مقالة منهجية

طريقة الكشف الكمي عن microRNAs في الكلى لنموذج فأر إصابة الكلى الإقفارية

DOI:

10.3791/61378

⸱

سبتمبر 11, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة بروتوكولا للكشف عن تعبير الحمض النووي الريبي الصغير في الكلى لنموذج فأر إصابة الكلى الحادة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي في الوقت الفعلي. يؤكد هذا البروتوكول على نموذج فأر إصابة الكلى الإقفارية والاستخراج الدقيق لعينات الحمض النووي الريبي الدقيق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشارك MicroRNAs (miRNAs) في حالات مرضية مختلفة وهي مؤشرات حيوية فعالة للتشخيص المبكر للأمراض والعلاج في الفئران. ومع ذلك ، فإن البروتوكولات القياسية لتنقية miRNAs والكشف عن تعبيرها في الكلى من الفئران المصابة بإصابة الكلى الحادة (AKI) لم يتم ترسيخها بشكل جيد. طورت هذه الدراسة بروتوكولا فعالا وبسيطا لتنقية وقياس miRNAs في الكلى لنموذج فأر AKI الناجم عن نقص تروية الكلى وإعادة تروية الكلى باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR). يتكون هذا البروتوكول من خمس خطوات: 1) تحريض AKI عن طريق نقص تروية الكلى ، 2) حصاد الكلى ، 3) تنقية الحمض النووي الريبي الكلي ، بما في ذلك miRNAs ، من الكلى ، 4) تخليق (كدنا) عن طريق النسخ العكسي ل miRNA ، و 5) qRT-PCR للكشف عن تعبير miRNA. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن إنشاء نموذج إصابة نقص التروية الكلوي بأشكال خفيفة إلى شديدة من AKI. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم اتباع الإجراء بشكل صحيح ، فيمكن الحصول على نموذج AKI متسق مع الحد الأدنى من الاختلافات الفردية. يظهر اختبار qRT-PCR نطاقا ديناميكيا واسعا جدا ويتيح تمييز miRNAs الناضجة ، والتي يمكن قياسها بدقة مع خصوصية عالية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة ملف تعريف تعبير miRNA في كلى AKI.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل إصابة التروية وإعادة التروية (IRI) في الكلى أحد عوامل الخطر الرئيسية لتطور إصابة الكلى الحادة (AKI)1. يلعب AKI دورا مهما في تشخيص المريض ، ولكن لم يتم إنشاء علاجات محددة ومؤشرات حيوية تشخيصية مبكرة.

MicroRNAs (miRNAs) هي RNAs قصيرة غير مشفرة مع ما يقرب من 18-25 قاعدة. miRNAs مستقرة في سوائل الجسم ، وتسلسلها محفوظة بشكل كبير بين2. تنظم MiRNAs التعبير عن بروتينات متعددة من خلال آلاف الأهداف ، وبالتالي تؤثر على مسارات الإشارات المتنوعة2،3،4،5،6،7،8. في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ عن أن miRNAs متورطة في حالات مرضية مختلفة وهي مؤشرات حيوية فعالة للتشخيص المبكر للعديد من الأمراض.

الهدف العام لهذا البروتوكول هو تنقية واكتشاف miRNAs بنجاح في الكلى لنموذج فأر AKI الناجم عن IRI. نموذج IRI هذا هو نموذج مستخدم على نطاق واسع ل AKI والتليف الكلوي. تشمل مزايا نموذج IRI القدرة على التأكيد بصريا على ما إذا كان قد تم تحقيق نقص التروية وإعادة التروية وتحديد الوقت الدقيق لظهور AKI. ومع ذلك ، فإن مدة المشبك الطويلة بما يكفي لإحداث تلف أنبوبي واسع ترتبط بمعدل وفيات مرتفع ، في حين أن مدة المشبك القصيرة لا تسبب تلفا أنبوبي ، مما يؤدي إلى اختلاف كبير في تطور الضرر الأنبوبي في هذا النموذج التجريبي. بالمقارنة مع نموذج التثبيت الثنائي ، فإن نسيج استئصال الكلية الأيمن الذي يتم حصاده في نموذج IRI الكلوي أحادي الجانب يعمل كعنصر تحكم ويضمن الفشل الكلوي.

يتم هرس عينة الكلى باستخدام الخالط الزجاجي ، حيث يتم فصل البروتينات والأحماض النووية ، ويتم فصل الحمض النووي والحمض النوويالريبي 9. يتم تنقية الحمض النووي الريبي الكلي ، بما في ذلك miRNA ، من عينة الكلىباستخدام عمود الدوران 9 القائم على غشاء السيليكا. بعد ذلك ، يتم إجراء تخليق (كدنا) (النسخ العكسي) من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام بوليميراز بولي (أ) وأوليغو-دي تي10. أخيرا ، يتم تحديد تعبير miRNA بواسطة qRT-PCR باستخدام صبغة متداخلة10. يمكن ل qRT-PCR تحديد التعبير الجيني بدقة أكبر مقارنة بتفاعل البوليميراز المتسلسل لأحجام التضخيم عند نقاط النهاية. يقيس qRT-PCR التركيزات العالية ويتميز بنطاق ديناميكي واسع ، مما يسمح بالقياس الكمي الدقيق الذي يعتمد على عدد الدورات. أفادت الدراسات السابقة أنه يمكن استخدام العمليات البسيطة لتنقية واكتشاف miRNAs بشكل فعال فيالأنسجة 8،9،10. تم الإبلاغ عن الطرق الموضحة في هذا البروتوكول لتخليق (كدنا) (النسخ العكسي) والكشف عن تعبير الحمض النووي الريبي المرسال بواسطة qRT-PCR باستخدام صبغة متداخلة لإظهار دقة وحساسية عالية10.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا البروتوكول بسيط ويحقق نتائج متسقة بين المختبرات. لذلك ، فإن هذا البروتوكول مفيد في الدراسات التي تتطلب اكتشاف miRNA عالي الدقة والحساسية في كلى AKI للفأر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية على من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة جيتشي الطبية وتم إجراؤها وفقا لإرشادات استخدام ورعاية التجارب من دليل جامعة جيتشي الطبية لحيوانات المختبر.

1. نموذج IRI

ملاحظة: راقب بعناية انخفاض حرارة الجسم وترطيب الأمعاء وعمق التخدير طوال العملية.

  1. قم بإعداد العناصر التالية: أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل يحتوي على قطن مبلل بالأيزوفلوران ، ووسادة جراحية ساخنة ، وطبق بتري مع محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ومقص جراحي ، وملقط. حافظ على PBS عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تم إنشاء نموذج IRI هذا باستخدام ذكور الفئران C57BL / 6 (9 أسابيع ؛ 20-25 جم) الموجودة في غرفة ذات درجة حرارة ورطوبة خاضعة للرقابة ودورة فاتحة وظلام مدتها 12 ساعة.
  2. تخدير باستخدام الأيزوفلوران: تركيز الحث 3٪ -5٪ ، تركيز الصيانة 2٪ -3٪ ، والتركيز أثناء التثبيت 1٪ -1.5٪. تأكيد عمق التخدير عن طريق فقدان ردود الفعل. يتميز التخدير الاستنشاقي بأنه يمكن تعديل الوقت. قد يستغرق الإجراء وقتا طويلا بسبب تقشير الأنسجة المحيطة بالكلى. ومع ذلك ، فإن عيب التخدير الاستنشاقي هو أن درجة حرارة الجسم تميل إلى الانخفاض. طوال العملية ، تجنب التخدير غير الضروري.
  3. قم بتركيب الفأر المخدر على وسادة جراحية ساخنة على ظهره ، وقم بإزالة الشعر المحيط بمنطقة الشق ، ورش جلد البطن للفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  4. قم بعمل شق خط الوسط في جلد البطن والعضلات والغشاء البريتوني باستخدام المقص والملقط.
  5. باستخدام قطعة قطن مبللة ب PBS ، ادفع الأمعاء برفق باتجاه الجانب الأيسر من التجويف خارج البطن ، مع تعريض الكلية اليمنى والحالب. من المحتمل أن يتسبب وقت الإجراء الطويل في إصابة معوية بعد الجراحة. وبالتالي ، من الأفضل العمل دون إزالة الأمعاء من تجويف البطن عندما يمكن الحصول على مجال بصري. تجنب جفاف الأمعاء. يمكن أن تسبب المسحات الجافة أو الشاش تلفا في الأمعاء.
  6. ارفع الحالب الأيمن باستخدام ملقط بزاوية. اربط الحالب الأيمن مرتين باستخدام 4/0 خيوط مضفرة بالحرير. قطع بين الغرز ، مع ترك الخيط الأقرب إلى الكلى لفترة أطول.
  7. أمسك الخيط المتبقي بعناية دون سحب الكثير ، وقم بتشريح النسيج الضام والدهون بصراحة على طول الكلى. يقلل إجراء الجراحة من الخلف من خطر تلف الكبد.
    1. تحديد وعاء دموي، بخلاف الشرايين الكلوية والأوردة، الذي يمد الدم إلى الكلية اليمنى، ثم ربطه أو قصه. عندما يتم فصل الكلية اليمنى بشكل كاف ، قم بربط الشريان الكلوي الأيمن والوريد باستخدام خياطة مضفرة بالحرير 4/0. بدلا من الخياطة ، استخدم مشبك مرقئ.
    2. باستخدام قطعة قطن مبللة ب PBS ، ادفع الأمعاء برفق باتجاه الجانب الأيمن من التجويف خارج البطن لكشف الكلية اليسرى ، ثم قم بتغطية الأمعاء بستارة مبللة لمنعها من الجفاف. تشريح النسيج الضام والدهون حول الكلية اليسرى.
  8. تحديد وعاء دموي ، بخلاف الشرايين الكلوية والأوردة ، الذي يمد الدم إلى الكلية اليسرى ، ثم ربطه أو قصه. مشبك الشريان الكلوي والوريد الكلوي للحث على نقص تروية الكلى اليسرى. ضع المشبك المرقئ على بعد حوالي 1 سم من الكلى لتجنب تلف الحمة الكلوية. يمكن تأكيد نقص التروية الناجح بصريا من خلال سواد الكلى التدريجي المنتظم.
  9. إعادة الأمعاء إلى تجويف البطن ، مع الحرص على تجنب التواء الأمعاء ؛ أغلق جلد البطن مؤقتا والستارة للحفاظ على بيئة رطبة. قلل من تركيز التخدير الاستنشاقي قدر الإمكان وحاول إبقاء دافئا. وقت التثبيت هو 25-45 دقيقة. يؤدي وقت التثبيت الأطول إلى تلف كلوي أكثر خطورة ولكنه يزيد أيضا من معدل الوفيات على المدى الطويل. اضبط من خلال تحليل نتائج علم الأمراض.
  10. قم بإزالة المشبك بعد انتهاء فترة نقص التروية. تأكد من تحسن تدفق الدم وإعادة تروية الكلى ولون الكلى. تأكد من عدم التواء الأمعاء قبل إغلاق جلد البطن. غرس PBS داخل الصفاق كمكمل حجمي قبل إغلاق البطن في طبقتين. أغلق جلد البطن باستخدام 4-0 خيوط نايلون. لفترات أطول لإزالة الكلى ، يمكن تقليل احتمالية الالتصاقات المعوية عن طريق إغلاق جدار البطن والصفاق بشكل منفصل.
  11. لتقليل خطر الإصابة بالعدوى بعد الجراحة ، ضع مطهر (على سبيل المثال ، محلول اليود / الكحول) على منطقة الجراحة.

2. جمع عينات الكلى

ملاحظة: يحتوي هذا الفيديو على وقت تثبيت مدته 45 دقيقة ، حيث يجمع الكلى بعد 24 ساعة.

  1. تخدير بنسبة 5٪ من الأيزوفلوران وتأكيد عمق التخدير عن طريق فقدان ردود الفعل.
  2. قم بعمل شق خط الوسط في جلد البطن والعضلات والغشاء البريتوني باستخدام المقص والملقط. اجمع الدم من الوريد الأجوف السفلي المثقوب بإبرة 27 جراما.
  3. قم بعمل شق خط الوسط في جدار الصدر وأدخل إبرة 23 جم في البطين الأيسر. تأكيد التدفق العكسي. قم بعمل شق في الكبد وحقن 20 مل من PBS. أثناء تصريف الدم ، يتغير لون الكبد من الأحمر إلى الوردي ، مما يؤكد أنه تم تصريف كمية كافية من الدم.
  4. قم بإزالة الكلية اليسرى باستخدام الملقط والمقص واغسلها باستخدام PBS في طبق بتري. قم بإزالة اللفافة الكلوية باستخدام الملقط ، مع الحرص على عدم تجفيف الكلى.
  5. اقطع الكلية إلى نصفين واستخدم نصفها لعلم الأنسجة والنصف الآخر للخطوة التالية. تجنب الحوض الكلوي ، وحصاد 30 مجم من الكلى. قم بتخزينه في درجة حرارة -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.

3. تنقية miRNAs من عينات الكلى

ملاحظة: هنا ، يتم تجانس عينات الكلى التي تزن 30 مجم باستخدام الخالط الزجاجي ونظام تمزيق البوليمر الحيوي في عمود دوران الطرد المركزي الدقيق. بعد ذلك ، يتم عزل miRNA من عينة الكلى باستخدام عمود دوران قائم على غشاء السيليكا.

  1. قم بإعداد العناصر التالية: أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 أو 2.0 مل ، والإيثانول 100٪ ، والكلوروفورم ، والخالط الزجاجي ، والثلج ، ونظام تمزيق البوليمر الحيوي في عمود تدور جهاز الطرد المركزيالدقيق 9 ، وأعمدة الدوران القائمة على غشاءالسيليكا 9 ، وكاشف التحلل القائم على الفينول / الجوانيدين ، ومخزن الغسيل المحتوي على الجوانيدين والإيثانول (مخزن الغسيل 1) ، ومخزن الغسيل المحتوي على الإيثانول (مخزن الغسيل 2).
  2. ضع عينة كلى 30 مجم في الخالط الزجاجي وأضف 700 ميكرولتر من كاشف التحلل القائم على الفينول / الجوانيدين. قم بتنفيذ هذه الخطوة على الجليد لأن الأنسجة تتغير بحرارتها.
  3. قم بتجانس عينة الكلى عن طريق الضغط ببطء على المدقة على العينة عن طريق لفها. كرر هذه العملية عدة عشرات من المرات على الثلج حتى تذوب عينة الكلى تماما في كاشف التحلل القائم على الفينول / الجوانيدين. عندما لا يتم الحصول على miRNA في القياسات اللاحقة ، فمن المحتمل أن يكون هذا بسبب عدم كفاية الذوبان.
  4. لمزيد من التجانس ، انقل المحللة المتجانسة إلى نظام تمزيق البوليمر الحيوي في عمود دوران للطرد المركزي الدقيق يوضع في أنبوب تجميع سعة 2.0 مل. جهاز طرد مركزي هذا عند 14,000 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. نقل المحللة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
  6. أضف 140 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى المحللة المتجانسة وقم بتغطية الأنبوب بإحكام. امزج الأنبوب عن طريق الانعكاس لمدة 15 ثانية.
  7. احتضان العينات لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بطردها عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  8. انقل المادة الطافية (عادة 300 ميكرولتر) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد دون إزعاج الراسب وأضف 1.5 حجما (عادة 450 ميكرولتر) من الإيثانول بنسبة 100٪. امزج العينة عن طريق الدوامة لمدة 5 ثوان.
  9. ماصة تصل إلى 700 ميكرولتر من العينة في عمود دوران قائم على غشاء السيليكا يوضع في أنبوب تجميع سعة 2.0 مل. أغلق غطاء العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من التدفق في أنبوب التجميع.
  10. أضف 700 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت 1 إلى عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا لغسل العينة جيدا. أغلق غطاء العمود ، وقم بطرده عند 15,000 × جم لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من التدفق في أنبوب التجميع.
  11. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2 إلى عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا لإزالة أي آثار للملح. أغلق غطاء العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 15 ثانية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من التدفق في أنبوب التجميع.
    1. كرر الخطوة 3.11.
  12. جهاز الطرد المركزي لعمود الدوران القائم على غشاء السيليكا مرة أخرى عند 15,000 × جم لمدة 1 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، تخلص من التدفق في أنبوب التجميع.
  13. ضع عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا في أنبوب تجميع جديد سعة 1.5 مل. انقل 25 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى العمود ، وأغلق غطاء العمود. اترك العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم قم بالطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
  14. انقل 25 ميكرولتر من التصريف المحتوي على miRNAs إلى أنبوب جديد لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة. نظرا لأن miRNA يتحلل عن طريق الذوبان المتكرر ، فمن المستحسن توزيع العينة إلى 2 أو 3 أنابيب. قم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.

4. النسخ العكسي ل miRNA

ملاحظة: هنا ، يتم نسخ 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المعزول بشكل عكسي باستخدام النسخ العكسي ، والبوليميراز بولي (A) ، والبادئات oligo-dT.

  1. تحضير العناصر التالية: أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل ؛ أنابيب شريطية 8 آبار ؛ ماء خال من RNase ؛ جليد; مزيج من الحمض النووي 10x يحتوي على الديوكسينوكليوتيدات ، وثلاثي الفوسفات الريبونوكليوتيد ، والبادئات oligo-dT ؛ بوليميراز بولي (أ) ومزيج النسخ العكسي. وتنشيط المخزن المؤقت ، بما في ذلك Mg2+ ، والديوكسي ريبونوكليوتيدات ، والبادئات oligo-dT ، والبادئات العشوائية10.
  2. قم بإعداد محلول خلط رئيسي يحتوي على 2.0 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي 10x ، و 2.0 ميكرولتر من بوليميراز بولي (أ) ومزيج النسخ العكسي ، و 4.0 ميكرولتر من مخزن مؤقت منشط 5x ، بما في ذلك Mg2+ ، والديوكسي ريبونوكليوتيدات ، والبادئات oligo-dT ، والبادئات العشوائية ، ليصبح المجموع 8.0 ميكرولتر لكل أنبوب.
  3. قم بتوزيع 8.0 ميكرولتر من محلول الخلط الرئيسي في كل أنبوب.
  4. أضف 1.0 ميكروغرام من miRNAs المعزولة المنقاة من عينة الكلى إلى كل أنبوب.
  5. أضف الماء الخالي من RNase إلى كل أنبوب ليصبح المجموع 20 ميكرولتر. تخلط جيدا عن طريق سحب العينة وأجهزة الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 15 ثانية.
  6. احتضان العينات لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، تليها الحضانة لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية. يمكن تنفيذ هذه الخطوة في دورة حرارية.
  7. انقل (كدنا) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وقم بتخفيفه 10 مرات (1:10) بماء خال من RNase.
  8. قم بتخزين (كدنا) المخفف على المدى القصير على الجليد وعلى المدى الطويل عند -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.

5. qRT-PCR من miRNA

ملاحظة: يتم إجراء qRT-PCR ل miRNA باستخدام صبغة متداخلة. هنا ، تم استخدام بادئات ل U6 النووية الصغيرة 2 (RNA-2) ، و miRNA-17-5p ، و miRNA-18a-5p ، و miRNA-21a-5p ، و miRNA-132-3p ، و miRNA-212-3p ، و miRNA-223-3p ، و miRNA-574-5p.

  1. قم بإعداد العناصر التالية: أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل ، وألواح تفاعل 96 بئرا ل qRT-PCR ، وفيلم لاصق للوحة التفاعل ذات 96 بئرا ، والبادئات الخاصة ب miRNA ، ومزيج PCR Master الذي يشتمل على بوليميراز Taq DNA ، ومخزن PCR المؤقت ، والديوكسينوكليوتيدات ، والبادئات العالمية10 ، وأداة PCR في الوقت الفعلي.
  2. قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على 12.5 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix ، و 2.5 ميكرولتر من كل أساس miRNA (5 ميكرومتر) مذاب في ماء خال من النوكلياز ، و 1.25 ميكرولتر من 10x بادئات عالمية لكل بئر.
  3. قم بتوزيع 22.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا.
  4. أضف 2.5 ميكرولتر من قالب (كدنا) إلى كل بئر.
  5. أغلق اللوحة بغشاء لاصق للوحة التفاعل ذات 96 بئرا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة عند 1,000 × جم لمدة 30 ثانية.
  6. باستخدام أداة وبرامج PCR في الوقت الفعلي ، قم بتشغيل برنامج تدوير PCR على النحو التالي.
    1. ضع اللوحة في جهاز PCR في الوقت الفعلي. قم بتعيين اسم للعينة واستهدف miRNA في كل بئر باستخدام برنامج Real-Time PCR.
    2. أدخل شروط دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل التالية في برنامج PCR في الوقت الفعلي وفقا للتعليمات: الحضانة المسبقة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، متبوعة ب 40 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
  7. قم بتحليل بيانات qRT-PCR باستخدام برنامج أداة PCR في الوقت الفعلي. تحقق من وجود تفاعلات غير محددة. قم بتحليل منحنى التفكك أو منحنى الذوبان للتأكد من أن التضخيم بخلاف المنحنى المقصود لم يحدث.
    1. تطبيع مستوى التعبير عن miRNAs المستهدفة إلى RNU-6 كعنصر تحكم داخلي. احسب مستوى التعبير النسبي ل miRNAs المستهدفة باستخدام طريقة 2−ΔΔCT 11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، تم التحقيق في ملف تعريف تعبير miRNA في فئران AKI. تم التحقيق في ملف تعريف تعبير miRNA في أعضاء وأنسجة مختلفة في الفئران. تعد MiRNAs منظمات مهمة بعد النسخ ويتم دراستها الآن على نطاق واسع في توصيف مجموعة متنوعة من الأمراض ، بما في ذلك AKI. تتمتع MiRNAs بالقدرة على المساعدة في توضيح الحالات المرضية وتطبيقها على علاج AKI12. الأسباب الرئيسية ل AKI هي IRI ، والإهانة السامة للكلى ، والإنتان. يمثل IRI للكلى أحد عوامل الخطر الرئيسية لتطور AKI. تم الإبلاغ عن تورط العديد من miRNAs في AKI

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام البروتوكول المقدم في هذه المخطوطة ، تم تنقية miRNAs من كلية الفئران IRI بنجاح واكتشافها باستخدام qRT-PCR. تشمل النقاط الحاسمة في إجراء تحفيز IRI في البروتوكول المراقبة الدقيقة لدرجة حرارة الجسم وتركيزات التخدير ، والتي من المعروف أنها تؤثر على AKI20. تكمن قوة هذا البروتوكول في أنه يسمح بالتأكيد البصري لما إذا كان قد تم تحقيق نقص التروية وإعادة التروية. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على نموذج IRI هذا. إطالة وقت المشبك للحث على نقص التروية الشديد يزيد من معدل ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر نام نغوين ، دكتوراه على تحرير مسودة هذه المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ملاقط مدببة ذات طرف منحني بدون خطافNatsume SeisakushoMA-47
Buffer RLTQiagen79216عازلة غسيل 1
عازلة غسيل RWTQiagen10679332
C57B6 الفئرانSLCلا تعين
ملقطا بأسنانNatsume SeisakushoMA-49
ملقط بدون أسنانNatsume SeisakushoMA-48-1
مقاطع مرقئNatsume SeisakushoKN & ناقص ؛ 353
MicroAmp Optical 96 لوحة تفاعل البئر ل qRT-PCRThermo Fisher Scientific4316813لوحة تفاعل 96 بئر
MicroAmp فيلم لاصق بصريفيلم لاصق Thermo Fisher4311971للوحة تفاعل 96 بئر
miRNA-132-3p التمهيديQiagenMS00003458 5'UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG
miRNA-17-5p التمهيديQiagenMS000292745'CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
miRNA-18a-5p التمهيديQiagenMS000315145'UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG
miRNA-212-3p التمهيديQiagenMS000038155'UAACAGUCUCCAGUCACGGCC
miRNA-21a-5p التمهيديQiagenMS000090795'UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
miRNA-223-3p التمهيديQiagenMS000038715'UGUCAGUUUGUCAAUACCCCA
miRNA-574-5p التمهيديQiagenMS000436175'UGAGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU
miRNeasy Mini kitQiagen217004عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا
miScript II RT kitQiagen218161
miScript SYBR Green PCRkit Qiagen218073
QIA التقطيعQiagen79654نظام تمزيق البوليمر الحيوي في جهاز طرد مركزي صغير لعمود الدوران
QIAzol كاشف التحللQiagen79306كاشف التحلل القائم على الفينول / الجوانيدين
QuantStudio 12K Flex نظام PCR في الوقت الحقيقيThermo Fisher Scientific4472380أداة PCR في الوقت الحقيقي
QuantStudio 12K Flex الإصدار 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380برنامج أداة PCR في الوقت الحقيقي
RNU6-2 التمهيديQiagenMS00033740 لم يتم الكشف
عن مقص جراحيNatsume SeisakushoB-2
مقطع الأوعيةVITALITEC1621420
Scientific الدموية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, K. J. Acute renal failure: much more than a kidney disease. Seminas in Nephrology. 26 (2), 105-113 (2006).
  2. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clinical Chemistry. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  3. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiological Reviews. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  4. Yang, G., et al. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 463 (1-2), 60-63 (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. Journal of Surgical Oncology. 111 (8), 992-999 (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Translational Research: The Journal of Laboratory and Clinial Medicine. 169, 47-66 (2016).
  9. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  10. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  11. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  12. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nature Reviews. Genetics. 16 (7), 421-433 (2015).
  13. Ichii, O., Horino, T. MicroRNAs associated with the development of kidney diseases in humans and animals. Journal of Toxicologic Pathology. 31 (1), 23-34 (2018).
  14. Ma, L., et al. Changes of miRNA-17-5p, miRNA-21 and miRNA-106a level during rat kidney ischemia-reperfusion injury. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 95 (19), 1488-1492 (2015).
  15. Saikumar, J., et al. Expression, circulation, and excretion profile of microRNA-21, -155, and -18a following acute kidney injury. Toxicological Sciences: an Official Journal of the Society of Toxicology. 129 (2), 256-267 (2012).
  16. Li, Y. F., et al. MicroRNA-21 in the pathogenesis of acute kidney injury. Protein & Cell. 4 (11), 813-819 (2013).
  17. Zhou, J., Chen, H., Fan, Y. Systematic analysis of the expression profile of non-coding RNAs involved in ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury in mice using RNA sequencing. Oncotarget. 8 (59), 100196-100215 (2017).
  18. Liu, Y., et al. MicroRNA expression profile by next-generation sequencing in a novel rat model of contrast-induced acute kidney injury. Annals of Translational Medicine. 7 (8), 178(2019).
  19. Colbert, J. F., et al. A model-specific role of microRNA-223 as a mediator of kidney injury during experimental sepsis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (2), 553-559 (2017).
  20. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation Proceedings. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  21. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate. BMC Genomics. 6, 59(2005).
  22. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

microRNA qRT PCR RNA cDNA microRNA

مقالات ذات صلة