هضم عيون الماوس كله لتحليل Cytometric تدفق متعدد المعلمة من البلاعات أحادية النوى

Steven Droho; Carla  M. Cuda; Jeremy  A. Lavine

doi:10.3791/61348

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

هضم عيون الماوس كله لتحليل Cytometric تدفق متعدد المعلمة من البلاعات أحادية النوى

4.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61348

⸱

يونيو 17, 2020

Steven Droho¹ , Carla M. Cuda^*² , Jeremy A. Lavine^*¹

¹Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, ²Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول طريقة لهضم العينين بالكامل في تعليق خلية واحدة لغرض تحليل cytometric تدفق متعدد المعلمة من أجل تحديد مجموعات ب والدمغة أحادية النواة العينية المحددة، بما في ذلك أحادية الخلايا، microglia، الضامة، والخلايا المتجّنة.

الملخص

يلعب الجهاز المناعي الفطري أدوارًا مهمة في الفيزيولوجيا المرضية العينية بما في ذلك التهاب القزحي واعتلال الشبكية السكري والتنكس البقعي المرتبط بالعمر. الخلايا المناعية الفطرية، على وجه التحديد البلعات أحادية النوى، تعبر عن علامات سطح الخلايا المتداخلة، مما يجعل تحديد هذه التجمعات السكانية تحدياً. متعدد المعلمة تدفق cytometry يسمح للتحليل المتزامن، الكمي لعلامات سطح الخلية متعددة من أجل التفريق أحادية، الضامة، microglia، والخلايا التشعب في عيون الماوس. يصف هذا البروتوكول enucleation عيون الماوس كله، تشريح العين، والهضم في تعليق خلية واحدة، وتلطيخ تعليق خلية واحدة لعلامات الخلية النخاعية. بالإضافة إلى ذلك، نحن شرح الطرق المناسبة لتحديد الفولتية باستخدام ضوابط لون واحد ولضبط البوابات الإيجابية باستخدام الفلوريسنس ناقص ضوابط واحدة. القيد الرئيسي للتدفق متعدد المعلمة هو عدم وجود بنية الأنسجة. ويمكن التغلب على هذا القيد من خلال متعدد المعلمة تدفق قياس الخلايا من مقصورات العين الفردية أو لطخة المناعة المجانية. ومع ذلك، فإن الفلوروس المناعي محدود بسبب افتقاره إلى التحليل الكمي والعدد المخفض من الفلوروفورات على معظم المجاهر. نحن نصف استخدام المناظير الخلوية التدفق متعدد الحساسية لتوفير تحليل كمي للغاية من البلعات أحادية النوى في neovascularization المشيمية التي يسببها الليزر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام قياس تدفق متعدد المعلمة لتحديد مجموعات فرعية للغة الضامة، ورسم خرائط للمصير، وفرز الخلايا للدراسات النسخية أو البروتيومية.

المقدمة

يتضمن الجهاز المناعي الفطري أنواع خلايا متعددة تحفز التنشيط والالتهاب. وتشمل الخلايا المناعية الفطرية الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا الصاري ، والبصلات ، واليوزنوفيليات ، والعدلات ، والبلعات أحادية النوى. وقد تورطت في الفعات أحادية النوى، والتي تتكون من أحادية الخلايا، الضامة، والخلايا التشعبية، في الفيزيولوجيا المرضية من حالات العيون متعددة بما في ذلك التهاب القزحية، اعتلال الشبكية السكري، والضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)¹. في هذا البروتوكول، وسوف نركز على تحديد البلعات أحادية النواة باستخدام تحليل cytometric تدفق متعددة المعلمة في نموذج الماوس من أيه أمد neovascular². هذا البروتوكول قابل للتكيف مع نماذج الم....