مقالة منهجية

تصوير كهربية الدماغ بالفيديو المستمر أثناء نقص الأكسيجة -الإقفارية في فئران حديثي الولادة

DOI:

10.3791/61346

⸱

يونيو 11, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Virginia, 2Department of Neurology, University of Virginia, 3Neuroscience Graduate Program, University of Virginia, 4Brain Institute, University of Virginia, 5Department of Neuroscience, University of Virginia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المخطوطة طريقة لتسجيلات تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو المستمر باستخدام أقطاب عمق متعددة في فئران حديثي الولادة التي تعاني من نقص الأكسيجة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقص الأكسيجة هو السبب الأكثر شيوعا للنوبات حديثي الولادة. النماذج الحيوانية حاسمة لفهم الآليات وعلم وظائف الأعضاء الكامنة وراء نوبات حديثي الولادة ونقص الأكزجة. تصف هذه المخطوطة طريقة لرصد تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو المستمر (EEG) في فئران حديثي الولادة للكشف عن النوبات وتحليل خلفية تخطيط كهربية الدماغ أثناء نقص التروية. استخدام الفيديو وEEG بالتزامن يسمح وصفا للنوبة السيمولوجيا وتأكيد المضبوطات. كما تسمح هذه الطريقة بتحليل مطيافات الطاقة واتجاهات نمط خلفية تخطيط كهربية الدماغ خلال الفترة الزمنية التجريبية. في هذا النموذج نقص الأكزجة نقص التروية، تسمح الطريقة تسجيل تخطيط كهربية الدماغ قبل الإصابة للحصول على خط أساس معياري وأثناء الإصابة والتعافي. ويحد من إجمالي وقت الرصد عدم القدرة على فصل الجراء عن الأم لأكثر من أربع ساعات. على الرغم من أننا استخدمنا نموذجا للنوبات نقص الأكز الإقفاري في هذه المخطوطة ، إلا أن هذه الطريقة لمراقبة تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو الوليدي يمكن تطبيقها على نماذج متنوعة من الأمراض والنوبات في القوارض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتلال الدماغ نقص الأكزمي (HIE) هو حالة تؤثر على 1.5 في 1000 حديثي الولادة سنويا وهو السبب الأكثر شيوعا للنوبات حديثي الولادة1,2. الرضع الذين يبقون على قيد الحياة معرضون لخطر الإعاقات العصبية المختلفة مثل الشلل الدماغي، والإعاقة الذهنية، والصرع3,4,5.

تلعب النماذج الحيوانية دورا حاسما في فهم الفيزيولوجيا المرضية لنقص الأكفاشيا ونوبات حديثي الولادة والتحقيق فيها6,7. يستخدم نموذج فانوتشي المعدل للحث على نقص التروية (HI) في يوم ما بعد الولادة 10 (p10)7,8. الجراء الماوس من هذا العصر تترجم عصبيا تقريبا إلى مصطلح كامل حديثي الولادة الإنسان9.

يسمح الرصد المستمر للتصوير الكهربائي ل الدماغ بالفيديو (EEG) المستخدم بالتزامن مع نموذج الإصابة هذا بمزيد من الفهم والتوصيف للنوبات الإقفارية نقص الأكز الوليدي. استخدمت الدراسات السابقة أساليب مختلفة لتحليل نوبات حديثي الولادة في القوارض، بما في ذلك تسجيلات الفيديو وتسجيلات تخطيط كهربية الدماغ المحدودة وتسجيلات تخطيط كهربية الدماغ عن بعد10,11,12,13,14,15,16. في المخطوطة التالية، نناقش بعمق عملية تسجيل الفيديو المستمر تخطيط كهربية الدماغ في جراء الماوس أثناء نقص الأكxia-الإقفارية. يمكن تطبيق هذه التقنية لمراقبة تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو المستمر في جراء الفئران الوليدية على مجموعة متنوعة من نماذج الأمراض والنوبات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الدراسات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في جامعة فرجينيا.

1. بناء القطب / بناء الكابل

  1. استخدم سلكا أحادي القطب معزولا من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطره 0.005 بوصة، 0.008 بوصة مغلف) لصنع قطب كهربائي متصل بموصل مأخذ أنثى (موصل وعاء الإناث 0.079).
  2. استخدم كابلا خاصا مخصصا لتوصيل الحيوانات بالمكبر.
    1. إرفاق موصل 4 دبوس الذكور (موصل الذكور 0.079") إلى 4 قناة وحدة كسب مقاومة مطابقة مكبر للصوت التشغيلية (op-amp). قم بتوصيل مقاومة 10K بالأسلاك التي تتصل ببطارية 9 V. يعمل السلك الأرضي غير المتصل بالوظيفة كنقطة وسط للبطارية.
    2. قم بتوصيل أحد طرفي الكبل (AWG، 0.012 بوصة OD) بالوظيفة الافتتاحية وتوصيل الطرف الآخر من الكبل بالمكبر.

2. جراحة زرع الأقطاب الكهربائية

  1. تخدير الجرو (بعد الولادة اليوم 9) مع 4-5٪ isoflurane في غطاء محرك السيارة تدفق الهبوط. قبل بدء الإجراء، حقن الجراء مع bupivacaine (0.02-0.05 مل، 0.25٪ تسلل محلي تحت الجلد).
  2. بمجرد أن يصبح الحيوان غير متحرك ، قم بنقله إلى مرحلة مجسمة مع مخروط الأنف. استخدم الجانب العكسي من شريط الأذن لأنه ناعم لتثبيت الرأس. في هذا العمر ، لا يكون لدى الجراء أذن متطورة تماما لاستخدام الطرف المدبب لشريط الأذن.
  3. رفض تدفق ايزوفلوران والحفاظ عليه في 2.5-3٪. إبقاء العين على التنفس المطرد للجرو طوال عملية جراحية. قرصة الذيل للتحقق من استجابة الألم ومن ثم المضي قدما إلى شق.
  4. تعقيم منطقة شق على الجمجمة مع بيتادين والكحول (3 دورات من اليود بالتناوب و 70٪ الإيثانول). الستائر الجزء المحيطة بها من الجسم بحيث منطقة شق مرئيا.
  5. افتح فروة الرأس الأمامية الخلفية من أعلى العينين قليلا وتراجع عن الجلد حوالي 0.5 سم. إعادة وضع رأس الماوس على مرحلة ستيريوتاكسيك بحيث يسحب الجلد الجمجمة تعريض الخارج.
  6. تطبيق بيروكسيد الهيدروجين على الجمجمة باستخدام مسحة القطن وكشط الجمجمة نظيفة باستخدام شفرة مشرط. الجمجمة لينة جدا. توخي الحذر أثناء كشط.
  7. تطبيق قطرة واحدة (حوالي 50 ميكرولتر) من لاصقة ونشرها في جميع أنحاء منطقة الجمجمة المكشوفة باستخدام قضيب لها. تعريض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 40 ق لضبط لاصقة.
  8. قياس الإحداثيات باستخدام bregma المكشوفة كمرجع. زرع أقطاب كهربائية ثنائيا في منطقة CA1 من قرن آمون [-3.5 ملم دورسال-فنترال (DV)، ±2 ملم الوسطي الجانبي (ML)، -1.75 ملم عميق (D)] والثنائية في القشرة الجدارية [-1.22 ملم DV، ±0.5 ملم ML، -1 ملم D] والقطب المرجعي في المخيخ17. استخدم إبرة 32 G لإنشاء ثقب في المنطقة المعلمة.
  9. نظف الدم من سطح الجمجمة أقطاب كهربائية أقل تعلق على موصل مأخذ الإناث في الدماغ بمساعدة الذراع ستيريوتاكسيك وإصلاح في مكان مع الاكريليك الأسنان. زرع القطب الكهربائي في الدماغ. سماعة موصل مأخذ يجلس على رأس الجمجمة لصقها معا عن طريق الاكريليك الأسنان.
  10. حقن الكيتوبروفين (5 ملغم/كغ) تحت الجلد في المنطقة بين الكبسولات بمجرد إصلاح القطب الكهربائي. ضع الجراء مرة أخرى مع الأم.
    ملاحظة: تقديم نصف القمامة مع سماعة الرأس في وقت واحد للأم بدلا من تقديمها واحدة في وقت واحد. وهذا سيمنع من الأم إتلاف سماعة الرأس الجرو.

3. إعداد EEG وتسجيل (خط الأساس / ما قبل الإصابة)

  1. بعد 24 ساعة من الانتعاش بعد زرع القطب، ضع كل في غرفة Plexiglas ساخنة (37 درجة مئوية) مصنوعة خصيصا لتسجيل تخطيط كهربية الدماغ. هذه الغرفة ستكون أيضا بمثابة غرفة نقص الأكxia.
  2. قم بتوصيل الجراء في الغرفة بنظام مراقبة فيديو-تخطيط كهربية الدماغ عبر كابل مرن (كابل op-amp مخصص).
    ملاحظة: مع سماعة الرأس في مكان، الفئران هي بحرية المحمول ولا تظهر أي اختلافات في السلوك. بمجرد تركيبها على أسلاك القطب الكهربائي ، يجب تعديل الأسلاك داخل حبل الغرفة من أجل توفير الكمية المناسبة من الركود بحيث يمكن للجرو التحرك بحرية في جميع أنحاء الغرفة.
  3. رقمنة بيانات تخطيط كهربية الدماغ عند 1000 هرتز مع كسب 1K باستخدام مكبر للصوت العشب. راجع إشارة تخطيط كهربية الدماغ (مرشح تمرير النطاق بين 3-70 هرتز) لاحقا باستخدام البرامج (على سبيل المثال، LabChart Pro).
  4. سجل تخطيط كهربية الدماغ الأساسي قبل الإصابة لمدة 30 دقيقة قبل فصل الحيوانات لإجراء ربط الشريان السباتي.

4. ربط الشريان السباتي الأيسر

  1. تخدير الجرو (بعد الولادة اليوم 10) مع isoflurane 4-5٪ في غطاء محرك السيارة تدفق الهبوط ووضعها على الإعداد مرتبة خصيصا على لوحة حمام مائي. وضع الحيوان supine وتأمين الأطراف الأمامية مع شريط ورقي.
    1. خفض تدفق ايزوفلوران إلى 2-3٪. قرصة الذيل للاستجابة للألم ورصد التنفس طوال العملية.
  2. تعقيم منطقة الشق (بين الفك السفلي والقعقعة) على الجانب الأيسر من الرقبة مع البيتادين والكحول (3 دورات من اليود بالتناوب و 70٪ الإيثانول).
  3. إجراء شق طوله 1 سم تقريبا على الجانب الأيسر من الرقبة باستخدام أجهزة الميكروسيستور. باستخدام مجهر تشريح، اسحب بعناية الأنسجة والجلد تحت الجلد لفضح الشريان السباتي. الحرص على تحديد العصب المبهم (تشغيل الجانبية إلى الشريان) وفصل بدقة وسحبه من الشريان.
  4. خيط خياطة حرير معقمة بطول 5 سم تحت الشريان باستخدام القوة الدقيقة. ربط خياطة معقودة مزدوجة حول الشريان لتدفق انسداد.
  5. قطع الغرز الزائد وإغلاق الشريان المكشوف عن طريق سحب الأنسجة والجلد تحت الجلد. استخدام السندات البيطرية لختم شق.
  6. ضع الحيوان مرة أخرى على مراقبة تخطيط كهربية الدماغ المستمرة في غرفة في درجة حرارة الغرفة ، والتي يتم وضعها على فراش دافئ. اتخاذ بقعة الأشعة تحت الحمراء درجة الحرارة الشيكات من درجة الحرارة الأساسية الجرو لتجنب فتح الغرفة. السماح للحيوان لاسترداد لمدة 1 ساعة قبل نقص الأكسيجة.

5. تخطيط كهربية الدماغ ونقص الأكسيجة

  1. مراقبة FiO2 باستمرار (جزء من الأكسجين الملهم) داخل الغرفة عبر جهاز مراقبة الأكسجين.
  2. قم بتدفق الغرفة ب 60 لتر/دقيقة من 100٪ N2 و0.415 لتر/دقيقة مقابل 100٪ O2. بمجرد أن يصل تشبع الأكسجين في الغرفة إلى 12٪، قلل من تدفق N2 إلى 10 لتر / دقيقة مع الحفاظ على تدفق O2 دون تغيير. مع تعديلات صغيرة، والحفاظ على FiO2 في 8٪ لمدة 45 دقيقة.
  3. بعد 45 دقيقة من التعرض لنقص الأكسيجة، أعد FiO2 إلى 21٪.
  4. يكون الجراء استرداد في غرفة ورصد على تخطيط كهربية الدماغ لمدة 2 ساعة بعد نقص الأكxia.
  5. بعد الانتهاء من فترة التسجيل، افصل الفئران عن تسجيل تخطيط كهربية الدماغ وارجع إلى الأم.

6. تحليل تخطيط كهربية الدماغ

  1. تحليل ملف تخطيط كهربية الدماغ مع الفيديو في LabChart برو. هل لديك باحث أعمى علامة تخطيط كهربية الدماغ للمضبوطات وأنماط الخلفية17. تعرف النوبات بأنها حدث إلكتروجرافي يدوم أكثر من 10 ثوان مع إفرازات موجات حادة إيقاعية عالية التردد (≥3x baseline) مع تطور واضح17.
  2. إجراء مراجعة ثانية للباحثين المكفوفين تميز الأحداث عشوائيا للاتفاق.
  3. راجع الفيديو المرتبط بكل حدث إلكتروجرافي ملحوظ وحلل وفقا لدرجة النوبة السلوكية للقوارض الوليدية16. باختصار ، تتراوح هذه النتيجة من 0-6 (الجمود إلى السلوك الشديد منشط كلوني). لمزيد من توصيف شبه المضبوطات، وتحليل السلوك لالبعدية (متعدد البؤر / الحركات الثنائية مقابل التنسيق / أحادية الجانب مقابل مختلطة).
  4. إنشاء مطياف الطاقة. استخدم تحويل فورييه سريع مع إطار بيانات جيب ال جرس بحجم 1024 نقطة بيانات. إنشاء محور س متجانس في الطيف بمساعدة تداخل النافذة بنسبة 87.5٪. التعبير عن الطاقة ك μV218.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف علم المضبوطات

ينتج عن التعرض لنقص الأكفاج نقص التروية لدى الولدان نوبات معممة ومركزية على حد سواء لدى الفئران (الشكل 1A-C). تسمح تسجيلات تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو بأن ترتبط النتائج الكهربائية بالسلوك على الفيديو. تم تسجيل هذه السلوكيات باستخدام درجة النوبة السلوكية للقوارض الوليدية المنشورة سابقا (BSS)16. بالإضافة إلى BSS، قمنا بتصنيف الأحداث بناء على ما إذا كان السلوك تنسيقا/أحاديا أو ثنائيا أو مختلطا (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قدمنا نموذجا للرصد المستمر ل تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو في فئران حديثي الولادة أثناء نوبات نقص الأكز الإقفاري. تحليل الفيديو بالتزامن مع تخطيط كهربية الدماغ يسمح تحديد خصائص المضبوطات. تحليل تخطيط كهربية الدماغ يسمح لاستخراج الطيفية السلطة وتحليل السعة الخلفية.

يعد وضع الأقطاب الكهربائية بشكل صحيح ودقيق أمرا حاسما في هذا البروتوكول، حيث يمكن أن تؤثر الإصابة أثناء وضع القطب الكهربائي أو التنسيب غير الدقيق بشكل كبير على النتائج. تقييم النشاط الأساسي العادي تخطيط كهربية الدماغ قبل الإصابة أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نعترف بمصادر التمويل التالية: NIH NINDS – K08NS101122 (JB)، R01NS040337 (JK)، R01NS044370 (JK)، كلية الطب بجامعة فرجينيا (JB).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قضيب <قوي > جراحة < / قوي >
نقطة الكرةقضيب Metrex Research8300-Fi-bond
قضيب Cranioplast (مسحوق / راتنج)ColteneH00383Perm Reline / Power
I-BondKulzer GmbH ، ألمانيا
LOOK خياطة الحريرللتخصصات الجراحيةSP115LOOK SP115 خياطة جراحية مضفرة من الحرير الأسود غير قابلة للامتصاص
RS-5168 ملقطبوتفين روبوز أداة جراحيةRS5168ملقط للجراحة / الربط
RS-5138 ملقط GraefeRoboz أداة جراحيةRS5138ملقط للجراحة / ربط
ضوء الأشعة فوق البنفسجية ل I-BondBlast Lite بواسطة First MediaBL778الأشعة فوق البنفسجية ligth لمقص I-bond
Vannas Microdissecting ScissorRoboz Surgical InstrumentRS5618مقص للربط
Vet Bond3M Vetbond1469SBVet Glue
< قوي > نقص الأكسجة < / قوي >
HypoxidialStarr Life Science
مستشعر الأكسجينالمنتجاتMiniOxI- محلل / مستشعر الأكسجين لجهاز نقص الأكسجة
<قوي>EEG RECORDING< / strong>
موصل وعاء أنثى 0.079 "Mill-Max Manufacturing Corp832-10-024-10-001000تم طلبه من Digikey
Grass AmplifierNatus Neurology IncorporatedGrass
Product LabChart ProADI InstrumentsSoftware لتشغيل النظام
موصل مقبس ذكر 0.079 "Mill-Max Manufacturing Corp833-43-024-20-001000تم طلبه من مكبر الصوت التشغيلي Digikey
Texas Instruments ، دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكيةTLC2274CD TLC2274مكبر للصوت التشغيلي الرباعي منخفض الضوضاء إلى السكك الحديدية
مكبر للصوت التشغيلي مكبرتكساس إنسترومنتس ، دالاس ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكيةTLC2272ACDRTLC2274 رباعي منخفض الضوضاء للسكك الحديدية إلى السكك الحديدية مكبر للصوت
التشغيلي أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأأنظمة AM7914000.005 "عارية / 0.008" مطلي 100 قدم
سلك فائق المرونةMcMaster-Carr9564T136 سلك شاش بألوان مختلفة
شركة الطبية للصوت

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vasudevan, C., Levene, M. Epidemiology and aetiology of neonatal seizures. Seminars in Fetal & Neonatal Medicine. , (2013).
  2. Volpe, J., et al. Neonatal Seizures. Volpe's Neurology of the Newborn. , Elsevier. 275-321 (2018).
  3. Shankaran, S., et al. Network EKSNNR. Childhood outcomes after hypothermia for neonatal encephalopathy. New England Journal of Medicine. 366 (22), 2085-2092 (2012).
  4. Pappas, A., et al. Cognitive outcomes after neonatal encephalopathy. Pediatrics. 135 (3), 624-634 (2015).
  5. van Schie, P. E., et al. Long-term motor and behavioral outcome after perinatal hypoxic-ischemic encephalopathy. European Journal of Paediatric Neurology. 19 (3), 354-359 (2015).
  6. Rensing, N., et al. Longitudinal analysis of developmental changes in electroencephalography patterns and sleep-wake states of the neonatal mouse. PLoS One. 13 (11), 1-17 (2018).
  7. Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
  8. Burnsed, J. C., et al. Hypoxia-ischemia and therapeutic hypothermia in the neonatal mouse brain--a longitudinal study. PLoS One. 10 (3), 0118889(2015).
  9. Semple, B. D., et al. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Progress in Neurobiology. , 1-16 (2013).
  10. Comi, A. M., et al. Gabapentin neuroprotection and seizure suppression in immature mouse brain ischemia. Pediatric Research. 64 (1), 81-85 (2008).
  11. Comi, A. M., et al. A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse. Pediatric Neurology. 31 (4), 254-257 (2004).
  12. Kadam, S. D., White, A. M., Staley, K. J., Dudek, F. E. Continuous Electroencephalographic Monitoring with Radio-Telemetry in a Rat Model of Perinatal Hypoxia-Ischemia Reveals Progressive Post-Stroke Epilepsy. Journal of Neuroscience. 30 (1), 404-415 (2010).
  13. Burnsed, J., et al. Neuronal Circuit Activity during Neonatal Hypoxic - Ischemic Seizures in Mice. Annals of Neurology. 86, 927-938 (2019).
  14. Sampath, D., White, A. M., Raol, Y. H. Characterization of neonatal seizures in an animal model of hypoxic-ischemic encephalopathy. Epilepsia. 55 (7), 985-993 (2014).
  15. Sampath, D., Valdez, R., White, A. M., Raol, Y. H. Anticonvulsant effect of flupirtine in an animal model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Neuropharmacology. 123, 126-135 (2017).
  16. Kang, S. K., et al. and sex-dependent susceptibility to phenobarbital-resistant neonatal seizures: role of chloride co-transporters. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-16 (2015).
  17. Zanelli, S., Goodkin, H. P., Kowalski, S., Kapur, J. Impact of transient acute hypoxia on the developing mouse EEG. Neurobiology of Disease. 68, 37-46 (2014).
  18. Lewczuk, E., et al. EEG and behavior patterns during experimental status epilepticus. Epilepsia. 59 (2), 369-380 (2017).
  19. Wu, D., Martin, L. J., Northington, F. J., Zhang, J. Oscillating gradient diffusion MRI reveals unique microstructural information in normal and hypoxia-ischemia injured mouse brains. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (5), 1366-1374 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة