مقالة منهجية

إضافية الخلوية مصفوفة المستندة إلى و اضافية الخلية مصفوفة خالية جيل من الخصية مورين

6.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61403

⸱

أكتوبر 7, 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

في هذه المقالة

ملخص

هنا، هناك أربع طرق لتوليد الخصية العضوية من خلايا الخصية الخصية الخصية حديثي الولادة الأولية هي وصفها، أي المصفوفة خارج الخلية (ECM) وبيئات الثقافة 2D و 3D الخالية من ECM. هذه التقنيات لها تطبيقات بحثية متعددة ومفيدة بشكل خاص لدراسة تطوير الخصية وعلم وظائف الأعضاء في المختبر.

الملخص

توفر الخصية أداة لدراسة تطور الخصية، ونشوء الحيوانات المنوية، والغدد الصماء في المختبر. وقد تم تطوير عدة طرق من أجل خلق الأعضاء الخصية. يعتمد العديد من هذه الطرق على المصفوفة خارج الخلية (ECM) لتعزيز تجميع الأنسجة من جديد ، ومع ذلك ، هناك اختلافات بين الأساليب من حيث مورفولوجيا الأنسجة والوظائف الحيوية. وعلاوة على ذلك، هناك عدد قليل من المقارنات المباشرة بين الأساليب المنشورة. هنا، يتم إجراء مقارنة مباشرة من خلال دراسة الاختلافات في بروتوكولات توليد الأعضاء، مع النتائج المقدمة. أربعة أساليب الجيل الأركيولوجي: (1) 2D ECM خالية، (2) 2D ECM، (3) 3D ECM خالية، و (4) 3D ECM الثقافة هي الموصوفة. واستخدمت ثلاثة معايير أولية لتقييم توليد الخصية العضوية. هذه هي التجميع الذاتي الخلوي ، وإدراج أنواع الخلايا الرئيسية (Sertoli ، Leydig ، والجرثومة ، والخلايا المحيطية) ، والهندسة المعمارية الأنسجة المجزأة بشكل مناسب. من البيئات الأربع التي تم اختبارها، ولدت 2D ECM و 3D ECM-الثقافات organoids مع المورفولوجيا الداخلية الأكثر شبها الخصيتين الأصلية، بما في ذلك تقسيم دي نوفو من أنواع الخلايا الأنبوبية مقابل الخلالي، وتطوير هياكل تشبه الأنابيب، ودالة الغدد الصماء على المدى الطويل المنشأة. استخدمت جميع الأساليب التي تمت دراستها تعليق خلايا الخصية الأولية غير المُنَتَجة واستخدمت موارد الثقافة التي يمكن الوصول إليها بشكل شائع. وتوفر تقنيات توليد الخصية هذه مجموعة أدوات يسهل الوصول إليها ويمكن استنساخها للمبادرات البحثية في تكوين الأعضاء الخصية وعلم وظائف الأعضاء في المختبر.

المقدمة

الخصية هي تقنية رائدة لدراسة تطوير الخصية ، والحيوانات المنوية ، وعلم وظائف الأعضاء في المختبر1،2،3،4. وقد تم استكشاف عدة طرق لتوليد organoid; وتشمل هذه مجموعة متنوعة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) وECM- أنظمة الثقافة الخالية، في كل من ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) التوجهات. يمكن أن تعزز أساليب التوليد المختلفة استراتيجيات تجميع خلوية متميزة؛ وهذا يؤدي إلى مستوى عال من التباين المورفولوجي والوظيفي بين النماذج العضوية المنشورة. الغرض من هذه المقالة هو مناقشة الحالة الراهنة للنماذج الخصية في المختبر، ولخدمة كنموذج للمحققين في المستقبل، عند تصميم التجارب الخصية. وفي إطار هذه الدراسة، تم تحديد أربعة نماذج مختلفة من نماذج النظم الثقافية وتتميز في العملية التجريبية والنتائج البيولوجية. وتشمل هذه: 2D ECM-Free، 2D ECM، 3D ECM-Free، و 3D ECM الأساليب ثقافة. تهدف الاستراتيجيات المعروضة هنا إلى أن تكون بسيطة وسهلة الاستخدام وقابلة للاستنساخ بشكل كبير بين مختلف المختبرات ومجموعات البحث.

تاريخيا للخصية، وقد استخدمت التسمية "في المختبر"، لعدة طرق مختلفة لثقافة الأنسجة والخلايا الخصية. وتشمل هذه الأنسجة العضوية / أساليب زراعة الجهاز (أي ثقافة explant)5، معزولة ثقافة أنبوب شبهيرول6، ثقافة الخلية الخصية7، وطرق دي نوفو تكوين الأنسجة (أي، وانشاءات البيولوجية والأجهزة)1. وقد أجريت التحقيقات الأولى في الحيوانات المنوية في المختبر قبل ما يقرب من 100 سنة، مع ثقافة الخصية الأرانب explants في 19208، وفي وقت لاحق في عام 1937 مع explants الماوس9. ضمن هذه التجارب الأولية لوحظ spermatogonia إلى حد كبير منحطة عبر الأسبوع الأول من الثقافة، على الرغم من أن بعض الخلايا التفريق meioticly تم تحديدها. تذكرنا هذه التقارير التاريخية، تم إحياء ثقافة explant testis الأمثل في عام 2011 لتصبح تقنية مجدية لدراسة الخصية10. منذ عام 2011، أنتجت ثقافة explant الحيوانات المنوية المختصة الخصوبة في تقارير متعددة11,12,13. ومع ذلك ، بسبب اعتماد ثقافة explant على أنابيب الخصية الأصلية الموجودة مسبقًا ، فإن هذه التطورات الأخيرة توصف بدقة أكبر كأمثلة على وظيفة الخصية "ex vivo" وتولد الحيوانات المنوية ، وظيفة الأنسجة التي تم الحفاظ عليها أو استئنافها عند إزالتها من جسم الكائن الحي. على الرغم من انتشارها في الأدب، على المدى الطويل صيانة الخلايا الجرثومية والتمايز داخل explants الخصية هو التحدي لتكرار14،,15،,16،,17،,18، وخاصة على مدى الأطر الزمنية طويلة بما يكفي لمراقبة كاملة في المختبر الحيوانات المنوية (~ 35 يوما في الفئران19 و 74 في البشر20). ومن المثير للاهتمام أن نقدر أن العديد من التحديات نفسها التي واجهتها قبل 100 سنة، لا تزال من ذوي الخبرة داخل الحيوانات المنوية السابقين vivo اليوم.

مختلفة عن النهج الجسم الحي السابق، والعضوية الخصية هي دي نوفو تجميعها microtissues ولدت تماما في المختبر من مصادر خلوية (أي الخلايا الخصية الأولية). توفر الخصية العضية استراتيجية مبتكرة للتحايل على الاعتماد التاريخي للحقل على الأنسجة المحلية الموجودة من قبل ، واختخيص بيولوجيا الخصية تمامًا في المختبر. هناك متطلبات متعددة مشتركة بين معظم نماذج الأنسجة العضوية; وتشمل هذه (1) في مورفولوجيا الأنسجة vivo-mimetic أو الهندسة المعمارية، (2) أنواع الخلايا الرئيسية المتعددة من الأنسجة الممثلة، (3) التجميع الذاتي أو التنظيم الذاتي في جيلهم، و (4) القدرة على محاكاة مستوى ما من وظيفة الأنسجة الممثلة وعلم وظائف الأعضاء21،,22،,23،,24. بالنسبة للخصيتين ، يمكن التقاط هذا في أربع علامات رئيسية: (1) إدراج أنواع خلايا الخصية الرئيسية ، الجرثومة، Sertoli، Leydig، peritubular، وغيرها من الخلايا الخلالية، (2) خلية موجهة الجمعية الأنسجة، (3) أنواع الخلايا المجزأة بشكل مناسب في مقصورات أنبوبي منفصلة (الجرثومة وSertoli) والمناطق الخلالي (جميع أنواع الخلايا الأخرى)، و (4) درجة ما من وظيفة الأنسجة (على سبيل المثال، إفراز هرمون أو استجابات الأنسجة، والحفاظ على الخلايا الجرثومية والتمايز). وبالنظر إلى التحديات التاريخية في الحفاظ على تمايز الخلايا الجرثومية السابقين في الجسم الحي وفي المختبر، فإن تلخيص في الهياكل الخصية المحنية -المحاكاة (أي الهياكل التي تشبه الأنابيب شبه المنيفيرة) مع علامات إضافية توحي بمحاكاة فسيولوجيا الخصية (على سبيل المثال، وظيفة الغدد الصماء)، هي معالم ذات أولوية نحو توليد الغدد الصماء التي قد تستمر يوماً ما في الحفاظ على تكوين الحيوانات المنوية في المختبر.

غالبية الأساليب العضوية الخصية المنشورة الاستفادة من ECM المتاحة تجاريا (مثل الكولاجين أو تركيبات ECM الملكية)25،26،27 أو ECMs حسب المصدر (أي، الخصيص decellularized الهيدروجين المستمدة من ECM)28،29،30. ECM خارجية يعزز تكوين الأنسجة دي نوفو من خلال توفير سقالة الجمعية داعمة لتوليد الأنسجة. وقد أتاحت أساليب ECM مستوى مثير للإعجاب من تكوين الأنسجة، بما في ذلك بعض وجود الخلايا الجرثومية ومورفولوجيا الأنسجة المحاكاة25،28. ومع ذلك، فإن ECMs التي يستخدمونها ليست متاحة دائماً عالمياً (أي هيدروجيلات مشتقة من ECM غير الخلوية)، وتتطلب بعض الطرق التوجهات المتطورة من الجل والخلايا البذر (مثل تدرجات 3 طبقات من ECM والطباعة ثلاثية الأبعاد)25و31,,و32. سقال طرق خالية (على سبيل المثال، معلقة قطرة ولوحات الثقافة nonadherent)33،34،35 كما ولدت organoids قوية وقابلة للاستنساخ للغاية دون الحاجة إلى المواد الهلامية ECM أو السقالات. ومع ذلك، فإن مورفولوجيا الأنسجة لهذه العضوية الخالية من السقالات غالباً ما تختلف عن الخصيتين الجسمية، ومعظم هذه التقارير تتضمن إضافة كيماوية بيولوجية ECM لتعزيز تكوين الأنسجة33،34،36، أو بدلاً من ذلك ، تعتمد على الطرد المركزي لتجميع الخلايا القسري وضغط34، مما يجعلها أقل مثالية لدراسة الهجرة الموجهة نحو الخلايا والتنظيم الذاتي.

تتضمن أساليب التوليد العضوية الأربعة المعروضة في هذه المخطوطة استراتيجيات مستقلة تعتمد على ECM، كل منها يستخدم البذر الخلوي البسيط الذي يتيح مراقبة التجميع الذاتي العضوي القائم على الخلية. يمكن تنفيذ التقنيات الأربعة جميعها من نفس التعليقات الخلوية أو يمكن أن تستفيد من مجموعات مخصصة ومخصبة من نوع الخلية. قوة هذه الطرق هي القدرة على مراقبة تجميع الأعضاء الذاتية في الوقت الحقيقي ، ومقارنة مباشرة كيف تتجمع الهياكل الخصية ذاتيا بين البيئة المجهرية المختلفة. وينبغي النظر في الاختلافات الظاهرية بين هذه الأساليب الثقافية الأربعة لتأثيرها على السؤال البحثي أو موضوع المحقق. وتنتج كل طريقة التركيبات البيولوجية أو الأعضاء في غضون 24 ساعة أو أقل. في الختام، فإن الأساليب المعروضة هنا توفر مجموعة من تقنيات التجميع العضوي لدراسة تجميع الخصية العضوية، وتطوير الأنسجة، وعلم وظائف الأعضاء الخصية في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد وافقت على جميع تجارب الماوس لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة نورث وسترن، وتم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب بروتوكولات وافقت عليها اللجنة.

1. إعداد محلول الإنزيمي للتفكك الأنسجة

  1. استخدم حلين انزيميين مختلفين (الحل 1 والحل 2)، وكلاهما تم باستخدام حل متوسط للثقافة القاعدية (BM).
  2. لإعداد BM، أضف المصل والبنسلين-الستربتوميسين إلى الحد الأدنى من التركيزات المتوسطة الأساسية إلى النهائية من 10٪ و 1٪ على التوالي (انظر جدول المواد للكاشائب محددة). ثم تصفية معقمة BM من خلال مرشح 0.22 μm. قبل استخدامها مع الخلايا، قبل الإكسالات BM العقيمة إلى درجة ح ح محايدة عن طريق الاستغناء في طبق الثقافة ووضع داخل ترطيب، 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: يمكن تخزين BM عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع، وبعد ذلك يجب إجراء BM جديدة.
  3. لإعداد الكولاجين I حلول الأسهم، أولاً حل 100 ملغ من الكولاجيناز الأول في 1 مل من الجنين معقمة الصف H2O (التركيز النهائي 10٪ م / الخامس)، عكس أو دوامة إلى حل، وتخزين 20 ميكروغرام في -20 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. يجب أن تذوب Aliquots مرة واحدة فقط.
  4. لإعداد deoxyribonuclease I (DNase I) حلول الأسهم، إضافة 20 ملغ من DNase I إلى 1 مل من الجنين العقيم الصف H2O (التركيز النهائي 2٪ م / الخامس)، عكس أو دوامة إلى حل (لا دوامة)، وتخزين 20 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. يجب أن تذوب Aliquots مرة واحدة فقط.
  5. لحلول الأسهم hyaluronidase، إضافة 30 ملغ إلى 1 مل من الفوسفات العقيمة المخزنة المالحة (PBS؛ التركيز النهائي 3٪ م / الخامس hyaluronidase في PBS التي تحتوي على كا++/ Mg++)، عكس أو دوامة إلى حل، وتخزين 100 ميكرولتر aliquots في -20 درجة مئوية للاستخدام في وقت لاحق. يمكن إذابة Aliquots وإعادة تجميدها عدة مرات دون فقدان النشاط الأنزيمي.
  6. لإعداد حل الانفصام 1، أضف 10 ميكرولتر كولاجيناز I و 10 ميكرولتر DNase I إلى 1 مل من BM العقيمة ، قبل التوازن (التركيزات النهائية: 1 ملغم / مل collagenase I و 5 ميكروغرام / مل DNase I). اِثر بلطف مع ماصة لخلط المحلول، و سخينة إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها مع الأنسجة.
    ملاحظة: يتم إعداد الحل 2 عن طريق إضافة 33 ميكرولتر من الهيالورونيداسي (مسبقة الارهاد إلى 37 درجة مئوية) لكل 1 مل من الحل 1 ، (إلى تركيز نهائي قدره 1 ملغ / مل). يحدث هذا في منتصف الطريق من خلال انفصال انزيمي من أنسجة الخصية في الخطوة 2.5 أدناه.

2. Testis تفكك الأنسجة

ملاحظة: تم إيواء جميع الفئران داخل أقفاص البولي بروبلين وزودت بالطعام والماء الإعلاني libitum. تم تغذية الحيوانات بـ chow المشعة التي لا تحتوي على فيتويستروغنز. تم استخدام فئران CD-1 الأحداث، 5 أيام بعد الولادة (dpp)، لجميع التجارب ومخدر قبل القتل الرحيم وجمع الأنسجة، داخل غرفة التخدير المرفقة بمرذاذ isoflurane (2.5 لتر/دقيقة في O2). تم تأكيد الفئران للتخدير الكامل عن طريق عدم وجود استجابة لوخزة شبع، وبعد ذلك تم قتل الفئران عن طريق قطع الرأس.

  1. تخدير الفئران في غرفة isoflurane ، وضمان التخدير عن طريق وخزة أصابع ، ومن ثم قطع رأس الماوس باستخدام مقص حاد. وضع الماوس القتل الرحيم سوبين على حصيرة تشريح وتعقيم البطن مع 70٪ الإيثانول. خيمة جلد أسفل البطن مع ملقط وفتح البطن مع مقص.
  2. حدد مكان الخصية في المناطق الأربية السفلية اليسرى والأنية من البطن. قطع اتصالاتهم إلى vas deferens وأي نسيج الضام الرسو، ثم رفع الخصية بأكملها (مع epididymis لا تزال تعلق) من الحيوان. ضع الخصية في طبق بيتري من BM قبل التوازن.
  3. تحت مجهر تشريح وداخل حقل معقمة، وجعل شق صغير في albuginea tunica على نهاية واحدة من كل الخصية مع مقص microdissection الصغيرة أو عن طريق تمزيق بلطف باستخدام اثنين من ملقط غرامة.
    1. ثم, في حين عقد الخصية من الطرف الآخر من شق, ضغط بلطف الخصية مع ملقط غرامة ودفع في حركة كاسحة لطيف نحو ثقب في tunica; هذا سوف الافراج عن الأنسجة الخصية كما قطعة واحدة متماسكة.
  4. قطع الخصيات إلى قطع أصغر (≤ 2 مم3) ووضعها في 1 مل من قبل الدافئة (37 درجة مئوية) حل الانفصام 1.
    1. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    2. لأكثر من 10 الخصية، وزيادة إجمالي حجم حل تفكك بمقدار 1 مل، وضمان الحد الأدنى من 1 مل من حل تفكك لكل 10 الخصية (على سبيل المثال، 2 مل ل 20 الخصية، 3 مل ل30 الخصية، الخ).
    3. 310 بلطف القطع الخصية 50 مرة (50x) في الحل 1 باستخدام ماصة P1000. تأكد من أن الأنابيب منفصلة عن بعضها البعض وعن الأنسجة الخلالية في هذه المرحلة. إذا ظلت كتل، احتضان لمدة 5 دقائق إضافية وtriturate مرة أخرى (50x).
  5. إضافة 33 ميكرولتر من محلول الأسهم هيالورونيداز (قبل warmed عند 37 درجة مئوية، من الخطوة 1.5) لكل 1 مل من محلول 1 خليط الانفصام (الذي يحتوي على أنسجة الخصية و الأنابيب المنفصلة جزئيا). بعد إضافة هيالورونيداسي، وهذا ما يسمى الحل 2.
    1. Triturate (50x) باستخدام P1000 واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. Triturate (50x) باستخدام ماصة P200.
    3. تأكد من أنه في هذه المرحلة لا توجد أنابيب مرئية أو كتل من الخلايا. إذا استمرت الكتل، حضن لمدة تصل إلى 5 دقائق أخرى، مع مزيد من التثابت باستخدام ماصة P200 (50x).
  6. إخماد الانزيمات تفكك بإضافة مصل الأبقار الجنين (FBS) إلى 10٪ من الحجم الإجمالي للحل 2. تُجرّد عدة مرات باستخدام ماصة P200 لضمان عدم بقاء الكتل، وتصفية مصفاة خلايا 40 ميكرومتر لإنتاج تعليق أحادي الخلية.
  7. خلايا الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 7 دقائق، والتخلص من افر، وإعادة تثبيت الخلايا في BM الطازجة.
  8. عد تركيزات الخلايا الكلية والقابلة للحياة باستخدام الاستبعاد الأزرق trypan على مقياس الدم. إضافة 10 μL من 1:1 المخفف، تعليق الخلية: trypan حل أزرق، في غرفة عد خلية قياس الهيموزية (انظر جدول المواد).
    1. خلايا إعادة الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 7 دقائق وإعادة تعليق في BM الطازجة.
      ملاحظة: استخدام الخلايا القابلة للتطبيق فقط لحساب تركيز الخلية ورقمها. فقط استخدام تعليق الخلايا من ≥ 80٪ قابلية البقاء لتوليد organoids.
    2. إعداد تعليق الخلية واحدة في تركيزات الخلايا كما هو موضح من أجل aliquot 280،000 الخلايا نظرا للحجم المستخدمة في الخطوات المحددة بروتوكول أدناه في القسم 3: 2D ECM-Free – 0.56 x 106 الخلايا / مل، 2D ECM – 0.56 × 106 خلايا / مل, 3D ECM-Free – 4.66 x 106 خلايا/مل, 3D ECM – 2.8 x 106 خلايا/مل.
      ملاحظة: تبدأ جميع التجارب الثقافية المعروضة هنا بـ 280,000 خلية مبذرة في الثقافة بشكل جيد. وتتطابق هذه الأرقام مع البيانات التمثيلية في الشكل 1والشكل 2 والشكل 3 والشكل 4.

3. إعداد أطباق الثقافة العضوية وبذر الخلايا

ملاحظة: لضمان ECM متجانسة، قبل ذوبان aliquots المجمدة من ECM بين عشية وضحاها قبل التجريب. يجب أن تكون مغمورة في شكل ثلج ECM داخل دلو من الثلج داخل ثلاجة 4 °C أو غرفة باردة لضمان زيادة بطيئة وتدرجية في درجة الحرارة. يتم استخدام جميع ECM في التخفيف النهائي 1:1 في BM للثقافة. الحفاظ على ذاب ECM و 1:1 ECM المخفف على الجليد حتى قبل الاستخدام مباشرة، وإلا قد ECM البلمرة قبل الأوان.

  1. بالنسبة لثقافة 2D ECM الخالية ، لا يلزم إعداد خاص ، تعليق خلية واحدة لوحة (500 ميكرولتر من 0.56 × 106 خلايا / مل في BM) مباشرة على 4 - شرائح الغرفة جيدا ، ووضع في حاضنة 35 درجة مئوية للثقافة.
    ملاحظة: يجب أن تلتزم الخلايا إلى الجزء السفلي من طبق الثقافة داخل أول 24 h من الثقافة وقد يعرض بعض مجموعات الخلايا ثلاثية الأبعاد الصغيرة ضمن هذا الوقت نفسه.
  2. لثقافة ECM 2D، الاستغناء 100 ميكرولتر من 1:1 الباردة المخففة مصفوفة الطابق السفلي خارج الخلية المتوسطة في شريحة غرفة 4 جيدا، وضمان هلام يغطي كامل من أسفل الطبق.
    1. ضع الشريحة في الغرفة في حاضنة 35 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة للسماح ECM بالتمرمر إلى هلام.
    2. إضافة تعليق الخلية (500 ميكرولتر من 0.56 × 106 الخلايا / مل في BM) مباشرة على الجزء العلوي من هلام 2D مرة واحدة وقد تمبل.
      ملاحظة: يجب أن تتجمع الخلايا معاً لتشكل مجموعات صغيرة ثلاثية الأبعاد داخل أول 24 ساعة من الثقافة.
  3. لثقافة 3D ECM خالية، وإعداد أغاروز 3D طبق بيتري إدراج قبل البدء في ثقافة الخلية.
    1. أولاً، الأوتوكلاف 1.5 ز مسحوق أغاروز في 100 مل من الكأس، ثم إضافة 75 مل معقم، الماء المقطر والميكروويف لإنتاج أغاروز 2% المنصهر لطبق بيتري 3D الصب.
    2. داخل مساحة عمل معقمة، الاستغناء agarose المنصهر في قالب طبق بيتري 3D حتى الغضروف المفصلي هو مستوى مع الجانبين من القالب.
    3. السماح لأغاروز لتبرد وتتوطد. عندما الصلبة، بدوره القالب رأسا على عقب وثني بلطف مرارا وتكرارا حتى صحن agarose 3D بيتري يقع خالية من العفن.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن للمرء أن يعد العديد من أطباق agarose 3D بيتري وتخزينها في العقيمة H2O أو DPBS في 4 درجة مئوية لأكثر من شهر واحد.
    4. قبل الاستزراع، ضع أطباق agarose 3D Petri في طبق ثقافة 24 جيدًا، واغطيها بـ 1 مل من BM. اسمحوا 3D بيتري أطباق موازين في BM لمدة 30 دقيقة على الأقل داخل 37 درجة مئوية حاضنة الثقافة. تجاهل BM، وكرر التوازن مرة أخرى مع BM 1 مل جديدة. بعد توازن أطباق 3D Petri في BM ، ستظهر بنفس لون BM (أي الوردي).
    5. للتحضير لبذر الخلايا، وإزالة جميع BM من البئر والاستغناء 200 ميكرولتر من BM الطازجة حولها، ولكن ليس داخل عطلة مركز طبق بيتري 3D. أيضا، جمع أي BM المتبقية من داخل مركز خلية البذر عطلة إدراج microwell.
    6. الاستغناء عن تعليق خلية واحدة (4.66 الخلايا / مل في 60 ميكرولتر من BM) في عطلة مركز من صحن agarose 3D بيتري. ثلاثية بلطف صعودا وهبوطا لخلط الخلايا وضمان تعليق خلية واحدة في بداية الثقافة.
    7. مكان في في حاضنة 35 درجة مئوية المرطبة للثقافة. في اليوم التالي، قم بإزالة 200 ميكرولتر من BM من حول إدراج الميكروويل، واستبدله بـ 1 مل من BM الطازجة. وهذا سيجلب مستوى السائل فوق مستوى إدراج، غمر الثقافة بأكملها.
    8. ببطء وبعناية إزالة / إضافة وسائل الإعلام من خارج صحن agarose 3D بيتري. كان ينبغي أن تكون الأجهزة مدمجة بين عشية وضحاها ، مما يسمح لهم بالراحة في القاع وتمكين التغييرات الإعلامية لترك organoids دون عائق.
  4. بالنسبة لثقافة ECM ثلاثية الأبعاد، قم بإعداد تعليق خلية واحد من خلال الجمع بين تعليق الخلية في أجزاء متساوية في BM مع ECM البارد المذاب مسبقًا (التركيز النهائي = 2.8 × 106 خلايا/مل).
    1. الاستغناء فورا الخلية ECM الخليط في 4 4 جيدا شريحة الغرفة، وضمان الخليط يغطي الجزء السفلي كله من لوحة.
    2. ضع شرائح الغرفة عند 35 درجة مئوية في حاضنة واسمح لمحتوياتها بالبليمرة. هذا يجب أن يستغرق 30 دقيقة على الأقل. بعد البلمرة، إضافة 500 ميكرولتر من BM على الجزء العلوي من الثقافة.
      ملاحظة: يجب أن تتجمع الخلايا معًا لتشكيل مجاميع ثلاثية الأبعاد صغيرة داخل أول 24 ساعة من الثقافة.

4. صيانة الجهاز

  1. ثقافة جميع أنواع نموذج الجهاز في 35 درجة مئوية. لجميع أنواع الثقافة تبادل نصف وسائل الإعلام الخاصة بهم مع BM الطازجة كل 2 أيام. لضمان عدم جمع الأعضاء بطريق الخطأ أثناء تبادل الوسط ، وجمع الوسائط دائمًا ببطء من زاوية طبق شريحة الغرفة ، ومن نقطة خارجية خارج أطباق agarose 3D Petri. يمكن تخزين جميع الوسائط في -20 درجة مئوية للاستخدام مع المناعية أو غيرها من التحليلات في وقت لاحق (أي، الكم من الهرمونات التناسلية أو السيتوكينات السرية).
  2. بعد 7 أيام في الثقافة، واستخدام BM التي تحتوي على هرمون تحفيز بصيلات (التركيز النهائي 20 mIU/mL) وgonadotropin المشيمية الإنسان (التركيز النهائي 4.5 وحدة دولية / مل). وهذا ينطبق على جميع أنواع ثقافة الجهاز.
  3. صورة روتينية جميع الثقافات العضوية (أي، التصوير الفاصل الزمني) لتميز تشكيل organoid وتحديد مقاييس التجميع الذاتي، والتنمية، والنمو مع مرور الوقت.

5. جمع الجهاز العضوي

ملاحظة: يمكن إصلاح جميع الأعضاء مع 4٪ شبه شكلي في برنامج تلفزيوني للمناعة المصب والتحليلات النسيجية. قم بإصلاح 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الدوران، أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.

  1. بالنسبة للثقافات الخالية من ECM ثنائية الأبعاد ، قم أولاً بشطف العينة باستخدام برنامج تلفزيوني جديد ، ثم أضف التثبيت مباشرة فوق الثوابت الملتزم بها.
  2. ل ECM (2D و 3D) أساليب الثقافة، شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ومن ثم إضافة إما مثبت مباشرة على الجزء العلوي من العينة ECM organoid (لإصلاح هلام ECM و organoids معا)، أو بدلا من ذلك، بلطف الماصات organoids صعودا وهبوطا لتحريرها من ECM المحيطة بها، ونقلها إلى أنبوب منفصل لتثبيت.
  3. لثقافة 3D ECM خالية، ماص بلطف organoids صعودا وهبوطا داخل عطلة مركز من صحن agarose 3D بيتري. هذا سوف طرد organoids من تسهيل جمعها سهلة مع ماصة. ثم نقل الأعضاء إلى أنبوب منفصل لتثبيت.
  4. قبل المعالجة في البارافين ، تضمين العديد من الأعضاء (≥ 20) داخل حجم صغير (~ 30 ميكرولتر) من هلام معالجة الأنسجة ؛ وهذا يساعد على توجيه وتركيز الأعضاء في منطقة صغيرة داخل كتل البارافين، مما يسهل المراقبة عند اقسام وأسهل البصرية في أقسام البارافين.
    ملاحظة: يمكن أن يكون Organoids تحديا لتحديد بعد إدراج البارافين والقطع على microtome.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

واعتبر جيل العضوية غير ناجحة إذا لم الخلايا الخصية تجميع الذاتي داخل 72 ساعة من الثقافة، ومع ذلك، جميع الأساليب المعروضة هنا تجميع داخل 24 ساعة عند استخدام خلايا مورين الأحداث (5 ديسيبل). فشل بناء البيولوجية جيل قدم على أنه استمرار للخلايا علقت بحرية (0 عمود ح في الشكل 1)حتى بعد ثقافة ممتدة (72 ح). في غياب الأنسجة التجميع الذاتي، أي مجموعات الخلايا الظاهرة تفرق بسهولة في خلايا فردية حتى على التلاعب لطيف (أي، pipetting). وقد لوحظت في البداية الأنسجة التي تم إنشاؤها بنجاح كخلية ثلاثية الأبعاد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مع الانتهاء من هذا البروتوكول الجيل العضوي، سيكون للمستخدم أربع تقنيات ثقافة مختلفة متاحة لهم لتجميع التشييد الخصية و organoids في أي ECM أو ECM-البيئات الخالية من. الأهم من ذلك، جميع الأساليب الأربع تسمح للباحث لمراقبة غير الغازية التجميع الذاتي organoid مع مرور الوقت من خلال التصوير الفاصل الزمني أو تسجيل الفيديو، وجمع وسائل الإعلام غير مشروط غير الباضعة لتحليل الهرمونات السرية والسيكوكاينات، دون إزعاج الأنسجة خلال الثقافة. في جميع الأساليب، على مدى 24 ح، يمكن للمجرب توليد ما يصل إلى عدة مئات من العضية / الخصية الانشاء...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) F31 HD089693، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية / المركز الوطني للنهوض بالعلوم الترجمية (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 و4UH3ES029073-03، وSessed.000.03 توماس ج. واتكين.

الكتاب يود أن أشكر اريك و. روث لمساعدتهم في المجهر الإلكترون انتقال. وقد استفاد هذا العمل من مرفق BioCryo التابع لمركز جامعة نورث وسترنللعلوم والتكنولوجيات النووية (NUANCE) التابع لجامعة نورث وسترن، الذي تلقى الدعم من الموارد التجريبية لتكنولوجيا النانو (SHyNE) (NSF ECCS-1542205)؛ برنامج MRSEC (NSF DMR-1720139) في مركز أبحاث المواد؛ المعهد الدولي لتكنولوجيا النانو (IIN)؛ وولاية إلينوي، من خلال IIN. كما استخدمت معدات CryoCluster، التي تلقت الدعم من برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي (NSF DMR-1229693). تم تصميم الرسومات في الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 ميكرومتر مرشحات الوسائط المعقمةMillipore Sigmascgpu05reلوسائط الترشيح المعقمة
3 & beta ؛ الأجسام المضادة الأولية HSDCosmo Bio CoK0607علامة خلية Leydig ، 1: 500 التخفيف
AlexaFluor 568 &alpha ؛ - الفأرالحراري فيشر ScientificA-21202الجسم المضاد الثانوي الموسوم بالتألق
AlexaFluor 568 & alpha ؛ -RabbitThermo Fisher ScientificA10042جسم مضاد ثانوي الموسومة
بعلامة ألفا الحد الأدنى الأساسي المتوسطالحراري فيشر العلمي11-095-080قاعدة وسائط
الثقافة كولاجيناز IWorthington BioLS004197لحل التفكك 1
مصفوفة غشاء Corning Matrigel ، مصفوفةCorning354234خارج الخلية الخالية من LDEV تستخدم لصب المواد الهلامية لثقافة ECM ثنائية الأبعاد و 3D
عداد خلايا الكونتيسةThermo Fisher ScientificC10227عداد الخلايا التلقائية (آلة قياس الدم)
شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسةThermo Fisher ScientificC10228شريحة مقياس الدم للاستخدام مع عداد الكونتيسة الآلي
DDX4 الجسم المضاد الأساسيAbcam138540المنوية ، 1: 500 تخفيف
Deoxyribonuclease I (2،280 u / mgDW)Worthington BioLS002140لحل التفكك 1
DPBS 1X ، + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182لإعادة تشكيل Hyaluronidase
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline + Ca / + MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIllipore SigmaW1503لإعادة تكوين الكولاجيناز I و Dnase I
مصل الأبقارالجنيني Thermo Fisher Scientific16000044لإخماد محاليل تفكيك الإنزيم
بصيلات هرمون تحفيزAbcamab51888للثقافة العضوية طويلة الأمد
الغدد التناسلية المشيمية البشريةMillipore SigmaC1063للثقافة العضوية طويلة الأمد
Hyaluronidase ، من الخصيتين البقريةMillipore SigmaH4272لمحلول التفكك 2
Inhibin B مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيمAnsh LabsAL-107Inhibin B ELISA Kit
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028مصدر مصل للوسائط القاعدية
MicroTtissue 3D Petri Dish micro-mould spheroids (24-35 ، 5x7 array)Millipore SigmaZ764051لتصنيع العضويات الخالية من ECM 3D
Nunc ، نظام شرائح غرفة Lab Tek II ، 4 آبارThermo Fisher Scientific12-565-7ل 2D ECM خالية من ، و 2D ، 3D ECM ثقافة
البنسلين / الستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15-140-122مضاد حيوي للإعلام
ريتشارد آلان العلمي ؛ Histogel ، جل معالجة العيناتThermo Fisher ScientificHG-4000-012للمساعدة في تضمين البارافين
SOX9 الجسم المضاد الأساسيMillipore SigmaAB5535Sertoli Marker ، 1: 500 تخفيف
Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)Teklad Global2920طعام الفأر بدون فيتويستروغنز
Tedklad Global Mouse Chow (صيانة)Teklad Global2916طعام الفأر بدون فيتويستروغنز
اختبار الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التستوستيرونCalbiotechTE373STestosterone ELISA Kit
Trypan Blue Solution ، 0.4٪Thermo Fisher Scientific15250061لعد الخلايا
& ألفا ؛ SMA الجسم المضاد الأساسيMillipore SigmaA2547علامة محيطة الأنابيب ، 1: 500 تخفيف
بيتا ؛ الجسم المضاد الأولي CateninBD Biosciences610154علامة سيرتولي سيتوبلازم ، تخفيف 1: 100
علامة موجهة

المراجع

  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
  3. Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680(2019).
  4. Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Engineered reproductive tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 381-393 (2020).
  5. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  6. Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
  7. Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
  8. Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
  9. Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
  10. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472(2011).
  11. Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472(2016).
  12. Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884(2018).
  13. Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
  14. Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
  15. Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
  16. Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
  17. Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
  18. Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
  19. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  20. Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
  21. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  23. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  24. Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
  25. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  26. Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
  27. Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
  28. Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227(2018).
  29. Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
  30. Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
  31. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
  32. Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011(2019).
  33. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
  34. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
  35. Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
  36. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
  37. Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002(2020).
  38. Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
  39. Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15(2011).
  40. Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
  41. Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
  42. Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
  43. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
  44. Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
  45. Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171(2015).
  46. Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
  47. Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017(2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة