مقالة منهجية

هضم عيون الماوس كله لتحليل Cytometric تدفق متعدد المعلمة من البلاعات أحادية النوى

DOI:

10.3791/61348

⸱

يونيو 17, 2020

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Medicine, Division of Rheumatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول طريقة لهضم العينين بالكامل في تعليق خلية واحدة لغرض تحليل cytometric تدفق متعدد المعلمة من أجل تحديد مجموعات ب والدمغة أحادية النواة العينية المحددة، بما في ذلك أحادية الخلايا، microglia، الضامة، والخلايا المتجّنة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب الجهاز المناعي الفطري أدوارًا مهمة في الفيزيولوجيا المرضية العينية بما في ذلك التهاب القزحي واعتلال الشبكية السكري والتنكس البقعي المرتبط بالعمر. الخلايا المناعية الفطرية، على وجه التحديد البلعات أحادية النوى، تعبر عن علامات سطح الخلايا المتداخلة، مما يجعل تحديد هذه التجمعات السكانية تحدياً. متعدد المعلمة تدفق cytometry يسمح للتحليل المتزامن، الكمي لعلامات سطح الخلية متعددة من أجل التفريق أحادية، الضامة، microglia، والخلايا التشعب في عيون الماوس. يصف هذا البروتوكول enucleation عيون الماوس كله، تشريح العين، والهضم في تعليق خلية واحدة، وتلطيخ تعليق خلية واحدة لعلامات الخلية النخاعية. بالإضافة إلى ذلك، نحن شرح الطرق المناسبة لتحديد الفولتية باستخدام ضوابط لون واحد ولضبط البوابات الإيجابية باستخدام الفلوريسنس ناقص ضوابط واحدة. القيد الرئيسي للتدفق متعدد المعلمة هو عدم وجود بنية الأنسجة. ويمكن التغلب على هذا القيد من خلال متعدد المعلمة تدفق قياس الخلايا من مقصورات العين الفردية أو لطخة المناعة المجانية. ومع ذلك، فإن الفلوروس المناعي محدود بسبب افتقاره إلى التحليل الكمي والعدد المخفض من الفلوروفورات على معظم المجاهر. نحن نصف استخدام المناظير الخلوية التدفق متعدد الحساسية لتوفير تحليل كمي للغاية من البلعات أحادية النوى في neovascularization المشيمية التي يسببها الليزر. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام قياس تدفق متعدد المعلمة لتحديد مجموعات فرعية للغة الضامة، ورسم خرائط للمصير، وفرز الخلايا للدراسات النسخية أو البروتيومية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتضمن الجهاز المناعي الفطري أنواع خلايا متعددة تحفز التنشيط والالتهاب. وتشمل الخلايا المناعية الفطرية الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا الصاري ، والبصلات ، واليوزنوفيليات ، والعدلات ، والبلعات أحادية النوى. وقد تورطت في الفعات أحادية النوى، والتي تتكون من أحادية الخلايا، الضامة، والخلايا التشعبية، في الفيزيولوجيا المرضية من حالات العيون متعددة بما في ذلك التهاب القزحية، اعتلال الشبكية السكري، والضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)1. في هذا البروتوكول، وسوف نركز على تحديد البلعات أحادية النواة باستخدام تحليل cytometric تدفق متعددة المعلمة في نموذج الماوس من أيه أمد neovascular2. هذا البروتوكول قابل للتكيف مع نماذج الماوس من اعتلال الشبكية السكري و / أو التهاب القزحية ، ولكن من المستحسن تشريح العين أكثر شمولا بسبب الطبيعة الجهازية لهذه الأمراض.

تعبر البالعات أحادية النوى عن علامات سطح الخلية المتداخلة. خلايا الضامة المقيمة الأنسجة طويلة الأمد وmicroglia تنشأ من صفار ساك المستمدة من السلف 3 erythromyeloid3، في حين إعادة تدوير الضامة والخلايا التشعبة التمييز من النخاع العظمي التكخير الخلايا التكهنة4. علامات سطح الخلية الماوس المشتركة monocytes، الضامة، وخلايا التشعب تشمل CD45، CD11b5،F4/806،Cx3cr17،وعلامة Iba18داخل الخلية. من أجل التغلب على هذا التحدي ، تحليل النسخ من الضامة ، monocytes ، والخلايا التشعب من أنسجة متعددة يعرف CD64 باعتبارها علامة سطح الخلية الضامة الخاصة6. وقد وصفت الضامة في القزحية، المشيمية، الجسم الهدّاج، والعصب البصري في عيون صحية3. وبدلاً من ذلك، فإن تحديد هوية الخلية التشعبية أكثر صعوبة؛ الأسلوب الأكثر تحديدا لتحديد الخلية dendritic يتطلب رسم خرائط مصير باستخدام Zbtb46-GFP مراسل الماوس9. مستقلة عن هذا الخط مراسل، والتعبير عن CD11c وMHCII بالتزامن مع عدم وجود CD64 يمكن تحديد الخلايا التشجر المحتملة6،10. وقد تم تحديد الخلايا التشعبية في القرنية، الملتحمة، القزحية، والمشيمية في عيون طبيعية11. Microglia هي الضامة المتخصصة الموجودة في شبكية العين، محمية من قبل حاجز الدم الشبكية، ومستمدة من صفار كيس الخلايا السلف12. ونتيجة لذلك، يمكن تمييز ميكروجليا الشبكية من الضامة المشتقة من أحادية الخلايا من خلال مستوياتها الخافتة من التعبير CD4513 ومستويات عالية من Tmem119، والذي يتوفر كآلية مضادة مضادة للتدفق14. على microglia التنشيط ، ومع ذلك ، يمكن أن يكون CD45 حتى المنظمة15 و Tmem119 قد تكون أسفل المنظمة3، مما يدل على تعقيد البيولوجيا microglia وهذا من المرجح أن تكون ذات الصلة في كل من AMD ونموذج الماوس. وأخيراً، يمكن تقسيم أحاديات إلى نوعين فرعيين على الأقل، بما في ذلك الكلاسيكية وغير الكلاسيكية. الكلاسيكية monocytes عرض CCR2+Ly6CعاليةCX3CR1 التعبيرالمنخفض، وغير الكلاسيكية monocytes شرح CCR2-Ly6CمنخفضةCX3CR1 علاماتعالية 5.

نظرا لضرورة التحليل الكمي للتعبير علامة، أي، مستويات عالية مقابل منخفضة / خافتة، multi-parameter تدفق قياس الخلايا هو الطريقة المثلى للتمييز بين monocytes، الضامة، microglia، والخلايا التشعب في العين والأنسجة الأخرى. وتشمل المزايا الإضافية تحديد مجموعات فرعية، والقدرة على استخدام فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) لفرز مجموعات الخلايا لتحليل النسخ أو البروتيوم، ورسم خرائط المصير. العيب الرئيسي للتدفق متعدد المعلمة هو عدم وجود بنية الأنسجة. ويمكن التغلب على هذا عن طريق تشريح العيون في مختلف subcompartmentments العين: القرنية، الملتحمة، قزحية العين، العدسة، شبكية العين، ومجمع المشيمية Sclera. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تصوير المناعة الواعنية، ولكن محدود بعدد العلامات وعدم وجود كمية قوية.

وقد ربطت دراسات الرابطة واسعة الجينوم الجينات تكمل متعددة مع AMD16. تنشيط مكمل يؤدي إلى إنتاج الحساسية, تجنيد الكريات البيض, والتهاب الناتجة. في مستقبلات مكملة ناقص الفئران، إصابة الليزر يقلل من أحادية النوى الفيتويتي تجنيد وneovascularization المشيمية التي يسببها الليزر (CNV) منطقة17. وبالمثل، فإن C-C chemokine مستقبلات 2 (CCR2) ماوس بالضربة القاضية، والذي هو نقص في التوظيف أحادية إلى الأنسجة، ويوضح كلا من تجنيد البليغسيت أحادية النواة وأشعة الليزر التي يسببها CNV المنطقة18. هذه البيانات وصلة تكملة ومونية البلعومات مع CNV التجريبية وربما NEOVASCULAR AMD. دعما لهذا الارتباط، و dysregulated مستقبلات تكملة على monocytes الدم الطرفية في المرضى الذين يعانون من أيه ام دي neovascular19،20. وتبين هذه البيانات وجود ارتباط قوي بين AMD والبلعات أحادية النوى.

في هذه المخطوطة، سوف نستخدم نموذج CNV المستحث بالليزر التجريبي لتوصيف مجموعات البلعومات أحادية النوى في عين الماوس باستخدام عملية تدفق التدفقات متعددة المعالم. بالليزر التي يسببها CNV هو نموذج الماوس القياسية من أيه امد neovascular، والتي أظهرت فعالية العلاج الحالي الخط الأول NEOVASCULAR21. هذا البروتوكول سوف يصف enucleation من عيون الماوس، تشريح العين، والهضم في تعليق خلية واحدة، وتلطيخ الأجسام المضادة، وتحديد الفولتية الليزر باستخدام ضوابط لون واحد، واستراتيجية الغاء باستخدام الفلوريسنس ناقص واحد (FMO) الضوابط. للحصول على وصف مفصل لنموذج CNV الذي يسببه الليزر، يرجى الاطلاع على منشور سابق22. باستخدام هذا البروتوكول، سوف نحدد ميكروجليا، أحادية الخلايا، الخلايا التكجرية، والسّكان الضامة. وعلاوة على ذلك، سوف نستخدم MHCII و CD11c لمزيد من تحديد مجموعات فرعية الضامة داخل نموذج CNV الليزر التي يسببها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافقت على جميع الإجراءات من قبل جامعة نورث وسترن لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدامها. تم إيواء الفئران C57BL/6 في منشأة حاجز في مركز الطب المقارن في جامعة نورث وسترن (شيكاغو، إلينوي). تم إيواء جميع الحيوانات في دورة 12/12 ساعة خفيفة / داكنة مع حرية الوصول إلى الطعام والماء.

1. جمع الأنسجة العينية

  1. التضحية 10-12 أسبوعا C57BL/6J الفئران من أي من الجنسين باستخدام الإدارة المنظمة لثاني أكسيد الكربون حتى لا يستجيب الماوس ولم يعد استنشاق. إجراء خلع عنق الرحم أو غيرها من الطرق الثانوية المعتمدة لضمان القتل الرحيم.
    ملاحظة: يمكن إجراء التسريب عبر القلب لإزالة الكريات البيض المتداولة التي ليست في أنسجة العين. في هذه التجربة، لا يقلل النزف الجهازي عدد ميكروجليا، أحادية الخلايا، الضامة، أو الخلايا المتجّنة التي تم اكتشافها في عيون كاملة غير المعالجة أو الليزرية. لذلك ، تقع غالبية أنواع الخلايا هذه في الأنسجة العيونية وهذه الخطوة اختيارية.
  2. لثني العينين، ادفعي إلى الأسفل بالقرب من مقبس العين أثناء وضع زوج من ملقط منحنية بلطف تحت العين لأنها تقف خارج المقبس. قرصة ملقط مغلقة تحت العين دون الضغط على العين الفعلية. طرد العين من الملتحمة المحيطة (يرجى الاطلاع على النشر المسبق)23.
  3. سحب العين بشكل متَرَكَم حتى العصب البصري هو الاتصال الوحيد المتبقي لفصل العين. غالبًا ما يقطع العصب البصري مع التوتر ، ولكن يكون المقص الصغير ضروريًا أحيانًا لقطع العصب البصري. ضع العين في محلول ملحي مؤقت من هانك 1x (HBSS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم في أنبوب ميكروسنتريفوغ 1.7 مل.

2. هضم الأنسجة العينية

  1. تحضير العازلة الهضم التي تحتوي على 0.1 ملغ / مل إنزيم الهضم و 0.2 ملغ / مل DNase في HBSS الباردة. إعادة تشكيل 5 ملغ إنزيم الهضم في 2 مل من الماء المعقم في البداية. إعداد تخفيف أولي من 10 ملغ / مل DNase في HBSS. لكل 10 مل من العازلة الهضم (كافية ل3 حيوانات) مزيج 9.4 مل من HBSS الباردة مع 0.4 مل من الانزيم الهضم المعاد تشكيلها و 0.2 مل من DNase المخفف I.
    ملاحظة: تم تحديد هذه التركيزات تجريبياً على تجارب متعددة لتوفير المستويات المثلى من تلطيخ الأجسام المضادة للخلايا المفردة، مع تقليل موت الخلايا. وقد حاول كولاجيناز D كبديل لهضم الانزيم مع انخفاض صلاحية الخلية وانخفاض CD45+ الخلايا. يرجى الاطلاع على المناقشة لمزيد من التفاصيل حول عملية تكرارية لتحسين الهضم.
  2. تحت المجهر تشريح في التكبير الكلي 10x، وإزالة الملتحمة المتبقية والعصب البصري باستخدام ملقط غرامة ومقص الربيع في HBSS الباردة.
  3. نقل عيون نظيفة إلى طبق تشريح الجافة أو قارب وزن صغير. حقن 0.15-0.20 مل / العين من العازلة الهضم عن طريق حقنة مزودة إبرة 30 G في تجويف زجاجي بعد اثنين من الجروح ثقب المحرز في العين من خلال المحور البصري و 90 درجة بعيدا عن هذا الجرح الأول للهضم عازلة الخروج.
  4. مُمَرّع العينين بالكامل باستخدام مقص الربيع والملقط الناعم مع جميع القطع الأصغر من 0.5 مم × 0.5 مم. فصل أنسجة العدسة مع اضطراب الميكانيكية حادة عن طريق ملقط لمنع انسداد نصائح ماصة في الخطوات اللاحقة. لكل عينة، شطف ملقط ومقص مع كل 0.75 مل من عازلة الهضم في طبق صغير. استخدم طبقًا جديدًا لكل عينة.
  5. نقل محتويات الطبق إلى أنبوب تفكك على الجليد باستخدام P1000 ماصة مع الحرص على عدم فقدان أي مادة في نقل الماصات. شطف الطبق مع إضافية 1.5 مل من العازلة الهضم ليصل حجم إجمالي في أنبوب الانفصام إلى 3.25-3.50 مل.
  6. ضع أنبوب الانفصام المقلوب على الفصام الإلكتروني ودورة التشغيل "m_brain_03_01"، والتي تتكون من دوران أحادي الاتجاه بـ 1 دقيقة عند 200 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة، وهو برنامج تم تحميله مسبقًا. ضمان جميع الأنسجة في الجزء السفلي من أنبوب الانفصام في اتصال مع العازلة الهضم والدوار لهذا وجميع الخطوات المتبقية.
  7. ضع أنبوب الانفصام في حاضنة الهز لمدة 30 دقيقة عند 200 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
  8. كرر الخطوات 2.6 و 2.7 وقت إضافي واحد. بعد الثانية 30 دقيقة الحضانة تنفيذ الهضم الميكانيكية النهائية باستخدام النفص الإلكترونية كما هو الحال في الخطوة 2.6.
  9. وقف رد الفعل بإضافة 10 مل من تدفق الباردة العازلة ووضع أنابيب على الجليد.

3. إعداد تعليق الخلية

  1. لإنشاء تعليق أحادي الخلية، صب رد فعل الهضم العين توقف من خلال مرشح 40 ميكرومتر وضعت على الجزء العلوي من أنبوب أجهزة الطرد المركزي المخروطية 50 مل. باستخدام المكبس من حقنة 2.5 مل، ودفع أي قطع المتبقية من أنسجة العين غير مهضومة من خلال مرشح.
  2. غسل أنبوب الانفصام مع 10 مل من تدفق العازلة وشطف مرشح قبل استخدام نفس المكبس لتمرير مرة أخرى قطع أنسجة العين غير مهضومة من خلال مرشح.
  3. كرر الخطوة 3.2 باستخدام 5 مل من تدفق المخزن المؤقت.
  4. غسل أنبوب الانفصام وتصفية مع 10 مل النهائي من تدفق العازلة.
    ملاحظة: إجمالي حجم الهضم وتدفق العازلة حوالي 38-40 مل لكل عينة.
  5. الطرد المركزي أنبوب المخروطية في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. Decant الماسخ دون إزعاج بيليه الخلية.
  6. إعداد حل 1x lysing عن طريق إضافة حل 10x lysing إلى الماء العقيم. تفريق بيليه عن طريق الخفقان أنبوب ضد أنبوب آخر. إلى خلايا الدم الحمراء، إضافة 1 مل من 1x حل lysing لمدة 30 s مع دوامة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  7. وقف التفاعل مع 20 مل من تدفق العازلة.
  8. الطرد المركزي أنبوب المخروطية في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. Decant الماسخ دون إزعاج بيليه الخلية.
  9. فصل بيليه عن طريق الخفقان أنبوب ضد أنبوب آخر. إضافة 5 مل من 1x HBSS الباردة لكل أنبوب.
  10. أنابيب الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. اتعرق مُتطّر.

4. تلطيخ من تعليق الخلية للphagocytes أحادية النوى

  1. إعداد 0.5 مل من وصمة عار لايف / الميت لكل عينة عن طريق تخفيف العيش / الميت صبغة 1:5،000 في HBSS الباردة.
  2. إضافة وصمة عار لايف / الميت إلى كل عينة باستخدام ماصة P1000 مع التأكد من فصل بيليه تماما. نقل العينات إلى 1.2 مل أنابيب تيتر الصغرى.
  3. خذ aliquot صغير (10 ميكرولتر) لحساب الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا التلقائي (انظر 4.4). عينات احتضان مع وصمة عار لايف / الميت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  4. عد الخلايا باستخدام الأزرق Trypan لتحديد عدد الخلايا الحية لكل عينة.
    ملاحظة: عادةً، تحتوي عينان من ماوس C57BL/6J من عمر 10-12 أسبوعًا على أقل من 2 × 106 خلايا حية.
  5. غسل العينات عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من تدفق الباردة العازلة. أنابيب الطرد المركزي في رف أنبوب تيتر الصغرى عند 400 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استلهموا المُتطّر دون إزعاج خلية بيليه.
  6. خلايا إعادة بناء تماما في 500 ميكرولتر من تدفق الباردة العازلة. أنابيب الطرد المركزي في رف أنبوب تيتر الصغرى عند 400 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استلهموا المُتطّر دون إزعاج خلية بيليه.
  7. كتلة تصل إلى 5 × 106 الخلايا الحية في 50 ميكرولتر من كتلةF c (1:50 تخفيف في تدفق الباردة العازلة من الفأر المضادة للماوس 16/CD32). إذا كان أكثر من 5 × 106 خلايا حية، زيادة وحدات التخزين بشكل مناسب.
  8. إضافة كتلةج إلى بيليه التأكد من فصل تماما العينة. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
  9. إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة تلطيخ الحل (انظر الجدول 1 لاختيار وكمية كل الأجسام المضادة التي يتم تضمينها في الحل) لكل 5 × 106 الخلايا الحية مباشرة إلى الخلايا في كتلةF c ومزيج تماما. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: تعتمد كميات الأجسام المضادة على تكوين مقياس التدفق وينبغي أن يتم تحديدها بشكل مستقل لكل مختبر وأداة. انظر الجدول 2 للحصول على تكوين أداة من المرشحات والمرايا. للأجسام المضادة لتكميل، تبدأ مع توصية الشركة المصنعة، وحساب مؤشر تلطيخ. إجراء اختبار تشغيل تركيزات الأجسام المضادة المختلفة (سواء فوق أو تحت توصية الشركة المصنعة) واختيار أدنى تركيز للأجسام المضادة حيث يتم الحفاظ على مؤشر تلطيخ. أيضا، تأكد من أن تلطيخ إيجابي أقل إشراقا من عنصر التحكم لون واحد. استخدام الخلايا غير الملطخة لضمان أن الخلايا الملطخة سلبا على نطاق ولها ذروة في أو أقل من 1 × 102. استخدام الفلوريسنس ناقص عنصر تحكم واحد لتحديد الخلايا الملطخة بشكل إيجابي.
  10. غسل العينات عن طريق إضافة 700 ميكرولتر من تدفق الباردة العازلة. أنابيب الطرد المركزي في رف أنبوب تيتر الصغرى عند 400 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استلهموا المُتطّر دون إزعاج خلية بيليه.
  11. اختياريا، بعد تلطيخ الأجسام المضادة، يمكن إصلاح العينات مع 500 ميكرولتر من 2٪ شبهفورمالدهيد في تدفق العازلة. إصلاح العينات لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، قم بإجراء غسل واحد كما هو موضح في 4.10. تخزين عينات ثابتة عند 4 درجة مئوية. يجب إضافة حبات العد في يوم جمع بيانات قياس التدفق. يجب أن يتم تشغيل عينات ثابتة على جهاز قياس التدفق في 1-2 أيام.
    تنبيه: Paraformaldehyde هو تآكل وخطر على الصحة.
  12. غسل العينات مرة أخرى باستخدام 500 ميكرولتر من تدفق الباردة العازلة. أنابيب الطرد المركزي في رف أنبوب تيتر الصغرى عند 400 x ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. pirate نصف من افرا من دون إزعاج بيليه الخلية.
  13. الكريات ريسوسيبيند ونقلها إلى بئر 96، يو القاع لوحة المقايسة. لوحة الطرد المركزي عند 400 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية. لdedeantant المابير، بدوره لوحة أكثر وفي هزة واحدة قوية طرد السائل في حوض بالوعة، دون بيليه مزعجة.
  14. في أنبوب تيتر صغير جديد 1.2 مل، ضع 50 ميكرولتر من الخرز العد دوامة جيدا.
  15. الكريات ريسوسيبيند في 96 لوحة جيدا في 200 ميكرولتر من تدفق الباردة العازلة. إضافة خليط الخلية على الجزء العلوي من الخرز من الخطوة السابقة. تشغيل على تدفق الجهاز البولي في حجم إجمالي 250 ميكرولتر / ميكرو تيتر أنبوب.

5. جمع بيانات تدفق cytometry

  1. تشغيل وإعداد تدفق مقياس المقاييس. الإرشادات المذكورة هنا هي لأربعة ليزر معدلة cytometer (الجدول 2).
  2. تشغيل عينة اختبار، والتي تتضمن aliquot صغيرة من كل عينة، لضمان أن جميع الخلايا على نطاق لكل كاشف. ضبط الفولتية بحيث تكون جميع الخلايا على نطاق واسع.
  3. تشغيل عناصر تحكم لون واحد (SCC) لكل fluorophore المستخدمة في تلطيخ كوكتيل(الجدول 3). ضع أنبوب titer الصغير في أنبوب أكبر من البوليسترين 5 مل لوضعه على مرحلة مقياس التدفق.
    ملاحظة: الفلوروفور الجذر مثل BV421 (الأزرق المحيط الهادئ)، FITC، PE، Alexa647 (APC)، و Alexa700 لا تتطلب نفس الأجسام المضادة مثل الكوكتيل (أي، CD19 PE لC64 PE). ومع ذلك، الفلوروفورات جنبا إلى جنب مثل PE-CF594، PE-Cy7، أو APC-Cy7 تتطلب نفس الأجسام المضادة لSCC كما كوكتيل بسبب تفكك المحتملة من الفلوروفورس مترافق.
    1. إنشاء SCC لBV421 عن طريق إضافة 2 قطرات من الخرز التعويض إلى أنبوب titer 1.2 مل جنبا إلى جنب مع 1 ميكرولتر من الهامستر المضادة للماوس CD11c BV421. وتستخدم الخرز التعويض لأن CD11c BV421 هو نوع فرعي IgG لامدا بدلا من كابا كما هو موضح في 5.3.3. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية. إضافة 0.2 مل من تدفق العازلة.
    2. إنشاء SCC للصبغة الحية / الميت عن طريق إضافة قطرة واحدة من حبات التلوين الإيجابية (الغطاء الأخضر) من الخرز التفاعلي أمين، تليها 1 ميكرولتر من العيش / صبغة الميت. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. إضافة قطرة واحدة من الخرز السلبية (قبعة بيضاء) من الخرز رد الفعل أمين. إضافة 0.2 مل من تدفق العازلة.
    3. إنشاء SCCs المتبقية عن طريق إضافة قطرة واحدة من حبات التلوين الإيجابية (الغطاء الأخضر) من المضادة للجرذ والهامستر Ig مجموعة الخرز، تليها كمية الأجسام المضادة المدرجة(الجدول 3)في أنبوب titer 1.2 مل. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية. إضافة قطرة واحدة من الخرز السلبية (الغطاء الأبيض) من المضادة للجرذ والهامستر Ig مجموعة الخرز. إضافة 0.2 مل من تدفق العازلة.
    4. دوامة جميع خلائط حبة تماما. تخزين SCCs عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام.
      ملاحظة: SCC ماوس مراسل الفلورسنت هو خلايا غير ملوثة.
    5. عند تشغيل SCCs، قم بتعيين الفولتية بحيث يكون نموذج SCC ذروة أكبر من أي مضى لعينة من الخلايا في قناة الكاشف نفسه. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تعيين الفولتية بحيث يكون لدى أي SCC على الأقل 0.5 فرق السجل بين ذروة الرسم البياني في قناة الفائدة مقابل أي قناة أخرى (الشكل 1).
  4. تشغيل عينات على "منخفض" حفظ الأحداث / الثانية أدناه 4000. إذا كان من غير الممكن خفض معدل التدفق بشكل مناسب، قم بتخفيف العينات مع مخزن تدفق بارد إضافي. تسجيل وحدة التخزين المضافة حيث أن هذا سيكون ضروريًا لحساب العد (راجع نتائج التمثيل).
  5. جمع ما لا يقل عن 3 × 106 الأحداث لكل عينة. قد يكون هذا أعلى من عدد الخلايا بسبب حبيبات الصباغ والحطام عد كالأحداث على مقياس الخلايا الخاص بك.
  6. سجل الفلوريسنس ناقص واحد (FMO) لكل فلورية أخرى غير لايف / الميت لاستراتيجية البوابات السليمة في القسم 6.4. وFMO هي عينة التي تم ملطخة مع جميع الفلوروفوريس باستثناء واحد.
  7. تنظيف وإغلاق تدفق مقياس المقاييس وفقا ً لمعالجة الشركة المصنعة أو مرفق.

6. شرح تدفق البيانات cytometry

  1. افتح ورقة عمل جديدة باستخدام برنامج تحليل. استيراد FCS من cytometer لجميع العينات وعناصر التحكم ذات لون واحد.
  2. استخدم SCCs لإنشاء مصفوفة تعويض.
  3. تطبيق مصفوفة التعويض على العينات الملطخة الخاصة بك و FMOs.
  4. استخدام FMOs لتحديد تلطيخ إيجابية لرسم البوابات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهر الشكل 1 مدرجات التكرار غير المُؤسَّر لـ SCCs والخلايا بالليزر الأحمر: Alexa647 و Alexa700 و APC-Cy7. في الشكل 1A، يصور الخط الأرجواني ذروة SCC ل Alexa647 ، في حين أظهر الخط السماوي الفرق المقصود 0.5 Log. لاحظ أن الذروة في Alexa700 و APC-Cy7 كانت إلى اليسار (أقل إشراقا) من الخط السماوي. لاحظ أيضا أن الخلايا كانت كلها إلى يسار الخط الأرجواني. ولم يتم تعويض أي خلايا على يمين قمة المحكمة الدستورية العليا. ومن المعروف أن قنوات محددة تتسرب إلى قنوات أخرى استنادا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

متعدد المعلمة تدفق cytometry يسمح للتحليل الكمي لأنواع الخلايا المتعددة في الأنسجة المعقدة. في هذا التقرير، نحن وصف الكشف عن تدفق الخلايا من السكان البلعميات أحادية النواة، بما في ذلك أحادية الخلايا، والخلايا التشعبية، ومجاميع الضامة، بعد إصابة الليزر في عين الماوس. Liyanage وآخرون ذكرت مؤخرا استراتيجية مماثلة لسور للكشف عن العدلات، يوسنوفيليات، الخلايا الليمفاوية، DCs، الضامة، الضامة التسلل، ومحاديات27. لدينا استراتيجية البوابات يختلف في المقام الأول من خلال إضافة CD64. Liyanage وآخرون يحدد العاص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان دعم JAL من قبل منحة المعاهد القومية للصحة K08EY030923; تم دعم CMC بمنحة K01 (5K01AR060169) من المعهد الوطني للتشاتيم القومي للأمراض العضلية والعظام ومنحة أبحاث جديدة (637405) من تحالف أبحاث الذئبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.6 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة فيشر ساينتفيك05-408-120
1.7 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة كوستار3620
10 مل ماصاتفيشر ساينتفيك431031
15 مل مخروطياتThermoFisher339650
1x HBSS ، 500 ملGibco14025-092
2.5 مل حقنةHenke ساس وولف7886-1
20٪ محلول بارافورمالدهيدعلوم المجهر الإلكتروني15713-S
25 مل ماصاتفيشر ساينتفيك431032
30 جرام إبرةإكسيل26437
3 مل حقنة قفللور فيشر14955457
41 × 41 × 8 مم البوليسترين تزن طبقفيشر العلمي08-732-112
50 مل مخروطياتFalcon352070
96 بئر ، لوحة فحص U-bottom بدون غطاءFalcon353910
حبات أمين التفاعليةThermoFisherA10628
برنامج التحليلFlowJov 10
مجموعة حبة Ig kappa المضادة للفئران والهامسترBiosciences552845
C57BL / 6J الفئرانجاكسون المختبر664
خلية عدادInvitrogenAMQAX1000
خلية عداد الشرائحInvitrogenC10283
تعويض الخرزThermoFisher01-1111-42
عد الخرزThermoFisher01-1234-42
ملقط منحنيفيشر العلمي16-100-123
إنزيم الهضمسيجما ألدريتش5401020001
تشريح المجهرالوطنية للأدوات البصرية والعلمية ، Inc.DC3-420T
أنابيب التفككMiltenyi Biotec130-096-334
DNaseRoche10104159001
الفصل الإلكترونيMiltenyi Biotec130-095-937
برنامج FACS DivaBD Biosciences
Fc كتلة ، الفئران المضادة للفأر CD16 / CD32BD Biosciences553142
ملقط دقيقIntegra Miltex17035X
Flow bufferMiltenyi Biotec130-091-221
مقياس التدفقBD Biosciences
أنابيب التدفق Falcon352008
Hamster المضاد للفأر CD11c BV421BD Biosciencesدلو الثلج 562782
فيشر ساينتفيك07-210-123
حية / ميتةThermoFisher65-0866-14
محلول للتحلل ، حل 10xBD Biosciences555899
أنبوب عيار صغير ورففيشر ساينتفيك02-681-380
ماوس مضاد للفأر CD64 PEBioLegend139304
ماوس مضاد للفأر NK1.1 PECF594BD Biosciences562864
نصائح الماصة P1000Denville ScientificP2404
P1000 ماصةجيلسونFA10006M
P2 أطراف الماصةeppendorf22491806
P2 ماصةجيلسونFA10001M
P20 ماصةجيلسونFA10003M
P200 نصائح ماصةDenville ScientificP2401
ماصة P200جيلسونFA10005M
بيبيت مانفيشر FB14955202
المضادة للفأر B220 PECF594BD Biosciences562313
الفئران المضادة للفأر CD11b APC-Cy7BD Biosciences557657
الفئران المضادة للفأر CD19 AlexaFluor 700BD Biosciences557958
الفئران المضادة للفأر CD19 PEBD Biosciences553786
الفئران المضادة للفئران CD4 PECF594BD Biosciences562314
الفئران المضادة للفئران CD45 FITCThermoFisher11-0451-82
الفئران المضادة للفئران CD45 PE-Cy7BD Biosciences552848
الفئران المضادة للفئران CD8 PECF594BD Biosciences562315
الفئران المضادة للفئران Ly6CBD Biosciences561085
الفئران المضادة للفأر Ly6G PECF594BD Biosciences562700
الفئران المضادة للفأر MHC II AlexaFluor 700BioLegend107622
الفئران المضادة للفئران Siglec F PECF594BD Biosciences562757
الفئران المضادة للفأر Tim4 AlexaFluor647BD Biosciences564178
حاضنة اهتزازLabnet311DS
مقص زنبركيأدوات العلوم الدقيقة15024-10
مصفاة خلية معقمة ، شبكة نايلون 40 ممفيشر ساينتفيك22363547
ماء معقم ، 500 ملجيبكوA12873-01
جهاز طرد مركزي دلو متأرجحeppendorf5910 R
تريبان أزرق ، محلول 0.4٪Gibco15250061
العلمي BD الخلوي صبغة الجرذ العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. Macrophage physiology in the eye. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).
  2. Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).
  3. O'Koren, E. G., et al. Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration. Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).
  4. Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. Monocyte Conversion During Inflammation and Injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).
  5. Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury. Frontiers in Physiology. 3, 56(2012).
  6. Gautier, E. L., et al. Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).
  7. Sutti, S., et al. CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation. Cells. 8 (9), 1099(2019).
  8. Liu, J., et al. Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice. PLoS One. 8 (8), 72935(2013).
  9. Satpathy, A. T., et al. Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).
  10. Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization. PLoS One. 9 (4), 94313(2014).
  11. Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. The role of ocular dendritic cells in uveitis. Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).
  12. Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).
  13. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Science Reports. 6, 20636(2016).
  14. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  15. Müller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., Müller, S., Vajkoczy, P. Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells. International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).
  16. McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).
  17. Nozaki, M., et al. Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).
  18. Tsutsumi, C. The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization. Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).
  19. Subhi, Y., et al. Association of CD11b +Monocytes and Anti–Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy. JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).
  20. Singh, A., et al. Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration. AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).
  21. Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).
  22. Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. Journal of Visualized Experiments. (106), e53502(2015).
  23. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (57), e3814(2011).
  24. Makinde, H. M., et al. A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus. Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).
  25. Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).
  26. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  27. Liyanage, S. E., et al. Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models. Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).
  28. Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة