يحدد هذا البروتوكول امتصاص التوازن وعمق الاختراق ومعدل الانتشار غير المتوازن لحاملي الببتيد الموجب في الغضاريف. توصيف خصائص النقل أمر حاسم لضمان استجابة بيولوجية فعالة. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتصميم ناقلات المخدرات مشحونة على النحو الأمثل لاستهداف الأنسجة المشحونة سلبا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
توصيف خصائص النقل داخل الغضاريف لحاملات الببتيد الموجب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العديد من الأنسجة المشحونة سلبا في الجسم، مثل الغضاريف، تشكل حاجزا أمام تسليم المخدرات المستهدفة بسبب كثافة عالية من aggrecans مشحونة سلبا، وبالتالي، تتطلب أساليب استهداف محسنة لزيادة استجابتها العلاجية. لأن الغضاريف لديها كثافة عالية تهمة ثابتة سلبية، يمكن تعديل الأدوية مع ناقلات المخدرات مشحونة بشكل إيجابي للاستفادة من التفاعلات الكهروستاتيكية، مما يسمح لتعزيز نقل المخدرات داخل الغضاريف. ولذلك، فإن دراسة نقل ناقلي المخدرات أمر بالغ الأهمية للتنبؤ بفعالية العقاقير في الحث على الاستجابة البيولوجية. نعرض تصميم ثلاث تجارب التي يمكن أن تحدد كمية امتصاص التوازن, عمق الاختراق وعدم التوازن معدل الانتشار من حاملات الببتيد الموجبة في explants الغضروف. توفر تجارب امتصاص التوازن مقياسًا لتركيز المذاب داخل الغضاريف مقارنة بالحمام المحيط به ، وهو مفيد للتنبؤ بإمكانات حامل الدواء في تعزيز التركيز العلاجي للأدوية في الغضاريف. عمق دراسات الاختراق باستخدام المجهر confocal تسمح للتمثيل البصري للانتشار 1D من منطقة سطحية إلى منطقة عميقة من الغضاريف، وهو أمر مهم لتقييم ما إذا كانت السولات تصل إلى المصفوفة ومواقعها المستهدفة الخلوية. دراسات معدل الانتشار غير المتوازن باستخدام غرفة نقل مصممة خصيصاً تمكن من قياس قوة التفاعلات الملزمة مع مصفوفة الأنسجة من خلال توصيف معدلات انتشار الفلورسنتات المسماة عبر الأنسجة؛ وهذا مفيد لتصميم الناقلين من قوة الربط الأمثل مع الغضاريف. وتوفر النتائج التي تم الحصول عليها معا من تجارب النقل الثلاث مبادئ توجيهية لتصميم ناقلات المخدرات المشحونة على النحو الأمثل التي تستفيد من تفاعلات الشحن الضعيفة والقابلة للعكس لتطبيقات توصيل المخدرات. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطرائق التجريبية لتقييم نقل المخدرات والاقترانات بين ناقلي المخدرات. علاوة على ذلك، يمكن تكييف هذه الأساليب للاستخدام في استهداف الأنسجة الأخرى المشحونة سلبا مثل الغضروف المفصلي والقرنية والفكاهة الزجاجي.
المقدمة
لا يزال تسليم المخدرات للأنسجة المشحونة سلبا في الجسم تحديا بسبب عدم قدرة المخدرات على اختراق عمق الأنسجة للوصول إلى الخلايا والمصفوفة المواقع المستهدفة1. العديد من هذه الأنسجة تتألف من كثيفة معبأة، واتهم سلبا aggrecans التي تخلق كثافة عالية تهمة ثابتة سالبة (FCD)2 داخل الأنسجة وتعمل كحاجز لتسليم معظم الجزيئاتالكبيرة 3،4. ومع ذلك، بمساعدة من حاملي المخدرات المشحونة إيجابيا، يمكن تحويل هذا الحاجز الأنسجة المشحونة سلبا في الواقع إلى مستودع للمخدرات عن طريق تفاعلات شحنة الكهربائية الساكنة للتسليم المستمر للمخدرات1،5،6،7( الشكل1).
الشكل 1: الشحن القائم على التسليم داخل الغضاريف من CPCs. الحقن داخل المفصل من CPCs في مساحة مفصل الركبة. التفاعلات الكهروستاتيكية بين CPCs مشحونة بشكل إيجابي ومجموعات aggrecan المشحونة بشكل سلبي تمكن من اختراق العمق السريع والكامل من خلال الغضاريف. وقد تم تعديل هذا الرقم من Vedadghavami وآخرون4. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في الآونة الأخيرة، قصير طول الببتيد حاملات (CPCs) تم تصميمها بهدف خلق مجالات الموجبة الصغيرة قادرة على حمل علاجات أكبر الحجم لتسليم الغضروف المشحونة سلبا4. للتسليم الفعال للأدوية إلى الغضروف لعلاج انتشار8,9 والأمراض التنكسية مثل هشاشة العظام (OA)10, فمن الأهمية بمكان أن تتغلغل التركيزات العلاجية للأدوية عميقا داخل الأنسجة, حيث غالبية خلايا الغضاريف (chondrocytes) تكمن11. على الرغم من أن هناك العديد من الأمراض المحتملة تعديل الأدوية المتاحة, لم يحصل أي موافقة ادارة الاغذية والعقاقير لأن هذه غير قادرة على استهداف الغضروف بشكل فعال12,13. ولذلك، فإن تقييم خصائص نقل ناقلي المخدرات ضروري للتنبؤ بفعالية الأدوية في الحث على الاستجابة العلاجية. هنا، قمنا بتصميم ثلاث تجارب منفصلة يمكن استخدامها لتقييم امتصاص التوازن، وعمق الاختراق، ومعدل الانتشار غير المتوازن لCSCS4.
لضمان وجود تركيز كاف من المخدرات داخل الغضاريف التي يمكن أن توفر استجابة علاجية مثلى، تم تصميم تجارب الامتصاص لتحديد التوازن تركيز CPC في الغضاريف4. في هذا التصميم، وبعد التوازن بين الغضروف والحمام المحيطة بها، يمكن تحديد المبلغ الإجمالي من المذاب داخل الغضروف (إما ملزمة إلى المصفوفة أو الحرة) باستخدام نسبة امتصاص. وتحسب هذه النسبة عن طريق تطبيع تركيز solutes داخل الغضاريف إلى أن من حمام التوازن. من حيث المبدأ، فإن السونات المحايدة، التي لا يساعدها التفاعلات الشحنية في انتشارها عبر الغضاريف، سيكون لها نسبة امتصاص أقل من 1. وعلى العكس من ذلك، فإن الوبلوتات الموجبة، التي يتم تعزيز نقلها عن طريق التفاعلات الكهروستاتيكية، تظهر نسبة امتصاص أكبر من 1. ومع ذلك ، كما هو مبين مع CPCs ، يمكن أن يؤدي استخدام الشحنة الإيجابية المثلى إلى نسب امتصاص أعلى بكثير (أكبر من 300)4.
على الرغم من أن تركيز المخدرات العالية داخل الغضروف مهم لتحقيق فائدة علاجية ، إلا أنه من المهم أيضًا أن تنتشر الأدوية من خلال السماكة الكاملة للغضاريف. ولذلك، هناك حاجة إلى دراسات تبين عمق الاختراق لضمان وصول الأدوية إلى عمق الغضاريف حتى يمكن الوصول إلى مواقع المصفوفة والخلايا المستهدفة، وبالتالي توفير علاج أكثر فعالية. وقد صُممت هذه التجربة لتقييم انتشار الوبات في اتجاه واحد من خلال الغضاريف، محاكياً انتشار المخدرات في الغضاريف بعد الحقن داخل المفصلي في الجسم الحي. يسمح التصوير الفلوري باستخدام المجهر الناسخ بتقييم عمق الاختراق في الغضاريف. صافي الجسيمات تهمة تلعب دورا رئيسيا في الاعتدال كيف المخدرات العميقة يمكن أن تنتشر من خلال المصفوفة. مطلوب الشحن الصافي الأمثل على أساس FCD الأنسجة للسماح لتفاعلات الربط ضعيفة قابلة للعكس بين الجسيمات الموجبة ومصفوفة الأنسجة anionic. وهذا يعني أن أي تفاعل ضعيف بما فيه الكفاية بحيث يمكن للجسيمات أن تنأى عن المصفوفة ولكن يمكن عكسها في الطبيعة بحيث يمكن ربطها بموقع ملزم آخر داخل النسيج4. وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تكون الشحنة الصافية الموجبة المفرطة للجسيمات ضارة نحو الانتشار، حيث أن ربط المصفوفة القوي جداً يمنع انفصال الجسيمات عن موقع الربط الأولي في المنطقة السطحية للغضاريف. وهذا من شأنه أن يؤدي إلى استجابة بيولوجية غير كافية لأن غالبية المواقع المستهدفة تقع في عمق الأنسجة11.
لمزيد من التحديد الكمي لقوة التفاعلات الملزمة ، فإن تحليل معدلات انتشار المخدرات من خلال الغضاريف مفيد. دراسات الانتشار غير المتوازن تسمح بمقارنة معدلات الانتشار في الوقت الحقيقي بين مختلف العاهرات. كما تنتشر المخدرات من خلال المناطق السطحية والوسطى والعميقة للغضاريف، وجود التفاعلات ملزمة يمكن أن تغير إلى حد كبير معدلات الانتشار. عندما تكون التفاعلات الملزمة موجودة بين الأدوية ومصفوفة الغضاريف ، يتم تعريفها على أنها الناشرة الفعالة (DEFF). في هذه الحالة، مرة واحدة وقد تم شغل جميع المواقع ملزمة، ويخضع معدل انتشار المخدرات من قبل انتشار ثابت الدولة (DSS). المقارنة بين DEFF من مذاب مختلفة يحدد قوة الربط النسبية من solutes مع المصفوفة. بالنسبة لملذاب معين، إذا كان DEFF وDSS ضمن نفس الترتيب من الحجم، فإنه يعني أن هناك الحد الأدنى من الربط الحالي بين المخدرات والمصفوفة أثناء الانتشار. ومع ذلك، إذا كان DEFF أكبر من DSS، فإن الربط الكبير للجسيمات إلى المصفوفة موجود.
التجارب المصممة تسمح بشكل فردي لتوصيف النقل المذاب من خلال الغضاريف ، ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تحليل شامل شامل لجميع النتائج لتصميم ناقل مخدرات مشحون على النحو الأمثل. تتحكم الطبيعة الضعيفة والقابلة للعكس في تفاعلات الشحن في معدل انتشار الجسيمات وتسمح باستخلاص توازن عالي واختراق العمق الكامل السريع من خلال الغضاريف. ومن خلال تجارب امتصاص التوازن، ينبغي أن نبحث عن حاملات تظهر درجة عالية من الإقبال نتيجة لتفاعلات الشحن التي يمكن التحقق منها باستخدام دراسات معدل الانتشار غير المتوازن. ومع ذلك، ينبغي أن تكون هذه التفاعلات ملزمة ضعيفة وعكسها في الطبيعة للسماح لاختراق كامل سمك من المنقلب من خلال الغضاريف. الناقل المثالي للمخدرات تمتلك تهمة الأمثل الذي يتيح قوية بما فيه الكفاية ملزمة لامتصاص وارتفاع داخل الغضاريف المخدرات التركيزات، ولكن ليس قوية جدا لعرقلة نشر كامل سمك4. وستساعد التجارب المعروضة في خصائص تصميم الأنسجة القائمة على الرسوم التي تستهدف حاملي المخدرات. وقد استخدمت هذه البروتوكولات لتميز نقل الحزب الشيوعى الصينى من خلالالغضروف 4، ومع ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه على مجموعة متنوعة من المخدرات وحاملي المخدرات من خلال الغضاريف وغيرها من الأنسجة المشحونة سلبا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على موافقات الجامعة لإجراء التجارب على الأنسجة الميتة. تم الحصول على مفاصل الأبقار تجاريا من المسلخ.
1- استخراج الغضاريف
- باستخدام مشرط (#10 شفرة)، وقطع وإزالة الدهون والعضلات والأربطة والأوتار وجميع الأنسجة الضامة الأخرى لفضح الغضروف من الأخدود فيموروباتيلار من مفاصل الركبة البقرية.
- باستخدام 3 مم و 6 ملم اللكمات الجلدية، وجعل اللكمات عمودي في الغضاريف لاستخراج المقابس أسطواني. ضع على الفور المقابس في الآبار الفردية من لوحة 48 بئرًا تحتوي على 500 ميكرولتر من محلول الفوسفات الاحتياطي 1x (PBS) المكملة بنسبة 1٪ v/v مضاد للمضادات الحيوية.
- وضع الجانب السطحي من المكونات الغضروف التي تواجهها إلى أسفل إلى بئر في لاعبا اساسيا تشريح (الشكل 2). باستخدام شفرة حلاقة، شريحة المكونات على طول سطح لاعبا اساسيا تقطيع للحصول على explant غضروف سميكة 1 مم التي تشمل المنطقة السطحية. كرر كل غضروف المكونات.
- غضروف التخزين explants بشكل فردي في أنابيب البولي بروبلين التي تحتوي على 500 ميكرولتر من 1X PBS تكملها مثبطات البروتياز (PBS-PI, 1 PI مصغرة قرص لكل 50 مل 1X PBS) في -20 درجة مئوية.
- قبل إجراء كل من تجارب النقل التالية، اذيب القنينات التي تحتوي على explant لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
الشكل 2: مصممة خصيصا fixture تقطيع. المعلمات تصميم الفولاذ المقاوم للصدأ تشريح لاعبا اساسيا تستخدم لتشريح explants الغضروف من 3 و 6 ملم القطر. تم وضع إدراجات بلاستيكية ذات سمك متفاوت داخل الآبار لضبط سمك explants شرائح. تم استخدام دبوس أسطواني الفولاذ المقاوم للصدأ من < 1 مم القطر لدفع explant للخروج من لاعبا اساسيا. يتم عرض جميع القيم العددية في مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
2- اتقم توازن انكماش الانبعاثات الكيميائية في الغضاريف
- الداب بلطف explantage (3 مم dia. X 1 مم سميكة.) مع مسح مهمة حساسة لإزالة برنامج تلفزيوني 1X الزائدة من سطح explant. باستخدام التوازن، سجل بسرعة الوزن الرطب لكل explant ثم وضع على الفور في حمام برنامج تلفزيوني 1x لمنع الجفاف.
- إعداد 30 μM الحلول (300 ميكرولتر لكل explant) من الفلورسنت المسمى CPCs في 1x PBS-PI. استخدام أنابيب البولي بروبلين الخالية من RNase لإعادة تشكيلها.
- في لوحة 96-well، ماصة 300 ميكرولتر من كل 30 ميكرومتر الحل في آبار منفصلة. تجنب استخدام الآبار بالقرب من حافة الصفيحة لمنع التبخر. باستخدام ملعقة، نقل كل explant إلى الحل الذي يحتوي على الآبار.
- املأ الآبار المحيطة بـ 300 ميكرولتر من 1x PBS واغطي لوحة البئر بالغطاء. ختم حواف لوحة مع فيلم مرنة للحد من التبخر.
- داخل حاضنة 37 درجة مئوية، ضع اللوحة على لوحة شاكر للحد من ترسيب الجسيمات. احتضان لمدة 24 ساعة تحت تناوب لطيف (50 دورة في الدقيقة مع مدار 15 ملم) للسماح باستيعاب التوازن من CPCs في الغضاريف(الشكل 3).
- إنشاء منحنى قياسي للارتباط من الفلوريسكين لتركيز CPC
- إعداد التخفيفات التسلسلية من حلول CPC من 30 ميكرومتر – 0 μM (10 2 أضعاف التخفيف) في 1x PBS-PI في أنابيب البولي بروبلين. تأكد من وجود ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من كل تخفيف.
- أضف 200 ميكرولتر من كل تخفيف إلى آبار متتالية في لوحة سوداء 96 بئرًا. مكررة في صف آخر لزيادة حجم العينة.
- الحصول على قراءات الفلوريسنس لكل عينة باستخدام قارئ لوحة في الإثارة والطول الموجي للانبعاثات من التسمية الفلورية باستخدام قارئ لوحة.
- رسم قراءة الفلوريسين مقابل تركيز CPC واستمد معادلة للجزء الخطي من المنحنى.
ملاحظة: للحد من التغير في قراءات الفلوريسين، احتضان حل الأسهم CPC في ظل نفس الظروف مثل لوحة العينة قبل توليد المنحنى القياسي.
- بعد 24 ساعة من الحضانة، وجمع حمام التوازن من كل بئر في أنابيب البولي بروبلين منفصلة.
- نقل 200 ميكرولتر من كل حل إلى آبار منفصلة من لوحة سوداء 96-جيدا. الحصول على قراءات الفلوريسنس لكل عينة تحت نفس إعدادات الفلورسنت كما هو الحال بالنسبة للمنحنى القياسي. إذا لزم الأمر، قم بتخفيف العينة في 1x PBS-PI لضمان أن القراءات تقع ضمن الجزء الخطي من المنحنى القياسي.
الشكل 3: التخطيطي لتجارب امتصاص التوازن. وضعت explants الغضاريف (3 مم dia. x 1 مم) في آبار الأفراد في لوحة 96-well تحتوي على حل CPC الموسومة بالفلورسنت. بعد 24 تم upence ح تم upence بواسطة الغضاريف، وبالتالي تقليل الفلورس من الحمام المحيطة بها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. عمق اختراق CPCs في الغضاريف
- إعداد 30 μM الحلول (300 ميكرولتر لكل explant) من الفلورسنت المسمى CPCs في 1x PBS-PI. استخدام أنابيب البولي بروبلين الخالية من RNase لإعادة تشكيلها.
- باستخدام مشرط، وقطع explants الغضروف (6 مم قطرها × 1 مم سمك) في النصف لجعل نصف الأقراص. حافظ على رطوبة explant مع طبقة من 1x PBS-PI أثناء القطع.
- الغراء explant نصف القرص في منتصف بئر واحدة من غرفة النقل 1-الأبعاد المصممة خصيصا باستخدام الايبوكسي(الشكل 4، الشكل 5). ضمان تطبيق الايبوكسي على الجانب المحيطي (المنحني) من explant. إزالة الغراء الزائد من البئر لمنع الاتصال مع منطقة سطح الانتشار للغضاريف وتقديم مذكرة من الجانب السطحي من explant.
- إضافة 80 ميكرولتر من 1X PBS-PI إلى كلا الجانبين من explant. الماصات السائل صعودا وهبوطا من جانب واحد من explant للتحقق من تسرب إلى الجانب الآخر. إذا حدث تسرب، إعادة تعديل explant وتطبيق الايبوكسي حسب الحاجة.
- استبدل 1x PBS-PI من الجانب الذي يواجه السطح السطحي للغضاريف (المنبع) بـ 80 ميكرولتر من محلول CPC 30 ميكرومتر. الحفاظ على 80 ميكرولتر من 1x PBS-PI على الجانب الذي يواجه المنطقة العميقة من الغضاريف (المصب).
- ضع غرفة النقل بعناية في حاوية قابلة للغطاء. تغطية قاعدة من الحاوية مع طبقة 1X برنامج تلفزيوني لتجنب تبخر الحلول. تأكد من عدم وجود اتصال مباشر بين الحلول من غرف المنبع والمصب.
- ضع الحاوية المغطاة على لوحة شاكر للحد من ترسيب الجسيمات. احتضان إما 4 أو 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة تحت تناوب لطيف (50 دورة في الدقيقة مع مدار 15 ملم).
- بعد الحضانة، وإزالة explant من الغرفة وقطع ~ 100 μm شريحة من وسط explant.
ملاحظة: هذا المقطع عرضية شاملة من المناطق السطحية والوسطى والعميقة للغضاريف. - ضع الشريحة بين شريحة زجاجية وأغطية. هيدرات شريحة مع طبقة من 1x PBS-PI.
- في التكبير 10x، صورة من خلال سمك كامل من شريحة للحصول على z-كومة من الصور الفلورية باستخدام المجهر confocal.
- باستخدام مشروع ImageJ متوسط كثافة الصور داخل المكدس z لتحديد عمق اختراق CPCs في الغضاريف.
- فتح كومة الصورة عن طريق النقر على ملف | مفتوح.
- انقر على 'صورة' على شريط المهام وانقر على صورة | مداخن | Z المشروع من القائمة المنسدلة.
- إدخال أرقام شريحة من 1 إلى الشريحة النهائية. حدد'متوسط الكثافة'ضمن نوع العرض. انقر على'موافق.'
الشكل 4: غرفة النقل 1-D المصممة خصيصًا. المعلمات تصميم من غرفة النقل PMMA 1D مع 6 آبار فردية. يتم عرض جميع القيم العددية في مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: التخطيطي لعمق دراسات الاختراق. تم قطع explants الغضاريف (6 مم قطر × 1 ملم سمك) في النصف وثابتة في مركز 1-D آبار النقل الناشر. تم إضافة حل CPC الموسومة بفلورسنتلي إلى جانب البئر على اتصال بالمنطقة السطحية (SZ) من الغضاريف. 1x PBS-PI تمت إضافتها إلى جانب البئر على اتصال مع المنطقة العميقة (DZ) من الغضاريف. وبعد الانتشار، تم تصوير مقطع عريض من الغضاريف (3 مم × 1 مم) باستخدام المجهر الناثق. وقد تم تعديل هذا الرقم من Vedadghavami etal. 4 و Bajpayee etal. 3،يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4- معدل انتشار الانبعاثات غير المتوازنة من اصنـاء الـ CPCs في الغضاريف
- جلب نصفي غرفة النقل المصممة خصيصا (الشكل 6) معا لتجميع وإغلاق الغرفة. استخدام غسالات، والمكسرات والبراغي لإغلاق بإحكام الغرفة مع وجع.
ملاحظة: يجب أن تكون غرفة النقل شفافة لعدم التعارض مع القراءات الفلورية. غرف النقل المستخدمة في هذا البروتوكول مصنوعة من بولي ميثيلميتهاكريلات (PMMA). - معطف المساحة الداخلية للغرفة مع 0.5٪ ث / V حل الحليب البقري غير الدهني في 1X PBS (2 مل لكل غرفة) لمدة 15 دقيقة لمنع ربط غير محددة من CPCs إلى جدران الغرفة. ثم شطف الغرفة مع 1X PBS (2 مل لكل غرفة).
- باستخدام لاعبا اساسيا التقطيع المصممة خصيصا (الشكل 2) وشفرة الحلاقة ، شريحة explant غضروف قطر 6 مم (الطائرة العرضية) إلى سمك 500-800 μm ، بما في ذلك المنطقة السطحية. حافظ على explant رطب مع 1x PBS.
- باستخدام اللكمات التي تحركها المطرقة والجلد، وخلق الحشيات من صفائح مطاطية كما هو مبين في الشكل 7.
- تجميع كل غرفة نصف النقل لتشمل 1 طوقا مطاطيا كبيرا، 1 PMMA إدراج و 1 طوقا مطاطي صغير لكل من. وضع explant في آبار إدراج البلاستيك، مع منطقة سطحية تواجه غرفة المنبع. ساندويتش نصفين معا لإكمال الجمعية والمسمار بإحكام باستخدام وجع (الشكل 7).
- ملء غرفة المنبع مع 2 مل من 1X PBS-PI ومراقبة غرفة المصب لتسرب السوائل من غرفة المنبع. إذا كان التسرب موجودًا ، إعادة تجميع الغرفة ، وتعديل موضع طوقاً وضيق البراغي. إذا لم يكن تسرب، ملء غرفة المصب مع 2 مل 1X PBS-PI كذلك.
- يُضاف بار صغير إلى غرف أعلى وهاب النهر وضع الغرفة على لوحة مقلّد. محاذاة الغرفة بحيث يتم تركيز الليزر من مقياس الطيف الضوئي نحو مركز غرفة المصب. ضع جزء مستقبل الإشارة من مقياس الطيف الضوئي خلف غرفة المصب(الشكل 8).
ملاحظة: يجب أن يكون الليزر والمستلم من مقياس الطيف مجهزة المرشحات المناسبة لإثارة، وتنبعث منها ونقل الإشارات من البروتين المسمى الفلورسنت. حماية غرفة النقل من الضوء باستخدام صندوق أسود أثناء التجريب لتجنب التداخل في إشارة الفلوريسنس. ومن أفضل الممارسات لختم فتحات على رأس الغرفة مع فيلم مرنة لتجنب التبخر. - جمع في الوقت الحقيقي قراءات الانبعاثات الفلورية المصبّيّة وضمان إشارة مستقرة لمدة 5 دقائق على الأقل.
ملاحظة: يمكن الحصول على Aliquots من غرفة المصب وتقييمها لفلوريسنس باستخدام قارئ لوحة إذا لم يتوفر مقياس الطيف أو غرفة النقل الشفافة المصممة خصيصًا. - Pipette حجم محتسب مسبقا من محلول المخزون من الفلورسنت الموسومة CPCs في غرفة المنبع لضمان تركيز نهائي من 3 μM داخل غرفة المنبع. مراقبة إشارة المصب fluorescence والسماح للنقل المذاب للوصول إلى زيادة مطردة في المنحدر.
ملاحظة: سوف explant الغضروف سمكا تتطلب وقتا أطول للوصول إلى حالة ثابتة. - بمجرد أن يتم الوصول إلى حالة ثابتة، خذ 20 ميكرولتر من غرفة المنبع وأضيف إلى غرفة المصب ("اختبار الارتفاع").
ملاحظة: سيتم ملاحظة ارتفاع في الفلورس المصب. وهذا سيسمح للارتباط بين قراءات الفلوريسنس وتركيزات الـ CPC. - جمع قراءات الفلورانس في الوقت الحقيقي.
الشكل 6: غرفة نقل غير متوازنة مصممة خصيصاً. المعلمات تصميم من PMMA غير التوازن في نقل غرفة. يجب أن تكون الغرفة شفافة لعدم التدخل في قراءات الفلوريسنس. وتألفت غرفة النقل كاملة من نصفين متطابقة من لاعبا اساسيا هو مبين. وكان هناك حاجة إلى اثنين من دبابيس الفولاذ المقاوم للصدأ أسطواني (~ 2.94 ملم قطر، ~ 18 مم طويلة) لضمان المحاذاة والإغلاق الكامل لنصفي الغرفة. وأدلت أربع فتحات متطابقة ل6-32 مسامير الموضوع في كل ركن من أركان الغرفة لتجميع ضيق المسمار. يتم عرض جميع القيم العددية في ملليمتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: غرفة نقل غير اتزانية غير مُزَوّرة. المعلمات تصميم (A) إدراج PMMA أسود و (B) حشيات مطاطية كبيرة وصغيرة. تم تعديل سمك الحشيات المطاطية لضمان الإغلاق المحكم للغرفة. يتم عرض جميع القيم العددية في mm. (C) التخطيطي تبين ترتيب التجمع لاثنين من نصفي غرفة النقل مع extilage وضعت في المركز. يشير SZ إلى منطقة سطحية من الغضاريف التي كانت تواجه غرفة المنبع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التخطيط لتجارب الانتشار غير المتوازن. وضعت explants الغضروف (6 مم قطر × 1 مم سمك) في وسط غرفة النقل مع سطح سطحية تواجه غرفة المنبع. تم ملء كلا الجانبين صعودا وهبوطا من الغرفة مع 1x PBS-PI ومختلطة باستخدام شريط ضجة مصغرة. مع ليزر وأشار نحو غرفة المصب لجمع قراءات الفلورسنت، تم إضافة حل CPC الموسومة الفلورية إلى غرفة المنبع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد امتصاص التوازن من CPCs عن طريق الغضاريف، وفلورية الحمام يقلل عندما تم upute upute من الأنسجة. ومع ذلك، إذا كانت قيمة الفلوريسنس من الحمام النهائي لا تزال مماثلة للاولى، فإنه يشير إلى أنه لا يوجد أي /الحد الأدنى من امتصاص المذاب. تأكيد آخر من امتصاص مذاب هو إذا كان النسيج قد تغير اللون بشكل واضح إلى لون الصبغة الفلورية. تم تحديد الامتصاص الكمي للسولات في الغضاريف باستخدام نسبة الامتصاص (RU)بعد تحويل قيم الفلورس إلى تركيز باستخدام المنحنى القياسي. باستخدام تركيز الحمام الأولي (CBath,i)وتركيز حمام ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
10- إن الأساليب والبروتوكولات المذكورة هنا هامة في مجال تسليم الأدوية المستهدفة للأنسجة المشحونة سلباً. بسبب الكثافة العالية لل aggrecans المشحونة سلبا الموجودة في هذه الأنسجة، يتم إنشاء حاجز، وبالتالي منع الأدوية من الوصول إلى مواقعها المستهدفة الخلوية التي تقع في عمق المصفوفة. للتصدي لهذا التحدي المعلق، يمكن تعديل الأدوية لدمج ناقلات المخدرات المشحونة بشكل إيجابي والتي يمكن أن تعزز معدل نقل، الامتصاص والتجليد من المخدرات داخل الأنسجة1،,3،,
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الدفاع الأمريكية من خلال برامج البحوث الطبية الموجهة من الكونغرس (CDMRP) بموجب العقد W81XWH-17-1-0085، والمعهد الوطني للصحة R03 EB025903-1. تم تمويل AV من قبل زمالة عميد كلية الهندسة في جامعة نورث إيسترن.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 316 غسالة SAE من الفولاذ المقاوم | McMaster-Carr | 91950A044 | لحجم المسمار رقم 5 ، 0.14 "معرف ، 0.312" OD |
| 96-Well Polystyrene Plate | Fisherbrand | 12566620 | أسود |
| أكريليك سميك ورقة | قياس رينولدز بوليمر | N / A | لانتشار غير التوازن وغرفة نقل الانتشار 1-D |
| المضادات الحيوية ومضادات | Gibco | 15240062 | 100x |
| الغضروف البقري | 87 | N / A | 2-3 أسابيع ، أخدود الفخذ |
| مصل الأبقار الألبومين | فيشر الكواشف الحيوية | BP671-1 | |
| CPC + 14 | LifeTein | LT1524 | مصمم خصيصا الببتيد |
| CPC + 20 | LifeTein | LT1525 | مصمم خصيصا الببتيد |
| CPC + 8 | LifeTein | LT1523 | مخصص صممت ببتيد |
| مساحات المهام الحساسة | كيمبرلي كلارك المهنية | 34155 | |
| لكمة جلدية | MedBlades | MB5-1 | 3 و 4 و 6 مم |
| شرائح مجهر زجاجي عادي اقتصادي | Fisherbrand | 12550A3 | |
| لوحات ثقافة الخلية ذات القاع المسطح | Corning Costar | 3595 | واضح ، 96 جيدا |
| فيلم تغليف مرن | Bemis Parafilm M مختبر | 1337412 | |
| غطاء الختم الذهبي علوم المجهر الإلكتروني الزجاجي | 6378701 | # 1.5 ، 18x18 مم | |
| ثقب بمطرقة | لكمة McMaster-Carr | 3427A15 | 1/2 "ثقب ثقب بمطرقة |
| McMaster-Carr | 3427A19 | 3/4 "تقنية | |
| الليزر | Chroma | AT480 / 30m | الطيف الضوئي ليزر ضوء |
| منخفض القوة الصلب عرافة الجوز | ماكماستر كار | 90480A007 | 6-32 حجم الخيط |
| LSM 700 مجهر متحد البؤر | Zeiss | LSM 700 | |
| قضبان التحريك المغناطيسية | الدقيقة Bel-Art Spinbar | F37119-0007 | 7x2 مم |
| لوح مطاط النيوبرين متعدد الأغراض | McMaster-Carr | 1370N12 | 1/32 "سمك |
| حليب البقر المجفف غير الدسم | Sigma Aldrich | M7409 | |
| Petri Dish | Chemglass Life Sciences | CGN1802145 | قطر 150 مم |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات | Corning | 21-040-CMR | 1x |
| لوحة شاكر | VWR | 89032-088 | |
| مثبطات الأنزيم | البروتيني Thermo Scientific | A32953 | |
| شفرات الحلاقة | Fisherbrand | 12640 | |
| R-Cast الاكريليك رقيقة مقياس ورقة | رينولدز بوليمر | N / A | غرفة النقل السوداء إدراج RTV |
| سيليكون | لوكتايت | 234323 | الايبوكسي ، غير قابلة للتآكل ، مشرط واضح |
| TedPella | 549-3 | # 10 ، # 11 شفرات | |
| استقبال إشارة | تقنية | Chroma ET515lp | الطيف الضوئي جهاز استقبال إشارة الليزر |
| Snap-Cap Microcentrifuge أنابيب | Eppendorf | 22363204 | 1.5 مل |
| ملعقة | TedPella | 13508 | |
| Synergy H1 Microplate Reader | Biotek | H1M | |
| رأس مقبس من سبائك الصلب مطلي بالزنك | McMaster-Carr | 90128A153 | 6-32 حجم الخيط ، 1 بوصة طويلة |
المراجع
- Bajpayee, A. G., Grodzinsky, A. J. Cartilage-targeting drug delivery: can electrostatic interactions help. Nature Reviews Rheumatology. 13 (3), 183-193 (2017).
- Maroudas, A. Transport of solutes through cartilage: permeability to large molecules. Journal of Anatomy. 122, Pt 2 335-347 (1976).
- Bajpayee, A. G., Wong, C. R., Bawendi, M. G., Frank, E. H., Grodzinsky, A. J. Avidin as a model for charge driven transport into cartilage and drug delivery for treating early stage post-traumatic osteoarthritis. Biomaterials. 35 (1), 538-549 (2014).
- Vedadghavami, A., et al. Cartilage penetrating cationic peptide carriers for applications in drug delivery to avascular negatively charged tissues. Acta Biomaterialia. 93, 258-269 (2019).
- Mehta, S., Akhtar, S., Porter, R. M., Önnerfjord, P., Bajpayee, A. G. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1Ra) is more effective in suppressing cytokine-induced catabolism in cartilage-synovium co-culture than in cartilage monoculture. Arthritis Research & Therapy. 21 (1), 238(2019).
- Vedadghavami, A., Zhang, C., Bajpayee, A. G. Overcoming negatively charged tissue barriers: Drug delivery using cationic peptides and proteins. Nano Today. 34, 100898(2020).
- Young, C. C., Vedadghavami, A., Bajpayee, A. G. Bioelectricity for Drug Delivery: The Promise of Cationic Therapeutics. Bioelectricity. , (2020).
- Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
- Wieland, H. A., Michaelis, M., Kirschbaum, B. J., Rudolphi, K. A. Osteoarthritis - An untreatable disease. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (4), 331-344 (2005).
- Martel-Pelletier, J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 7 (4), 371-373 (1999).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Chevalier, X., et al. Intraarticular injection of anakinra in osteoarthritis of the knee: A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled study. Arthritis Care and Research. 61 (3), 344-352 (2009).
- Cohen, S. B., et al. A randomized, double-blind study of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R1) in patients with osteoarthritis of the knee. Arthritis Research and Therapy. 13 (4), 125(2011).
- Evans, C. H., Kraus, V. B., Setton, L. A. Progress in intra-articular therapy. Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 11-22 (2014).
- He, T., et al. Multi-arm Avidin nano-construct for intra-cartilage delivery of small molecule drugs. Journal of Controlled Release. 318, 109-123 (2020).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. A rabbit model demonstrates the influence of cartilage thickness on intra-articular drug delivery and retention within cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 33 (5), 660-667 (2015).
- Bajpayee, A. G., Quadir, M. A., Hammond, P. T., Grodzinsky, A. J. Charge based intra-cartilage delivery of single dose dexamethasone using Avidin nano-carriers suppresses cytokine-induced catabolism long term. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (1), 71-81 (2016).
- Zhang, C., et al. Avidin-biotin technology to synthesize multi-arm nano-construct for drug delivery. MethodsX. , 100882(2020).
- Wagner, E. K., et al. Avidin grafted dextran nanostructure enables a month-long intra-discal retention. Scientific Reports. 10.1, 1-14 (2020).
- Troeberg, L., Nagase, H. Proteases involved in cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1824 (1), 133-145 (2012).
- Kirk, T. B., Wilson, A. S., Stachowiak, G. The effects of dehydration on the surface morphology of articular cartilage. Journal of Orthopaedic Rheumatology. 6 (2-3), 75-80 (1993).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Solute transport across a contact interface in deformable porous media. Journal of Biomechanics. 45 (6), 1023-1027 (2012).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. Journal of Biomechanics. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Zadpoor, A. A., Weinans, H. An experimental and finite element protocol to investigate the transport of neutral and charged solutes across articular cartilage. Journal of Visualized Experiments. 2017 (122), (2017).
- Sampson, S. L., Sylvia, M., Fields, A. J. Effects of dynamic loading on solute transport through the human cartilage endplate. Journal of Biomechanics. 83, 273-279 (2019).
- Bajpayee, A. G., Scheu, M., Grodzinsky, A. J., Porter, R. M. Electrostatic interactions enable rapid penetration, enhanced uptake and retention of intra-articular injected avidin in rat knee joints. Journal of Orthopaedic Research : Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 32 (8), 1044-1051 (2014).
- Bajpayee, A. G., et al. Sustained intra-cartilage delivery of low dose dexamethasone using a cationic carrier for treatment of post traumatic osteoarthritis. European Cells & Materials. 34, 341-364 (2017).
- Malda, J., et al. Of Mice, Men and Elephants: The Relation between Articular Cartilage Thickness and Body Mass. PLoS One. 8 (2), 57683(2013).
- Frisbie, D. D., Cross, M. W., McIlwraith, C. W. A comparative study of articular cartilage thickness in the stifle of animal species used in human pre-clinical studies compared to articular cartilage thickness in the human knee. Veterinary and Comparative Orthopaedics and Traumatology. 19 (3), 142-146 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
