Method Article

تحليل RNA لطخة للكشف عن و الكم من MicroRNAs النبات

DOI:

10.3791/61394

⸱

July 11th, 2020

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2SASTRA University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا الأسلوب استخدام تقنية التهجين الشمالي للكشف عن الميرناس من إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) هي فئة من غير ترميز أعرب عن الذات، ~ 21 NT RNAs صغيرة تشارك في تنظيم التعبير الجيني في كل من النباتات والحيوانات. معظم miRNAs بمثابة مفاتيح سلبية للتعبير الجيني التي تستهدف الجينات الرئيسية. في النباتات، يتم إنشاء النصوص miRNAs الأولية (pri-miRNAs) بواسطة بوليميراز RNA الثاني، وأنها تشكل أطوال متفاوتة من هياكل حلقة الجذعية مستقرة تسمى ما قبل ميرناس. و endonuclease، Dicer-مثل1، يعالج ما قبل ميرناس في ميرنا ميرنا * دوبليكس. يتم اختيار أحد الخيوط من ميرنا ميرنا * دوبليكس وتحميلها على بروتين Argonaute 1 أو homologs للتوسط في شق mRNAs الهدف. على الرغم من أن الجزيئات الرئيسية التي تشير إلى الإشارات miRNAs، غالبا ما يتم الكشف عنها من قبل أقل من الطرق المثلى القائمة PCR بدلا من تحليل البقعة الشمالية الحساسة. نحن وصف طريقة بسيطة وموثوقة، وحساسة للغاية الشمالية التي هي مثالية للكمية من مستويات ميرنا مع حساسية عالية جدا، حرفيا من أي نسيج نباتي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتأكيد حجم واستقرار ووفرة الـ miRNAs وسلائفها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاكتشاف الأخير للرنا RNAs التنظيمية الصغيرة، microRNAs، قاد البحوث في فهمها ودورها في النباتات والحيوانات1. تتم معالجة السلائف الطويلة من miRNAs إلى 21 إلى 24 nt ناضجة miRNAs بواسطة HYL1 والبروتينات المحددة مثل dicer2,3. A 22 NT ميرنا يمكن أن تبدأ تتالي إسكات عن طريق توليد siRNAs الثانوية4. وقد أظهرت الدراسات دور ميرناس و siRNAs الثانوية في التنمية, الخلية مصير واستجابات الإجهاد5,6.

التهجين الشمالي هو طريقة تجريبية تستخدم بشكل روتيني للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي محددة. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد 15٪ denaturing هلام بوليكريلاميد

  1. وزن وإضافة 4.8 غرام من اليوريا، إضافة 3.75 مل من 40٪ أكريلاميد: البيسكريلاميد (19:1) حل و 1 مل من 10x TBE pH 8.2 في أنبوب 50 مل عقيمة.
  2. حل اليوريا باستخدام حمام مائي تعيين في 60 درجة مئوية في حل واضح.
  3. المكياج وحدة التخزين إلى 10 مل باستخدام المياه المعقمة الطازجة autoclaved وتبريد مزيج هلام إلى درجة حرارة الغرفة.
  4. تحضير 10٪ جديدة (ث / الخامس) حل persulfate الأمونيوم.

2. تجميع لوحات الزجاج ووحدة الكهرباء

  1. غسل كل الأجهزة اللازمة للكهربية هلام والكهرباء النشاف مع المنظفات. فرك بلطف لهم باستخدام اسفنجة ناعمة لإزالة العازلة المتبقية والاكريلاميد، شطف ب....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه التظاهرة، لقد كشفنا وكميا التعبير عن miR397 في أنسجة مختلفة من رايس انديكا فار whiteponni (الشكل 1). miR397 هو 22 NT ميرنا والحفاظ عليها ميرنا. ويمكن الكشف عن التعبير عن miR397 في جميع العينات التي تم اختبارها. وفقا لبيانات تسلسل الجيل التالي، العينة 1 (أنسجة الشتلات) لديها miR397 في 5 قراءات لكل مليون (دورة في الدقيقة). اكتشفنا إشارتها بشكل مريح ، مما يشير إلى أن الطريقة حساسة للغاية ويمكن استخدامها للكشف عن الـ miRNAs المنخفضة جدًا. في هذه التجربة، استخدمنا miR168 .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع للكشف عن الرنا الصغير وتحديد كمهاته بما في ذلك الرنا الرنا الأقل وفرة. البروتوكول يصف أساسا الخطوات ل denaturing مجموع الجيش الملكي النيبالي في مخزن التحميل العازلة ، وحجم الفصل بواسطة جل electrophoresis ، ونقل الجيش الملكي النيبالي إلى غشاء ، عبر ربط الجيش الملكي النيبالي على الغشاء والتهجين باستخدام مسابير القلة المشعة المطلوبة.

الخطوة الحاسمة لأية تجربة النشاف هو استخدام الحمض النووي الريبي ذات نوعية جيدة لإعداد العينة. قبل تحميل المواد الهلامية، يجب .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يعلن عن تضارب المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعترف المؤلفون بإمكانية الوصول إلى مختبر الإشعاع الذي يوفره المعهد المضيف والمعهد البريطاني للنظائر المشعة. ويدعم مختبر PVS المركز الوطني للعلوم البيولوجية، معهد تاتا للبحوث الأساسية والمنح (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014؛ BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19؛ BT/PR25767/GET/119/151/2017) من وزارة التكنولوجيا الحيوية، حكومة الهند. النائب يعترف DBT البحوث المنتسبين، DBT، حكومة الهند.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40٪ محلول أكريلاميد ثنائي الساكريلاميدسيجماA9926
بيرسلفات الأمونيوم (APS)BioRad1610700
ورق النشافwhatmann ورق النشاف I1001-125
Bromophenol الأزرقSigmaB5525-5G
نصائح تحميل الشعيراتالدموية BioRad2239915
Deionized فورماميدأمبيونAM9342
كتلة التسخينEppendorff5350
Hybond N + غشاء النايلونGERPN203B
زجاجة تهجينSigmaZ374792-1EA
فرن تهجين حراري علمي1211V79
N ، N ، N '، N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED)SigmaT7024-25ml
PhosphorImagerGE- ماسح ضوئي للإعصار29187194
شاشة PhosphorImager وكاسيتGE healthcareGE28-9564-75
PipettesGilson ، الموديلات: P20 و P10FA10002M ، FA10003M
ماصة بلاستيكيةFalcon357550
جهاز هلام بولي أكريلاميدBioRad1658003EDU
Sephadex G-25 العمودGE الرعاية الصحية27532501
Speed Vac ConcentratorThermo Scientific20-548-130
SpinwinTarsons1010
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)NEBM0201S
جهاز TransblotBioRad1703946
ULTRAHyb عازلة التهجينAmbionAM8670
UreaFischer Scientific15985
UV-crosslinkerUVPCL-1000L
VortexTarsons3020
حمام مائيNEOLABD-8810
زيلين سياانولسيجماX4126-10G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
  2. Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
  3. Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Blot AnalysisMicroRNA DetectionNorthern BlotPlant MicroRNAsSmall RNA AnalysisGel ElectrophoresisUV Cross linkingHybridization ProbeImageJ QuantificationLoading Controls

Related Articles