Method Article

تحليل RNA لطخة للكشف عن و الكم من MicroRNAs النبات

DOI:

10.3791/61394

⸱

July 11th, 2020

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2SASTRA University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا الأسلوب استخدام تقنية التهجين الشمالي للكشف عن الميرناس من إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) هي فئة من غير ترميز أعرب عن الذات، ~ 21 NT RNAs صغيرة تشارك في تنظيم التعبير الجيني في كل من النباتات والحيوانات. معظم miRNAs بمثابة مفاتيح سلبية للتعبير الجيني التي تستهدف الجينات الرئيسية. في النباتات، يتم إنشاء النصوص miRNAs الأولية (pri-miRNAs) بواسطة بوليميراز RNA الثاني، وأنها تشكل أطوال متفاوتة من هياكل حلقة الجذعية مستقرة تسمى ما قبل ميرناس. و endonuclease، Dicer-مثل1، يعالج ما قبل ميرناس في ميرنا ميرنا * دوبليكس. يتم اختيار أحد الخيوط من ميرنا ميرنا * دوبليكس وتحميلها على بروتين Argonaute 1 أو homologs للتوسط في شق mRNAs الهدف. على الرغم من أن الجزيئات الرئيسية التي تشير إلى الإشارات miRNAs، غالبا ما يتم الكشف عنها من قبل أقل من الطرق المثلى القائمة PCR بدلا من تحليل البقعة الشمالية الحساسة. نحن وصف طريقة بسيطة وموثوقة، وحساسة للغاية الشمالية التي هي مثالية للكمية من مستويات ميرنا مع حساسية عالية جدا، حرفيا من أي نسيج نباتي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتأكيد حجم واستقرار ووفرة الـ miRNAs وسلائفها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاكتشاف الأخير للرنا RNAs التنظيمية الصغيرة، microRNAs، قاد البحوث في فهمها ودورها في النباتات والحيوانات1. تتم معالجة السلائف الطويلة من miRNAs إلى 21 إلى 24 nt ناضجة miRNAs بواسطة HYL1 والبروتينات المحددة مثل dicer2,3. A 22 NT ميرنا يمكن أن تبدأ تتالي إسكات عن طريق توليد siRNAs الثانوية4. وقد أظهرت الدراسات دور ميرناس و siRNAs الثانوية في التنمية, الخلية مصير واستجابات الإجهاد5,6.

التهجين الشمالي هو طريقة تجريبية تستخدم بشكل روتيني للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي محددة. هذا الأسلوب يخصص استخدامه في الكشف عن حوالي 19 -24 NT RNAs صغيرة طويلة من مجموعة من مجموع RNAs7. في هذه التظاهرة، ونحن توضيح استخدام هذه التقنية للكشف عن وكمية من miRNAs. وتستخدم هذه الطريقة وسم المجس باستخدام النظائر المشعة؛ وبالتالي، يمكن الكشف عن مستويات ميرنا في العينة مع زيادة الحساسية. على عكس الطرق القائمة على PCR، يضمن هذا الأسلوب تحديد كم التعبير وكذلك تحديد حجم miRNAs. في هذا البروتوكول، نعرض خطوات حاسمة لتحسين الكشف عن ميرنا. لقد قمنا بتعديل الخطوات في النشاف والتهجين للحصول على الكشف إشارة عالية الدقة من miRNAs. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية للكشف عن RNAs صغيرة أخرى الذاتية مثل RNAs، رنا فاسي الثانوية وsnoRNAs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد 15٪ denaturing هلام بوليكريلاميد

  1. وزن وإضافة 4.8 غرام من اليوريا، إضافة 3.75 مل من 40٪ أكريلاميد: البيسكريلاميد (19:1) حل و 1 مل من 10x TBE pH 8.2 في أنبوب 50 مل عقيمة.
  2. حل اليوريا باستخدام حمام مائي تعيين في 60 درجة مئوية في حل واضح.
  3. المكياج وحدة التخزين إلى 10 مل باستخدام المياه المعقمة الطازجة autoclaved وتبريد مزيج هلام إلى درجة حرارة الغرفة.
  4. تحضير 10٪ جديدة (ث / الخامس) حل persulfate الأمونيوم.

2. تجميع لوحات الزجاج ووحدة الكهرباء

  1. غسل كل الأجهزة اللازمة للكهربية هلام والكهرباء النشاف مع المنظفات. فرك بلطف لهم باستخدام اسفنجة ناعمة لإزالة العازلة المتبقية والاكريلاميد، شطف بالماء والسماح لهم لتجف.
  2. تجميع كل من لوحات الزجاج معا ووضعها بحزم على الاسفنج. استخدم لوحة سمكها 1 مم لهذا الإعداد. تأكد من أن لوحات هي في نفس المستوى لتجنب التسرب.
  3. إلى مزيج هلام 10 مل، إضافة 8 ميكرولتر من TEMED و 80 ميكرولتر من الطازجة 10% أعد (ث / الخامس) محلول persulfate الأمونيوم.
  4. دون تأخير، مزيج بلطف وتصب هذا في بين لوحات الزجاج المجمعة. ضع المشط بعناية. تجنب توليد فقاعات الهواء في هذه الخطوة.
  5. السماح للجل البلمرة لمدة 45 دقيقة تقريبا.
  6. اغسل الجل البلمر بالماء المعقم قبل وضعه داخل الإعداد الذي يعمل بالهلام.
  7. تجميع لوحات داخل كاسيت تشغيل وإزالة المشط بلطف.
  8. صب الطازجة المعدة العقيمة 1x TBE، pH 8.2 في الخزان.
  9. غسل الآبار بعناية عن طريق الأنابيب العازلة لإزالة بلورات الملح. تساعد هذه الخطوة عينة RNA على تشغيل بشكل موحد عبر هلام.
  10. تنفيذ ما قبل تشغيل في 80 V لمدة 30 دقيقة.

3. إعداد صبغة التحميل والعينات

  1. ل 10 مل من هلام تحميل صبغة، تزن 5 ملغ من بروموفينول الأزرق، 5 ملغ من السيلين سيانول، إضافة 10 مل من الفورماميد deionized بعناية وخلطها جيدا.
  2. Aliquot 10 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي في أنبوب معقم 1.5 مل وتجفيف العينات باستخدام سرعة. لا الإفراط في تجفيف العينات.
  3. resuspend عينات RNA في 8 ميكرولتر من التحميل.
  4. سخني العينات على درجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وتبرد لمدة دقيقة في RT، ودوامة وتدور العينات، لمدة 3 مرات. هذه الخطوة ضرورية لإعادة التحمّل المناسبة، وهذا بدوره يساعد في تحميل العينات على قدم المساواة.

4. جل الكهرباء

  1. وقف تشغيل ما قبل وغسل الآبار قبل تحميل العينة.
  2. سخني العينات على درجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة دقيقة ثم قم بتحميل العينات الساخنة في البئر باستخدام نصائح شعرية. أدخل الطرف إلى أسفل البئر، بحيث تحتل العينة طبقة رقيقة واحدة في البئر.
  3. تحميل كامل لجميع العينات. وتشمل لتحميل علامة العقد RNA.
  4. تشغيل هلام في 80 الخامس حتى الصبغة الزرقاء bromophenol يعمل تماما تقريبا. بروموفينول الأزرق يعمل في 10 BP في هلام الاكريلاميد 15٪ denaturing.

5- التحضير للنقّل الكهربائي

  1. قطع غشاء ن + نايلون لأبعاد لوحة زجاجية وتسمية الغشاء في الزاوية اليمنى العليا مع قلم رصاص HB.
  2. ضع الغشاء بلطف على سطح الماء المعقم ، مواجهًا الجانب المسمى نحو سطح الماء. قبل نقع الغشاء لمدة 15 دقيقة.
  3. قطع 4 قطع من الورق النشاف الأول لأبعاد الألياف وسادة.
  4. إعداد ساندويتش هلام لوضع الجانب الرمادي من الكاسيت أسفل في علبة نظيفة.
  5. قبل الرطب لوحة الألياف ووضعها على الكاسيت. إزالة فقاعات الهواء.
  6. قبل الرطب قطعة واحدة من الورق النشاف في 1x TBE ومكان على لوحة الألياف. إزالة فقاعات الهواء عن طريق المتداول ماصة بلاستيكية على الورق. وضع قطعة أخرى من الورق قبل الرطب النشاف وإزالة فقاعات الهواء.
  7. إزالة بعناية هلام من الكاسيت قيد التشغيل ووضعها على إعداد شطيرة، بحيث أول عينة الحمض النووي الريبي تحميلها نحو اليمين.
  8. تراجع بلطف الغشاء قبل نقع في 1x TBE ووضعها على هلام، التي تواجه الجانب المسمى أسفل. طرح لإزالة فقاعات الهواء.
  9. تراجع قطعة من الورق النشاف، ووضعها على الغشاء، وإزالة فقاعات الهواء. تراجع قطعة أخرى من الورق النشاف، ووضعها على إعداد شطيرة وإزالة فقاعات الهواء.
  10. إكمال شطيرة عن طريق وضع قبل الرطب وسادة الألياف على الإعداد وإغلاق بحزم كاسيت.
  11. ضع الكاسيت المتحول في الوحدة النمطية وملأ 1x TBE، 8.2 pH حتى علامة النشاف.
  12. نقل في 10 V، بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  13. بعد النقل، ضع الغشاء الرطب على ورقة ورقية، وعلى الفور عبر ربط الحمض النووي الريبي إلى الغشاء عن طريق التشعيع مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر (120،000 ميكروجول/سم²). ربما تم تخزين البقعة المتقاطعة في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمزيد من التهجين.

6- إعداد مسبار مسمّى بشعاعي

  1. تصميم مسبار مكمل تماما لرنا الصغيرة التي سيتم الكشف عنها.
  2. نهاية التسمية المسبار باستخدام ƳP32ATP (التي تم الحصول عليها من بريت) في نهايتها 5 'عن طريق الجمع بين مكونات وصفة لكل المنصوص عليها في الجدول 1.
  3. احتضان خليط التفاعل أعلاه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. فصل غير موسومة ƳP32ATP من التحقيق باستخدام عمود سيخاديكس G-25 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

7. تهجين من وصمة عار

  1. ضع البقعة المتقاطعة ، جانب الحمض النووي الريبي التي تواجه الجزء العلوي داخل زجاجة التهجين.
  2. امزج بقوة مع العازلة التهجين الحساسة للغاية، إضافة 10 مل منه واحتضان البقعة داخل فرن التهجين التي حافظت على 35 درجة مئوية، مع دوران.
  3. تنفيذ ما قبل التهجين لمدة 20 دقيقة.
  4. إزالة الزجاجة من الفرن وإضافة المسبار المسمى في المخزن المؤقت التهجين بلطف.
  5. تهجين لطخة في 35 درجة مئوية، مع دوران لمدة 12 ساعة.
  6. بعد التهجين نقل بعناية حل التهجين إلى أنبوب 15 مل. يمكن تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية حتى إعادة استخدامه.
  7. قم بإجراء غسل سريع لللطخة لمدة 2 دقيقة لإزالة محلول التهجين الزائد عن طريق إضافة مخزن SSC 2x بالإضافة إلى 0.5٪ من الذاكرة SDS. تجاهل الحل.
  8. احتضان البقعة مع 2x SSC العازلة بالإضافة إلى 0.5٪ SDS ل35 درجة مئوية، مع دوران لمدة 30 دقيقة.
  9. اغسل البقعة مرة أخرى مع 0.5x SSC العازلة بالإضافة إلى 0.5٪ SDS ل35 درجة مئوية، مع دوران لمدة 30 دقيقة.
  10. ضع البقعة داخل غطاء التهجين، وأزل العازلة الزائدة وختمها.
  11. عرضها على شاشة تصوير خالية من الفوسفور للإشعاع بين عشية وضحاها داخل كاسيت.
  12. الكشف عن إشارة التهجين باستخدام التصوير الجزيئي الحيوي وتحليل النتائج باستخدام برامج مناسبة.
  13. تعري البقعة عن طريق احتضانها عند 80 درجة مئوية، مع دوران لمدة 30 دقيقة مع 0.5 × SSC بالإضافة إلى 0.1٪ SDS و 0.1 X SSC العازلة بالإضافة إلى 0.1٪ SDS لمدة 30 دقيقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه التظاهرة، لقد كشفنا وكميا التعبير عن miR397 في أنسجة مختلفة من رايس انديكا فار whiteponni (الشكل 1). miR397 هو 22 NT ميرنا والحفاظ عليها ميرنا. ويمكن الكشف عن التعبير عن miR397 في جميع العينات التي تم اختبارها. وفقا لبيانات تسلسل الجيل التالي، العينة 1 (أنسجة الشتلات) لديها miR397 في 5 قراءات لكل مليون (دورة في الدقيقة). اكتشفنا إشارتها بشكل مريح ، مما يشير إلى أن الطريقة حساسة للغاية ويمكن استخدامها للكشف عن الـ miRNAs المنخفضة جدًا. في هذه التجربة، استخدمنا miR168 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع للكشف عن الرنا الصغير وتحديد كمهاته بما في ذلك الرنا الرنا الأقل وفرة. البروتوكول يصف أساسا الخطوات ل denaturing مجموع الجيش الملكي النيبالي في مخزن التحميل العازلة ، وحجم الفصل بواسطة جل electrophoresis ، ونقل الجيش الملكي النيبالي إلى غشاء ، عبر ربط الجيش الملكي النيبالي على الغشاء والتهجين باستخدام مسابير القلة المشعة المطلوبة.

الخطوة الحاسمة لأية تجربة النشاف هو استخدام الحمض النووي الريبي ذات نوعية جيدة لإعداد العينة. قبل تحميل المواد الهلامية، يجب ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يعلن عن تضارب المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعترف المؤلفون بإمكانية الوصول إلى مختبر الإشعاع الذي يوفره المعهد المضيف والمعهد البريطاني للنظائر المشعة. ويدعم مختبر PVS المركز الوطني للعلوم البيولوجية، معهد تاتا للبحوث الأساسية والمنح (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014؛ BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19؛ BT/PR25767/GET/119/151/2017) من وزارة التكنولوجيا الحيوية، حكومة الهند. النائب يعترف DBT البحوث المنتسبين، DBT، حكومة الهند.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40٪ محلول أكريلاميد ثنائي الساكريلاميدسيجماA9926
بيرسلفات الأمونيوم (APS)BioRad1610700
ورق النشافwhatmann ورق النشاف I1001-125
Bromophenol الأزرقSigmaB5525-5G
نصائح تحميل الشعيراتالدموية BioRad2239915
Deionized فورماميدأمبيونAM9342
كتلة التسخينEppendorff5350
Hybond N + غشاء النايلونGERPN203B
زجاجة تهجينSigmaZ374792-1EA
فرن تهجين حراري علمي1211V79
N ، N ، N '، N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE (TEMED)SigmaT7024-25ml
PhosphorImagerGE- ماسح ضوئي للإعصار29187194
شاشة PhosphorImager وكاسيتGE healthcareGE28-9564-75
PipettesGilson ، الموديلات: P20 و P10FA10002M ، FA10003M
ماصة بلاستيكيةFalcon357550
جهاز هلام بولي أكريلاميدBioRad1658003EDU
Sephadex G-25 العمودGE الرعاية الصحية27532501
Speed Vac ConcentratorThermo Scientific20-548-130
SpinwinTarsons1010
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)NEBM0201S
جهاز TransblotBioRad1703946
ULTRAHyb عازلة التهجينAmbionAM8670
UreaFischer Scientific15985
UV-crosslinkerUVPCL-1000L
VortexTarsons3020
حمام مائيNEOLABD-8810
زيلين سياانولسيجماX4126-10G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
  2. Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
  3. Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
  4. Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
  5. Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
  6. Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
  7. Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
  8. Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
  9. Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
  10. Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Blot AnalysisMicroRNA DetectionNorthern BlotPlant MicroRNAsSmall RNA AnalysisGel ElectrophoresisUV Cross linkingHybridization ProbeImageJ QuantificationLoading Controls

Related Articles