مقالة منهجية

أدوات RNAi الخاصة بالأنسجة لتحديد مكونات إشارات الإجهاد الجهازي

DOI:

10.3791/61357

⸱

مايو 16, 2020

 , 
1School of Molecular and Cell Biology & Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب الحفاظ على البروتين الكائنات الحية تنسيق استجابات مراقبة جودة البروتين مثل التعبير عن المرافق من نسيج إلى آخر. هنا ، نقدم الأدوات المستخدمة في C. ايليجانس التي تسمح بمراقبة قدرة البروتين في أنسجة معينة وتحديد استجابات الإشارات بين الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على مدى العقد الماضي ، كانت هناك زيادة تحويلية في المعرفة المحيطة بتنظيم عمليات مراقبة جودة البروتين ، مما كشف النقاب عن أهمية عمليات الإشارات بين الخلايا في تنظيم البروتينات غير المستقلة للخلية. بدأت الدراسات الحديثة الآن في الكشف عن مكونات ومسارات الإشارات التي تنسق مراقبة جودة البروتين من نسيج إلى آخر. لذلك من المهم تحديد آليات ومكونات شبكة البروتين الخلوي غير المستقل (PN) وأهميتها للشيخوخة واستجابات الإجهاد وأمراض البروتين الخاطئة. في المختبر ، نستخدم ضربة قاضية وراثية بواسطة RNAi الخاص بالأنسجة جنبا إلى جنب مع مراسلي الإجهاد وأجهزة استشعار البروتين الخاصة بالأنسجة لدراسة ذلك. نصف منهجيات فحص وتحديد مكونات PN غير المستقل للخلية التي يمكن أن تعمل في الأنسجة التي تدرك حالة الإجهاد وفي الخلايا المستجيبة لتنشيط الاستجابة الوقائية. نصف أولا كيفية توليد تركيبات الحمض النووي الريبي لدبوس الشعر للضربة القاضية الجينية التأسيسية في أنسجة معينة وكيفية إجراء ضربة قاضية وراثية خاصة بالأنسجة عن طريق تغذية الحمض النووي الريبي في مراحل الحياة المختلفة. يعمل مبلغو الإجهاد والمقايسات السلوكية كقراءات قيمة تمكن من الفحص السريع للجينات والظروف التي تعدل عمليات إشارات الإجهاد الجهازي. أخيرا ، يتم استخدام مستشعرات البروتين المعبر عنها في الأنسجة المختلفة لتحديد التغيرات في القدرة الخاصة بالأنسجة ل PN في مراحل مختلفة من التطور والشيخوخة. وبالتالي ، يجب أن تساعد هذه الأدوات في توضيح قدرة PN في أنسجة معينة والسماح بمراقبتها ، مع المساعدة في تحديد المكونات التي تعمل في الأنسجة المختلفة للتوسط في PN غير المستقل للخلية في الكائن الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتم مراقبة البروتين الخلوي من خلال شبكة معقدة من مكونات مراقبة جودة البروتين مثل المرافقين الجزيئيين واستجابات الإجهاد وآليات التحلل بما في ذلك نظام بروتيازوم اليوبيكويتين (UPS) والالتهام الذاتي1،2. يعد تنشيط مسارات الاستجابة للإجهاد ، مثل استجابة الصدمة الحرارية بوساطة HSF-1 (HSR) ، واستجابة البروتين غير المطوية للشبكة الإندوبلازمية (UPRER) والميتوكوندريا (UPRmito) أمرا حيويا للتكيف الخلوي والبقاء على قيد الحياة أثناء التحديات البيئية أو مرض سوء الطي البروتين الذي يؤدي إلى تراكم البروتين السام1،2،3،4،5 ، 6.

يتم تنسيق البروتين الخلوي بواسطة طبقة إضافية في الكائنات متعددة الخلايا ، مثل C. ايليجانس، والتي تتطلب تنسيق استجابات الإجهاد الخلوي عبر الأنسجة المختلفة لتنشيط مكونات مراقبة جودة البروتين الواقية مثل المرافقين الجزيئيين7. في العقد الماضي ، لوحظ تنشيط الخلية غير المستقل لمسارات الاستجابة للإجهاد "الخلوية" لاستجابة الصدمة الحرارية (HSR) ، و UPRER وUPR mito ، بالإضافة إلى إشارات المرافق عبر الخلايا (TCS) 3،4،7،8،9،10. في كل حالة ، يلعب الجهاز العصبي وكذلك الإشارات من الأمعاء دورا مهما في التحكم في تنشيط المرافقين عبر الأنسجة ، للحماية من العواقب السامة لضغوط البروتين الحادة والمزمنة3،5،9،11. يمكن تحقيق هذا الانتقال من الخلايا العصبية إلى الأمعاء والخلايا الأخرى في المحيط عن طريق الناقلات العصبية كما هو الحال بالنسبة ل UPRER و HSR6،8،11. في شكل واحد من إشارات الإجهاد غير المستقل للخلية ، TCS ، التي يتم تنشيطها عن طريق زيادة التعبير عن HSP-90 في الخلايا العصبية ، تلعب الببتيدات المناعية المفرزة دورا في تنشيط تعبير مرافق hsp-90 من الخلايا العصبية إلى العضلات5. في شكل آخر من أشكال TCS ، يؤدي تقليل التعبير عن المرافق الجزيئي الرئيسي hsp-90 في الأمعاء إلى زيادة التعبير عن hsp-70 المحفز للحرارة عند درجة حرارة متساهلة في عضلة جدار الجسم5،10. في هذه الحالة بالذات ، فإن جزيئات الإشارات المحددة التي يتم تنشيطها في الأمعاء التي تدرك الإجهاد وخلايا العضلات المستجيبة غير معروفة.

وبالتالي ، من أجل تحديد كيفية تنشيط تعبير المرافق من نسيج إلى آخر ، يلزم اتباع نهج يسمح بمراقبة قدرة شبكة البروتين (PN) وتنشيط استجابة الإجهاد على المستوى الخاص بالأنسجة. للتحقيق في مسار الاستجابة للإجهاد الذي يتم تنشيطه في الأنسجة الفردية ، يمكن استخدام مجموعة مختارة متاحة من مراسلي مرافقي النسخ المدمجين في علامات البروتين الفلوري (انظر أيضا الجدول 3). وتشمل هذه المراسلين النسخيين الموسومة بالفلورسنت hsp-90 و hsp-70 و hsp-16.2 الذين يشيرون إلى تحريض HSR و hsp-4 الذي يشير إلى تنشيط UPRER و hsp-6 ، مما يشير إلى الاستعراض الدوري الشامل للوحدات الشاملة. يسمح الجمع بين هؤلاء المراسلين مع حالة الإجهاد الخاصة بالأنسجة بقراءة قوية من شأنها تحديد الأنسجة الفردية التي تستجيب لاختلال توازن PN في نسيج "المرسل" البعيد الذي يدرك الإجهاد. للحث على حالة الإجهاد أو عدم توازن PN في نسيج معين ، يمكن اتباع طرق مختلفة. على سبيل المثال ، أحد هذه الأساليب هو التعبير خارج الرحم للشكل المنشط لعامل نسخ الإجهاد (على سبيل المثال ، xbp-1s) وآخر عن طريق تقليل مستويات التعبير عن مرافق جزيئي أساسي (على سبيل المثال ، hsp-90) باستخدام محفزات خاصة بالأنسجة8،10. لاستنفاد مكونات PN في نوع خلية واحد فقط ، فإن ضربة قاضية خاصة بالأنسجة بواسطة RNAi هي أداة مفيدة.

في C. ايليجانس، الحمض النووي الريبي هو ومع ذلك جهازي. يمكن أن يدخل الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في البيئة وينتشر في جميع أنحاء لإسكات الجين المستهدف12،13. يتم التوسط في هذا الانتشار الجهازي ل dsRNA المبتلع بواسطة بروتينات SID (معيبة RNAi الجهازية) ، مثل بروتينات SID-1 و SID-2 التي هي ناقلات dsRNA ، بالإضافة إلى SID-5 ، التي تتزامن مع بروتينات الجسيم الداخلي المتأخرة وتشارك في تصدير dsRNA المبتلع14،15،16. SID-1 هو بروتين متعدد التمريرات عبر الغشاء في جميع الخلايا باستثناء الخلايا العصبية ، وهو مطلوب لتصدير dsRNA وكذلك الاستيراد إلى الخلايا17. يقتصر تعبير SID-2 على الأمعاء حيث يعمل كمستقبل داخلي لابتلاع dsRNA من تجويف الأمعاء إلى سيتوبلازم خلايا الأمعاء16. تفتقر الخلايا العصبية إلى الاستجابة ل RNAi الجهازي ، وهذا يرتبط بانخفاض التعبير عن البروتين الغشائي SID-1 في الخلايا العصبية ، وهو أمر ضروري لاستيراد dsRNA15،18. وبالتالي ، لكي يكون الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة فعالا في نوع خلية واحد فقط ، يجب منع الانتشار الجهازي ل dsRNA. يمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام متحولة sid-1 (pk3321) المقاومة للحمض النووي الريبي والتي تمنع إطلاق وامتصاص dsRNA عبر الأنسجة15. يمكن أن يؤدي التعبير عن دبوس الشعر الخاص بالأنسجة RNAi في هذا الطفرة أو التعبير خارج الرحم ل SID-1 في نسيج معين إلى استكمال وظيفة sid-1 المتحور وسيسمح ب RNAi19 الخاص بالأنسجة.

إذن كيف يتم تناول dsRNA بواسطة الأمعاء في فقدان sid-1 للوظيفة المتحولة وكيف يمكن أن يصل بعد ذلك إلى الخلايا العصبية أو خلايا العضلات التي تعبر خارج الرحم عن بنية SID-1؟ في أحد النماذج الحالية التي تشرح هذه الآلية ، يتم امتصاص الحمض النووي الريبي dsRNA داخل الخلايا المعوية عبر SID-2 ثم يتم تصديره إلى الكولوسوم الكاذب بواسطة آلية مستقلة أخرى SID-1 ، بما في ذلك SID-5 وانتقالالفعل 17. وبالتالي ، نظرا لأن SID-1 مطلوب لاستيراد dsRNA17 ، فإن الخلايا التي تعبر عن النوع البري SID-1 فقط هي التي ستكون قادرة على امتصاص الحمض النووي الريبي dsRNA المنبعث من الأمعاء إلى الكاذب.

نوضح هنا استخدام مجموعة من الأدوات التي تسمح بالحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة. نستخدم مثال المرافق الجزيئي Hsp90 لوصف بناء RNAi دبوس الشعر الذي يمكن أن يكون مفيدا في تدمير التعبير الجيني بشكل أساسي في نسيج معين10. يمكن استخدام النهج الموصوف لأي جين مستهدف ذي أهمية. يمكن التحقق من استجابة الأنسجة الأخرى لاختلال توازن البروتينات الناجم عن hsp-90 RNAi الخاص بالأنسجة من خلال مراقبة التعبير عن مبلغي الإجهاد الموسومين بالفلورسنت في الأنسجة الأخرى. كطريقة ثانية ل RNAi الخاص بالأنسجة ، نوضح كيف يمكن تكييف نظام sid-1 المتحور لتغذية البكتيريا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي بدلا من التعبير عن بنية الحمض النووي الريبي لدبوس الشعر. يمكن أن يكون هذا مفيدا عند إجراء فحص RNAi مرشح أو على مستوى الجينوم لتحديد المكونات المطلوبة لاستجابة خاصة بالأنسجة. وبالمثل ، فإن عيوب النمو المرتبطة بنضوب مكون PN الحيوي ستتطلب ضربة قاضية بوساطة الحمض النووي الريبي في أنسجة معينة في مراحل لاحقة من التطور. نوضح كيف يمكن استخدام نظام تكميل SID-1 على شاشة RNAi المرشحة لمعدلات TCS الخاصة بالأنسجة. في المثال ، نهدف إلى تحديد مكونات الإشارات التي تؤدي عند الضربة القاضية في أنسجة المرسل "التي تدرك الإجهاد" (الأمعاء) والأنسجة المؤثرة على الإجهاد (العضلات) إلى التعبير المتغير عن مراسل hsp-70 الموسوم بالفلورسنت في خلايا العضلات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة بطريقتين: RNAi دبوس الشعر ومكملة SID-1 الخاصة بالأنسجة

  1. توليد دبوس الشعر RNAi يبنى للتعبير الخاص بالأنسجة في طفرات sid-1
    1. تضخيم تسلسل الجينات المستهدفة (على سبيل المثال ، تسلسل hsp-90 المعزول من استنساخ hsp-90 RNAi من مكتبة Ahringer RNAi20) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ضع تسلسلا غير متجانس في نهاية 3 'من تسلسل hsp-90 ، أي موقع SfiI (ATCTA) 21.
      ملاحظة: البادئات المستخدمة لاستنساخ hsp-90 بتسلسل SfiI (تحتها خط) هي:
      as-hsp90-SfiI 5'-GGCCATCTAGGCCCTGGGTTGATTTCGAGATGCT-3'
      AS-HSP90 5 'TCATGGAGAACTGCGAAGAGC-3'.
    2. استنساخ التسلسل المضخم في متجه مجموعة الاستنساخ التجاري (على سبيل المثال ، TOPO pCR BluntII).
    3. اعزل تسلسل hsp-90 المقلوب من استنساخ hsp-90 RNAi (مكتبة Ahringer RNAi) 20 عن طريق تقييد الهضم باستخدام مواقع تقييد XbaI و PstI ووضعه في اتجاه مجرى تسلسل hsp-90-SfiI في المتجه (من الخطوة 1.1.1) ، مما ينتج عنه بناء دبوس شعر hsp-90 (الشكل 1).
    4. استنساخ فرعي لبناء دبوس الشعر في متجه إدخال البوابة pDONR221 ودمجها مع استنساخ إدخال البوابة التي تحتوي على محفزات خاصة بالأنسجة لأي تعبير في الخلايا العصبية (rgef-1p) ؛ في الأمعاء (VHA-6p) ؛ أو عضلة جدار الجسم (unc-54p) و unc-54 3'UTR (أو أي 3'UTR آخر مفضل) في تفاعل البوابة كما هو موضح في بروتوكول المورد.
    5. خطي تركيبات RNAi لدبوس الشعر الناتج (الشكل 1) باستخدام موقع تقييد فريد خارج تسلسل الترميز والحقن الدقيق كمصفوفة معقدة بتركيز 1 نانوغرام / ميكرولتر بناء RNAi دبوس الشعر ، ممزوجا ب 100 نانوغرام / ميكرولتر N2 الحمض النووي الجيني بريستول (مهضوم باستخدام ScaI) في C. ايليجانس سلالة تعبر عن hsp-70p :: مراسل RFP (سلالة AM722) وعبرت إلى الخلفية الجينية ل sid-1 (pk3321) المسوخ (سلالة NL3321). للحصول على بروتوكول حول كيفية إجراء الحقن المجهري للمصفوفات المعقدة ، يرجى اتباع22.
    6. كعنصر تحكم سلبي ، استخدم تركيبات دبوس الشعر المتجه الفارغة التي تعبر عن التسلسل المحتوي على SfiI غير palindromic (GGCCATCTAGGCC) تحت سيطرة محفز خاص بالأنسجة.
    7. استخدم تعبير hsp-70p :: RFP المتزايد للمراسل كقراءة لتسجيل المحولات الإيجابية التي تعبر عن hsp-90 hairpin RNAi (الشكل 3). للحصول على نهج أكثر عمومية للتحقق من الضربة القاضية الخاصة بالأنسجة لأي جين ذي أهمية ، قم بقياس مستويات الرنا المرسال للحيوان بالكامل باستخدام qRT-PCR للجين المعني.
    8. دمج المصفوفة خارج الكروموسومات للسلالة الناتجة التي تعبر عن بنية دبوس الشعر hsp-90 الخاصة بالأمعاء (PVH2 ؛ انظر الجدول 1) عن طريق تشعيع جاما. لدمج المصفوفات خارج الكروموسومات في الجينوم ، يرجى الاطلاععلى 22.
  2. تعبير SID-1 الخاص بالأنسجة للسماح بالحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة عن طريق تغذية البكتيريا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي dsRNA
    1. استنساخ الحمض النووي الجيني sid-1 من المتجه TU867 (unc-119p:: SID-1) 19 في متجه إدخال البوابة pDONR221. يمكن العثور على بادئات لاستنساخ الحمض النووي sid-1 فيعام 19. قم بدمج بناء sid-1 pDONR221 مع استنساخ دخول البوابة التي تحتوي على محفزات محددة للعضلات- (myo-3p) أو الأمعاء (vha-6p) و unc-54 3'UTR (أو أي 3'UTR آخر مفضل) في تفاعل البوابة كما هو موضح من قبل في 1.1.4.
    2. حقن دقيق vha-6p الناتج :: SID-1 :: unc-54 3'UTR أو myo-3p :: SID-1 :: unc-54 3'UTR يبني بتركيز 30 نانوغرام / ميكرولتر جنبا إلى جنب مع علامة الحقن المشترك للبلعوم الفلوري الأحمر (على سبيل المثال ، myo-2p :: RFP ؛ 5 نانوغرام / ميكرولتر) في طفرات sid-1 (pk3321 ).
    3. دمج مصفوفات sid-1 الخاصة بالأمعاء خارج الكروموسومات أو العضلات في الجينوم كما هو موضح في22. هنا ، نتج عن ذلك سلالات PVH5 [myo-3p :: SID-1 ؛ myo-2p :: RFP] ؛ sid-1 (pk3321) و PVH65 [vha-6p :: SID-1 ؛ myo-2p :: RFP] ؛ SID-1 (PK3321).
    4. للتعبير الخاص بالخلايا العصبية ل sid-1 في متحولة sid-1 (pk3321 ) ، استخدم سلالة TU3401 uIs3401 [unc-119p :: SID-1 ؛ myo-2p :: RFP] ؛ sid-1 (pk3321) الذي تم إنشاؤه مسبقا بواسطة Calixto et al.19.
    5. كما هو مذكور في 1.1.7 ، تأكد من ضربة قاضية خاصة بالأنسجة للجين محل الاهتمام عن طريق قياس مستويات الرنا المرسال للجين المستهدف المطلوب بواسطة qRT-PCR. بدلا من ذلك ، تأكد من حساسية الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة باستخدام بروتين فلوري (على سبيل المثال ، GFP أو RFP) معبرا عنه في نفس النسيج وعالج الديدان باستخدام GFP أو RFP RNAi. تعرض الديدان الخيطية ل GFP / RFP RNAi مثل يرقات المرحلة L1 المتزامنة وتنمو على بكتيريا الحمض النووي الريبي حتى اليوم الأول من مرحلة البلوغ (انظر الشكل 2). في حالتنا ، استخدمنا سلالات تعبر عن SID-1 في الخلايا العصبية أو العضلات أو الأمعاء وعبرنا إلى سلالات تعبر عن HSP-90 :: RFP في الخلايا العصبية (AM987) ، في الأمعاء (AM986) وفي العضلات (AM988).

2. استخدام مراسلي الإجهاد وأجهزة استشعار البروتين لمراقبة البروتين المستقل للخلية والخلايا غير المستقلة

ملاحظة: لمراقبة سعة PN في أنسجة معينة ، استخدم مستشعرات البروتين الخاصة بالأنسجة (مثل السلالات التي تعبر عن Q44 في الأمعاء أو Q35 في العضلات - انظر الجدول 3) ومراسلي الإجهاد (مثل hsp-70p :: mCherry المحفز للحرارة ؛ الجدول 3).

  1. عبور الأليل المتحور sid-1 (pk3321) وراثيا إلى سلالة مستشعر البروتينات وتأكيد وجود sid-1 (pk3321) عن طريق تغذية الحمض النووي الريبي
    1. اعبر وراثيا سلالة مستشعر البروتينات / مراسل الإجهاد في الخلفية الجينية للسلالة المتحولة sid-1 (pk3321 ). لإنشاء تهجينات جينية بين السلالات المعدلة وراثيا المختلفة ، يرجى اتباع23 للحصول على بروتوكول مفصل.
      ملاحظة: طفرات sid-1 (pk3321) مقاومة لتغذية الحمض النووي الريبي ، وبالتالي فإن علاج الأجنة باستخدام الحمض النووي الريبي ضد جين أساسي (مثل elt-2 أو hsp-90) لن يؤدي إلا إلى اعتقالات النمو أو فتاكة اليرقات في السلالات متغايرة الزيجوت أو النوع البري لجين sid-1.
    2. دع 10 خنثى يضع بيضا على ألواح RNAi ضد elt-2 أو hsp-90 والتحكم (ناقل فارغ ؛ EV) لوحات RNAi عند 20 درجة مئوية. قم بإزالة الأمهات بعد 1-2 ساعة. استخدم N2 Bristol و sid-1 (pk3321) المتحولة كضوابط.
    3. راقب تطور اليرقات على صفائح الحمض النووي الريبي خلال 2-3 أيام القادمة. ELT-2 سيؤدي RNAi إلى توقف اليرقات L1 ، بينما ينتج عن hsp-90 RNAi توقف يرقات L3 في N2 بريستول. لن تتأثر طفرات sid-1 بعلاج RNAi وستتطور إلى بالغين حاملين.
      ملاحظة: C. ايليجانس متماثل الزيجوت ل sid-1 (pk3321) سيظهر مجموعة سكانية موحدة تتطور إلى مرحلة البلوغ. سيتم الإشارة إلى الزيجوت المتغايرة من خلال مجموعات مختلطة من بعض تظهر توقف اليرقات ، وبعض التي تتطور إلى بالغين.
  2. تأكيد وجود sid-1 (pk3321) عن طريق التنميط الجيني
    1. اختر 15-20 دودة من سلالة F2 المرشحة المختارة في أنبوب PCR يحتوي على 15 ميكرولتر من محلول تحلل الدودة (الجدول 2).
    2. ضع الأنبوب عند -80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل أو طوال الليل.
    3. احتضان الأنبوب في جهاز PCR باستخدام البرنامج التالي:
    4. 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة (دودة الليز) ؛ 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (تعطيل البروتيناز K) ؛ استمر في 4 درجات مئوية.
    5. استخدم 2 ميكرولتر من تحلل الدودة ك "قالب" لإجراء تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل للتنميط الجيني ، باستخدام البادئات التالية ل sid-1: sid-1 forw: 5'-agctctgtacttgtattcg-3' و sid-1 rev: 5'-gcacagttatcagatttg-3'.
    6. استخدم البرنامج التالي للتنميط الجيني PCR: دورة واحدة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ؛ ثم 30 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ، و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ؛ 1 دورة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، مع الاستمرار في 4 درجات مئوية.
    7. قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ~ 650 نقطة أساس باستخدام مجموعة تنقية PCR (جدول المواد) وتسلسل منتج sid-1 PCR لتحديد طفرة نقطة G-to-A لأليل sid-1 (pk3321 ). بدلا من ذلك ، تنشئ طفرة نقطة G-to-A موقع تقييد ApoI ، والذي يمكن استخدامه على منتج PCR للتنميط الجيني كما هو موضح في24.
  3. استخدام iQ44::YFP كمستشعر للبروتين للأمعاء
    1. مزامنة C. ايليجانس تعبر عن Q44 :: YFP في الأمعاء (سلالة OG412) أو عبرت إلى الخلفية الطافرة sid-1 (pk3321) عن طريق التبييض ، باتباع البروتوكول الموضح في25. صفيحة L1 متزامنة على صفيحة نمو الديدان الخيطية 9 سم (NGM) تحتوي على بكتيريا OP50 وتنمو حتى المرحلة L4 عند 20 درجة مئوية.
    2. اجمع L4 عن طريق غسل الديدان من اللوحة باستخدام 5 مل من المخزن المؤقت M9. انقل المخزن المؤقت M9 الذي يحتوي على ديدان L4 إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام ماصة زجاجية أو ماصة بلاستيكية مصقولة بالسيليكون ، وجهاز طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لحبيبات الديدان برفق. قم بإزالة المادة الطافية بعناية ، مع التأكد من ترك حبيبات الدودة دون إزعاج.
    3. الخطوة الحرجة: لنقل الديدان الخيطية أو إخراجها ، استخدم ماصة زجاجية أو طرف ماصة بلاستيكية تمت معالجتها بعامل سيليكون (على سبيل المثال ، SigmaCote) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. هذا يمنع التصاق الديدان بالسطح البلاستيكي لطرف الماصة.
    4. كرر الخطوة 2.3.2 ثلاث مرات أخرى لغسل جميع بكتيريا OP50 من الديدان.
    5. خذ حبيبات الدودة في 5 مل من المخزن المؤقت M9 واحسب عدد الديدان الموجودة في 10 ميكرولتر.
    6. لوحة L4 على صفائح NGM Agar مقاس 6 سم تحتوي على بكتيريا التحكم في النواقل الفارغة (EV) أو بكتيريا hsp-90 RNAi بكثافة 10 ديدان لكل صفيحة (تحضير 5 لوحات لكل نقطة زمنية وتكرار بيولوجي) وتحتضن لمدة 24-48 ساعة عند 20 درجة مئوية.
    7. بعد 24 ساعة (= اليوم 1 للبالغين) و 48 ساعة (= اليوم 2 للبالغين) احسب عدد بؤر Q44 في أمعاء الديدان الخيطية التي تظهر الركام. سجل ما مجموعه 30-50 ديدان خيطية لكل تكرار بيولوجي.

3. فحص RNAi المرشح الخاص بالأنسجة لمعدلات البروتين الخلوي غير المستقل

ملاحظة: بالنسبة لشاشة RNAi الخاصة بالأنسجة ، استخدمنا سلالة PVH172 التي تسمح ب RNAi الخاص بالأمعاء عن طريق تغذية بكتيريا RNAi وإجهاد PVH171 مما يسمح ب RNAi الخاص بالعضلات (انظر الجدول 1 للنمط الجيني).

  1. تحضير لوحات RNAi المرشحة
    1. قم بإعداد ألواح أجار NGM مقاس 6 سم مكملة ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين و 1 ملي مولار IPTG وفقا للطرق القياسية25.
    2. استخدم مكتبة Ahringer RNAi للحصول على استنساخ RNAi المرشح لشاشة RNAi20.
    3. تلقيح 3 مل من وسائط LB-amp (50 ميكروغرام/مل أمبيسلين في وسائط LB) في أنبوب سعة 15 مل باستخدام استنساخ RNAi المطلوب باستخدام طرف ماصة بلاستيكي. تنمو عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع التحريض.
    4. في اليوم التالي ، أضف Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid (IPTG) (من مخزون 1 M) إلى التركيز النهائي البالغ 1 ملي مولار في الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها.
    5. حرك الثقافات لمدة 3 ساعات أخرى عند 37 درجة مئوية.
    6. صفيحة 300 ميكرولتر من ثقافة الحمض النووي الريبي البكتيرية على صفيحة أجار NGM مقاس 6 سم مكملة ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين و 1 ملي IPTG. دع الأطباق تجف على المقعد لمدة يومين في درجة حرارة الغرفة ، مغطاة بورق الألمنيوم للحماية من الضوء. بمجرد أن تجف ، يمكن تخزين ألواح RNAi في صندوق عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.
  2. تزامن C. ايليجانس والعلاج مع بكتيريا الحمض النووي الريبي
    1. لمزامنة سلالات الديدان ، اختر 15 بالغا حاملا على ألواح الحمض النووي الريبي واتركها تضع البيض لمدة ساعة واحدة. ثم أخرج البالغين من اللوحة.
    2. الخطوة الحرجة: يتم تجنب التزامن عن طريق التبييض في هذه الحالة ، لأنه يمكن أن يحفز مراسل hsp-70p :: RFP ، لأنه حالة مرهقة ل C. ايليجانس.
    3. اختر يرقات المرحلة L4 المتزامنة وانقلها إلى صفيحة RNAi جديدة.
    4. اسمح للديدان الخيطية بالنمو على الحمض النووي الريبي ذي الصلة لمدة جيلين لضمان الامتصاص الفعال ل dsRNA ، مع التأكد من الحفاظ على درجة الحرارة عند 20 درجة مئوية.
    5. للتصوير والقياس الكمي الفلوري hsp-70p ::RFP ، استخدم البالغين في اليوم 1.
  3. تحضير شرائح المجهر
    1. قم بإعداد شرائح المجهر عن طريق وضع ~ 250 ميكرولتر من محلول الاغاروز بنسبة 2٪ (في المخزن المؤقت M9) على شريحة مجهر زجاجي ومكان شريحة ثان في الأعلى لإنشاء قرص مسطح.
    2. ضع 5 ميكرولتر من محلول الليفاميزول 5 ملي (في المخزن المؤقت M9) على وسادة الاغاروز المحددة وانقل الديدان البالغة لمدة 5 يوم 1 إلى قطرة الليفاميزول. اترك الديدان الخيطية لتشلل لمدة 5 دقائق.
    3. بمجرد أن تصاب C. elegans بالشلل ، قم بمحاذاة بعناية باستخدام سلك بلاتيني وقم بإزالة الليفاميزول الزائد بمنديل مختبري قبل إضافة غطاء الغطاء.
    4. الخطوة الحاسمة: تأكد من التقاط صور للديدان في غضون 30 دقيقة بعد تحضير شرائح المجهر. يمكن أن تجف الديدان الخيطية المشلولة على شريحة المجهر وتنفجر ، مما قد يضر بقياسات التألق.
  4. إعدادات المجهر وتحليل الصور
    ملاحظة: يتم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر مزود بكاميرا EM-CCD وبرنامج أتمتة الصور المجهرية وتحليل الصور.
    1. التقط صورا بتكبير 10x باستخدام ليزر 561 نانومتر لإثارة مضان RFP. تأكد من التقاط جميع الصور باستخدام نفس الإعدادات لطاقة الليزر وحجم الثقب وكسب التألق لتمكين المقارنات.
    2. احفظ جميع الصور كملفات TIFF.
    3. قم بإجراء تحليل الصور باستخدام ImageJ. قم بقياس شدة التألق في كل صورة كوحدات بكسل لكل وحدة مساحة ، مع طرح مضان الخلفية. تطبيع شدة التألق لكل صورة إلى منطقة الصورة بالإضافة إلى طول الديدان.
    4. قياس متوسط الشدة باستخدام التحليل | القياس في ImageJ. تطبيع قيمة الكثافة الناتجة لمنطقة الصورة بقسمة الكثافة على المنطقة.
    5. لتطبيع شدة طول الدودة ، قم بقياس الدودة عن طريق رسم خط على طول الدودة في ImageJ واستخدام تحليل | قياس. سبب تطبيع شدة التألق إلى طول الدودة ، هو أن الديدان يمكن أن تختلف في الحجم ، اعتمادا على الجين الذي يتم إسقاطه بواسطة الحمض النووي الريبي ، وهذا يمكن أن يؤثر على متوسط الشدة.
    6. تطبيع شدة التألق المقاسة للضوابط غير المعالجة (أي C . نمت elegans على لوحات التحكم (EV) RNAi). اجمع القيم الطبيعية لمقارنة متوسط شدة التألق لكل حالة RNAi. تهدف إلى تصوير 20 دودة لكل تكرار بيولوجي وجمع ما لا يقل عن 3 صور بيولوجية مكررة.
    7. احسب القيم P لمتوسط قيم شدة التألق باستخدام اختبار t للطالب وقم بإجراء تصحيح للاختبارات المتعددة باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg ، باستخدام معدل اكتشاف خاطئ قدره 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحمض النووي الريبي الخاص بالأنسجة بطريقتين: التعبير عن تركيبات دبوس الشعر أو تكميل SID-1 الخاص بالأنسجة
يسمح التعبير عن تركيبات RNAi الخاصة بالأنسجة بالضربة القاضية التأسيسية للجين طوال فترة التطور. ومع ذلك ، قد يكون هذا غير عملي في بعض الأحيان عندما يكون الجين الذي تم مسحه مطلوبا لتكوين الأعضاء لهذا النسيج المعين ، مثل elt-2 المطلوب لنمو الأمعاء26. يتميز تعبير SID-1 الخاص بالأنسجة في طفرات sid-1 المقاومة للحمض النووي الريبي بميزة خاصة تتمثل في أنه يمكن توقيت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح الطرق الموضحة هنا استخدام الأدوات التي تسمح بالضربة القاضية الخاصة بالأنسجة لمكونات PN بطريقة تأسيسية وزمانية. لقد حددنا سابقا TCS ، وهي آلية استجابة للإجهاد غير المستقلة للخلية ناتجة عن التغيير الخاص بالأنسجة لمستويات تعبيرHsp90 10. تؤدي ضربة قاضية خاصة بالأنسجة ل hsp-90 عن طريق التعبير عن RNAi دبوس الشعر إلى تنظيم الخلية غير المستقل لتعبير مرافق hsp-70 الواقي في الأنسجة البعيدة ، مما يزيد من مقاومة الإجهاد العضوي10....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور ريتشارد آي موريموتو على توفير سلالة AM722. بعض C. ايليجانس السلالات المستخدمة في هذا البحث تم توفيرها من قبل مركز Caenorhabditis Genetics ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). P.V.O.-H. تم تمويله من خلال منح من NC3Rs (NC / P001203/1) ومن خلال جائزة Wellcome Trust Seed (200698 / Z / 16 / Z). تم دعم JM من خلال شراكة تدريب الدكتوراه MRC DiMeN (MR / N013840/1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

بروتوكول بروتوكول بروتوكول

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أمبيسلينميركA0166-5Gالقسم 3.1.
الحمض النووي نظيف & المكثف -500Zymo ResearchD4031القسم 2.2 من البروتوكول.
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactosideMerck367-93-1القسم 3.1 من البروتوكول.
مجموعة استنساخ البوابة متعددة المواقعThermo Fisher12537100بروتوكول القسم 1.2.
SigmaCoteMerckSL2-25mLالقسم 2.3.
التتراسيكلينMerckT7660-5Gالقسم 3.1.
طقم استنساخ Zero Blunt TOPO PCRThermo FisherK280002القسم 1.1 من بروتوكول Thermo Fisher.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 76, 91-99 (2011).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 421-435 (2019).
  3. Imanikia, S., Özbey, N. P., Krueger, C., Casanueva, M. O., Taylor, R. C. Neuronal XBP-1 Activates Intestinal Lysosomes to Improve Proteostasis in C. elegans. Current Biology. 29, 2322-2338 (2019).
  4. Berendzen, K. M., et al. Neuroendocrine Coordination of Mitochondrial Stress Signaling and Proteostasis. Cell. 166, 1553-1563 (2016).
  5. O'Brien, D., et al. A PQM-1-Mediated Response Triggers Transcellular Chaperone Signaling and Regulates Organismal Proteostasis. Cell Reports. 23, 3905-3919 (2018).
  6. Tatum, M. C., et al. Neuronal Serotonin Release Triggers the Heat Shock Response in C. elegans in the Absence of Temperature Increase. Current Biology. 25, 163-174 (2015).
  7. Miles, J., Scherz-Shouval, R., van Oosten-Hawle, P. Expanding the Organismal Proteostasis Network: Linking Systemic Stress Signaling with the Innate Immune Response. Trends in Biochemical Sciences. 44, 927-942 (2019).
  8. Taylor, R. C., Dillin, A. XBP-1 Is a Cell-Nonautonomous Regulator of Stress Resistance and Longevity. Cell. 153, 1435-1447 (2013).
  9. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the Cellular Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans by Thermosensory Neurons. Science. 320, 811-814 (2008).
  10. van Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of Organismal Proteostasis by Transcellular Chaperone Signaling. Cell. 153, 1366-1378 (2013).
  11. Frakes, A. E., et al. Four glial cells regulate ER stress resistance and longevity via neuropeptide signaling in C. elegans. Science. 367, 436-440 (2020).
  12. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854(1998).
  13. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  14. Hinas, A., Wright, A. J., Hunter, C. P. SID-5 is an endosome-associated protein required for efficient systemic RNAi in C. elegans. Current Biology. 22, 1938-1943 (2012).
  15. Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans Requires the Putative Transmembrane Protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
  16. McEwan, D. L., Weisman, A. S., Hunter, C. P. Uptake of extracellular double-stranded RNA by SID-2. Molecular Cell. 47, 746-754 (2012).
  17. Whangbo, J. S., Weisman, A. S., Chae, J., Hunter, C. P. SID-1 Domains Important for dsRNA Import in Caenorhabditis elegans. G3 GenesGenomesGenetics. 7, 3887-3899 (2017).
  18. Feinberg, E. H., Hunter, C. P. Transport of dsRNA into cells by the transmembrane protein SID-1. Science. 301, 1545-1547 (2003).
  19. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7, 554-559 (2010).
  20. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
  21. Lee, Y. S., Carthew, R. W. Making a better RNAi vector for Drosophila: use of intron spacers. Methods (San Diego CA). 30, 322-329 (2003).
  22. Evans, T. Transformation and microinjection. WormBook. , (2006).
  23. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. , (2006).
  24. Lim, M. A., et al. Reduced Activity of AMP-Activated Protein Kinase Protects against Genetic Models of Motor Neuron Disease. Journal of Neuroscience. 32, 1123-1141 (2012).
  25. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  26. Hawkins, M. G., McGhee, J. D. elt-2, a second GATA factor from the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 270, 14666-14671 (1995).
  27. Bharadwaj, S., Ali, A., Ovsenek, N. Multiple components of the HSP90 chaperone complex function in regulation of heat shock factor 1 In vivo. Molecular and Cellular Biology. 19, 8033-8041 (1999).
  28. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9, 1003466(2013).
  29. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14914-14919 (2009).
  30. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 10417-10422 (2002).
  31. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine Proteins at the Pathogenic Threshold Display Neuron-Specific Aggregation in a Pan-Neuronal Caenorhabditis elegans Model. Journal of Neuroscience. 26, 7597-7606 (2006).
  32. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin Signaling and the Heat Shock Response Modulate Protein Homeostasis in the Caenorhabditis elegans Intestine during Infection. Journal of Biological Chemistry. 283, 194-201 (2008).
  33. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. , e52321(2015).
  34. Qadota, H., et al. Establishment of a tissue-specific RNAi system in C. elegans. Gene. 400, 166-173 (2007).
  35. Zou, L., et al. Construction of a germline-specific RNAi tool in C. elegans. Scientific Reports. 9, 1-10 (2019).
  36. Silva-García, C. G., et al. Single-Copy Knock-In Loci for Defined Gene Expression in Caenorhabditis elegans. G3 Bethesda Md. 9, 2195-2198 (2019).
  37. Chang, J. T., Kumsta, C., Hellman, A. B., Adams, L. M., Hansen, M. Spatiotemporal regulation of autophagy during Caenorhabditis elegans aging. eLife. 6, 18459(2017).
  38. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7, 473-478 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cell Nonautonomous ProteostasisProtein Quality ControlGenetic KnockdownStress ReportersProteostasis SensorsHairpin RNAi ConstructsTissue Specific KnockdownBehavioral Assays
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة