-dimensional alginate system for in vitro culture of cumulus-denuded feline oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 52 (1), 83-88 (2017).
  34. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Engineering. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  35. Shen, P., et al. A new three-dimensional glass scaffold increases the in vitro maturation efficiency of buffalo (Bubalus bubalis) oocyte via remodeling the extracellular matrix and cell connection of cumulus cells. Reproduction in Domestic Animals. 55 (2), 170-180 (2020).
  36. Kniazeva, E., et al. Primordial follicle transplantation within designer biomaterial grafts produce live births in a mouse infertility model. Scientific Reports. 5, 17709(2015).
  37. Tian, J., Fu, N., Chen, X. D., Shen, W. Respirable liquid marble for the cultivation of microorganisms. Colloids and Surfaces B Biointerfaces. 106, 187-190 (2013).
  38. Arbatan, T., Al-Abboodi, A., Sarvi, F., Chan, P. P., Shen, W. Tumor inside a pearl drop. Advanced Healthcare Materials. 1 (4), 467-469 (2012).
  39. Sarvi, F., et al. Cardiogenesis of embryonic stem cells with liquid marble micro-bioreactor. Advanced Healthcare Materials. 4 (1), 77-86 (2015).
  40. Ledda, S., et al. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  41. Ooi, C. H., Nguyen, N. T. Manipulation of liquid marbles. Microfluid Nanofluid. 19, 483-495 (2015).
  42. Lin, P., Rui, R. Effects of follicular size and FSH on granulosa cell apoptosis and atresia in porcine antral follicles. Molecular Reproduction Development. 77 (8), 670-678 (2010).
  43. Eppig, J. J., O'Brien, M. J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles. Biology of Reproduction. 54 (1), 197-207 (1996).
  44. Dolmans, M. M., et al. Evaluation of Liberase, a purified enzyme blend, for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles. Human Reproduction. 21 (2), 413-420 (2006).
  45. Reader, K. L., Stanton, J. A., Juenge, J. L. The role of oocyte organelles in determining developmental competence. Biology. 6, 35-57 (2017).
  46. Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. Journal of Visualized Experiments. (49), e2695(2011).
  47. Aussillous, P., Quere, D. Liquid Marbles. Nature. 411, 924-927 (2001).
  48. Serrano, M. C., Nardecchia, S., Gutiérrez, M. C., Ferrer, M. L., del Monte, F. Mammalian cell cryopreservation by using liquid marbles. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 3854-3860 (2015).
  49. Arbatan, T., Li, L., Tian, J., Shen, W. Liquid marbles as micro-bioreactors for rapid blood typing. Advance Healthcare Materials. 1 (1), 80-83 (2012).
  50. Brevini, T. A. L., Manzoni, E. F. M., Ledda, S., Gandolfi, F. Use of a Super-hydrophobic Microbioreactor to Generate and Boost Pancreatic Mini Organoids. Organoids. Methods in Molecular Biology. Turksen, K. , Humana. New York, NY. 291-299 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة