Method Article

إضافية الخلوية مصفوفة المستندة إلى و اضافية الخلية مصفوفة خالية جيل من الخصية مورين

DOI:

10.3791/61403

⸱

October 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، هناك أربع طرق لتوليد الخصية العضوية من خلايا الخصية الخصية الخصية حديثي الولادة الأولية هي وصفها، أي المصفوفة خارج الخلية (ECM) وبيئات الثقافة 2D و 3D الخالية من ECM. هذه التقنيات لها تطبيقات بحثية متعددة ومفيدة بشكل خاص لدراسة تطوير الخصية وعلم وظائف الأعضاء في المختبر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر الخصية أداة لدراسة تطور الخصية، ونشوء الحيوانات المنوية، والغدد الصماء في المختبر. وقد تم تطوير عدة طرق من أجل خلق الأعضاء الخصية. يعتمد العديد من هذه الطرق على المصفوفة خارج الخلية (ECM) لتعزيز تجميع الأنسجة من جديد ، ومع ذلك ، هناك اختلافات بين الأساليب من حيث مورفولوجيا الأنسجة والوظائف الحيوية. وعلاوة على ذلك، هناك عدد قليل من المقارنات المباشرة بين الأساليب المنشورة. هنا، يتم إجراء مقارنة مباشرة من خلال دراسة الاختلافات في بروتوكولات توليد الأعضاء، مع النتائج المقدمة. أربعة أساليب الجيل الأركيولوجي: (1) 2D ECM خالية، (2) 2D ECM، (3) 3D ECM خالية، و (4) 3D ECM الثقافة هي الموصوفة. واستخدمت ثلاثة معايير أولية لتقييم توليد الخصية العضوية. هذه هي التجميع الذاتي الخلوي ، وإدراج أنواع الخلايا الرئيسية (Sertoli ، Leydig ، والجرثومة ، والخلايا المحيطية) ، والهندسة المعمارية الأنسجة المجزأة بشكل مناسب. من البيئات الأربع التي تم اختبارها، ولدت 2D ECM و 3D ECM-الثقافات organoids مع المورفولوجيا الداخلية الأكثر شبها الخصيتين الأصلية، بما في ذلك تقسيم دي نوفو من أنواع الخلايا الأنبوبية مقابل الخلالي، وتطوير هياكل تشبه الأنابيب، ودالة الغدد الصماء على المدى الطويل المنشأة. استخدمت جميع الأساليب التي تمت دراستها تعليق خلايا الخصية الأولية غير المُنَتَجة واستخدمت موارد الثقافة التي يمكن الوصول إليها بشكل شائع. وتوفر تقنيات توليد الخصية هذه مجموعة أدوات يسهل الوصول إليها ويمكن استنساخها للمبادرات البحثية في تكوين الأعضاء الخصية وعلم وظائف الأعضاء في المختبر.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخصية هي تقنية رائدة لدراسة تطوير الخصية ، والحيوانات المنوية ، وعلم وظائف الأعضاء في المختبر1،2،3،4. وقد تم استكشاف عدة طرق لتوليد organoid; وتشمل هذه مجموعة متنوعة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) وECM- أنظمة الثقافة الخالية، في كل من ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) التوجهات. يمكن أن تعزز أساليب التوليد المختلفة استراتيجيات تجميع خلوية متميزة؛ وهذا يؤدي إلى مستوى عال من التباين المورفولوجي والوظيفي بين النماذج العضوية المنشورة. الغرض من هذه المقالة هو مناقشة الحالة الراهنة للنماذج الخصية في المختبر، ولخدمة كنموذج للمحققين في المستقبل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافقت على جميع تجارب الماوس لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة نورث وسترن، وتم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب بروتوكولات وافقت عليها اللجنة.

1. إعداد محلول الإنزيمي للتفكك الأنسجة

  1. استخدم حلين انزيميين مختلفين (الحل 1 والحل 2)، وكلاهما تم باستخدام حل متوسط للثقافة القاعدية (BM).
  2. لإعداد BM، أضف المصل والبنسلين-الستربتوميسين إلى الحد الأدنى من التركيزات المتوسطة الأساسية إلى النهائية من 10٪ و 1٪ على التوالي (انظر جدول المواد للكاشائب محددة). ثم تصفية معقمة BM من خلال مرشح 0.22 μm. قبل استخدامها مع الخلايا، قبل الإكسالات BM العقيمة إلى درجة ح ح محايدة عن طريق الاستغناء في طبق الثقافة ووض....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واعتبر جيل العضوية غير ناجحة إذا لم الخلايا الخصية تجميع الذاتي داخل 72 ساعة من الثقافة، ومع ذلك، جميع الأساليب المعروضة هنا تجميع داخل 24 ساعة عند استخدام خلايا مورين الأحداث (5 ديسيبل). فشل بناء البيولوجية جيل قدم على أنه استمرار للخلايا علقت بحرية (0 عمود ح في الشكل 1)حتى بعد ثقافة ممتدة (72 ح). في غياب الأنسجة التجميع الذاتي، أي مجموعات الخلايا الظاهرة تفرق بسهولة في خلايا فردية حتى على التلاعب لطيف (أي، pipetting). وقد لوحظت في البداية الأنسجة التي تم إنشاؤها بنجاح كخلية ثلاثية الأبعاد .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع الانتهاء من هذا البروتوكول الجيل العضوي، سيكون للمستخدم أربع تقنيات ثقافة مختلفة متاحة لهم لتجميع التشييد الخصية و organoids في أي ECM أو ECM-البيئات الخالية من. الأهم من ذلك، جميع الأساليب الأربع تسمح للباحث لمراقبة غير الغازية التجميع الذاتي organoid مع مرور الوقت من خلال التصوير الفاصل الزمني أو تسجيل الفيديو، وجمع وسائل الإعلام غير مشروط غير الباضعة لتحليل الهرمونات السرية والسيكوكاينات، دون إزعاج الأنسجة خلال الثقافة. في جميع الأساليب، على مدى 24 ح، يمكن للمجرب توليد ما يصل إلى عدة مئات من العضية / الخصية الانشاء.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) F31 HD089693، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية / المركز الوطني للنهوض بالعلوم الترجمية (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 و4UH3ES029073-03، وSessed.000.03 توماس ج. واتكين.

الكتاب يود أن أشكر اريك و. روث لمساعدتهم في المجهر الإلكترون انتقال. وقد استفاد هذا العمل من مرفق BioCryo التابع لمركز جامعة نورث وسترنللعلوم والتكنولوجيات النووية (NUANCE) التابع لجامعة نورث وسترن، الذي تلقى الدعم من الموارد التجريبية لتكنولوجيا النانو (SHyNE) (NSF ECCS-1542205)؛ برنامج MRSEC (NSF DMR-1720139) في مركز أبحاث المواد؛ المعهد الدولي لتكنولوجيا النانو (IIN)؛ و....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 ميكرومتر مرشحات الوسائط المعقمةMillipore Sigmascgpu05reلوسائط الترشيح المعقمة
3 & beta ؛ الأجسام المضادة الأولية HSDCosmo Bio CoK0607علامة خلية Leydig ، 1: 500 التخفيف
AlexaFluor 568 &alpha ؛ - الفأرالحراري فيشر ScientificA-21202الجسم المضاد الثانوي الموسوم بالتألق
AlexaFluor 568 & alpha ؛ -RabbitThermo Fisher ScientificA10042جسم مضاد ثانوي الموسومة
بعلامة ألفا الحد الأدنى الأساسي المتوسطالحراري فيشر العلمي11-095-080قاعدة وسائط
الثقافة كولاجيناز IWorthington BioLS004197لحل التفكك 1
مصفوفة غشاء Corning Matrigel ، مصفوفةCorning354234خارج الخلية الخالية من LDEV تستخدم لصب المواد الهلامية لثقافة ECM ثنائية الأبعاد و 3D
عداد خلايا الكونتيسةThermo Fisher ScientificC10227عداد الخلايا التلقائية (آلة قياس الدم)
شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسةThermo Fisher ScientificC10228شريحة مقياس الدم للاستخدام مع عداد الكونتيسة الآلي
DDX4 الجسم المضاد الأساسيAbcam138540المنوية ، 1: 500 تخفيف
Deoxyribonuclease I (2،280 u / mgDW)Worthington BioLS002140لحل التفكك 1
DPBS 1X ، + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182لإعادة تشكيل Hyaluronidase
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline + Ca / + MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIllipore SigmaW1503لإعادة تكوين الكولاجيناز I و Dnase I
مصل الأبقارالجنيني Thermo Fisher Scientific16000044لإخماد محاليل تفكيك الإنزيم
بصيلات هرمون تحفيزAbcamab51888للثقافة العضوية طويلة الأمد
الغدد التناسلية المشيمية البشريةMillipore SigmaC1063للثقافة العضوية طويلة الأمد
Hyaluronidase ، من الخصيتين البقريةMillipore SigmaH4272لمحلول التفكك 2
Inhibin B مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيمAnsh LabsAL-107Inhibin B ELISA Kit
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028مصدر مصل للوسائط القاعدية
MicroTtissue 3D Petri Dish micro-mould spheroids (24-35 ، 5x7 array)Millipore SigmaZ764051لتصنيع العضويات الخالية من ECM 3D
Nunc ، نظام شرائح غرفة Lab Tek II ، 4 آبارThermo Fisher Scientific12-565-7ل 2D ECM خالية من ، و 2D ، 3D ECM ثقافة
البنسلين / الستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15-140-122مضاد حيوي للإعلام
ريتشارد آلان العلمي ؛ Histogel ، جل معالجة العيناتThermo Fisher ScientificHG-4000-012للمساعدة في تضمين البارافين
SOX9 الجسم المضاد الأساسيMillipore SigmaAB5535Sertoli Marker ، 1: 500 تخفيف
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)Teklad Global2920طعام الفأر بدون فيتويستروغنز
Tedklad Global Mouse Chow (صيانة)Teklad Global2916طعام الفأر بدون فيتويستروغنز
اختبار الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التستوستيرونCalbiotechTE373STestosterone ELISA Kit
Trypan Blue Solution ، 0.4٪Thermo Fisher Scientific15250061لعد الخلايا
& ألفا ؛ SMA الجسم المضاد الأساسيMillipore SigmaA2547علامة محيطة الأنابيب ، 1: 500 تخفيف
بيتا ؛ الجسم المضاد الأولي CateninBD Biosciences610154علامة سيرتولي سيتوبلازم ، تخفيف 1: 100
علامة موجهة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Testicular OrganoidsECM Culture2D ECM free3D ECM freeCellular Self assemblySertoli CellsLeydig CellsGerm CellsPeritubular CellsTissue Architecture

Related Articles