مقالة منهجية
هنا، هناك أربع طرق لتوليد الخصية العضوية من خلايا الخصية الخصية الخصية حديثي الولادة الأولية هي وصفها، أي المصفوفة خارج الخلية (ECM) وبيئات الثقافة 2D و 3D الخالية من ECM. هذه التقنيات لها تطبيقات بحثية متعددة ومفيدة بشكل خاص لدراسة تطوير الخصية وعلم وظائف الأعضاء في المختبر.
توفر الخصية أداة لدراسة تطور الخصية، ونشوء الحيوانات المنوية، والغدد الصماء في المختبر. وقد تم تطوير عدة طرق من أجل خلق الأعضاء الخصية. يعتمد العديد من هذه الطرق على المصفوفة خارج الخلية (ECM) لتعزيز تجميع الأنسجة من جديد ، ومع ذلك ، هناك اختلافات بين الأساليب من حيث مورفولوجيا الأنسجة والوظائف الحيوية. وعلاوة على ذلك، هناك عدد قليل من المقارنات المباشرة بين الأساليب المنشورة. هنا، يتم إجراء مقارنة مباشرة من خلال دراسة الاختلافات في بروتوكولات توليد الأعضاء، مع النتائج المقدمة. أربعة أساليب الجيل الأركيولوجي: (1) 2D ECM خالية، (2) 2D ECM، (3) 3D ECM خالية، و (4) 3D ECM الثقافة هي الموصوفة. واستخدمت ثلاثة معايير أولية لتقييم توليد الخصية العضوية. هذه هي التجميع الذاتي الخلوي ، وإدراج أنواع الخلايا الرئيسية (Sertoli ، Leydig ، والجرثومة ، والخلايا المحيطية) ، والهندسة المعمارية الأنسجة المجزأة بشكل مناسب. من البيئات الأربع التي تم اختبارها، ولدت 2D ECM و 3D ECM-الثقافات organoids مع المورفولوجيا الداخلية الأكثر شبها الخصيتين الأصلية، بما في ذلك تقسيم دي نوفو من أنواع الخلايا الأنبوبية مقابل الخلالي، وتطوير هياكل تشبه الأنابيب، ودالة الغدد الصماء على المدى الطويل المنشأة. استخدمت جميع الأساليب التي تمت دراستها تعليق خلايا الخصية الأولية غير المُنَتَجة واستخدمت موارد الثقافة التي يمكن الوصول إليها بشكل شائع. وتوفر تقنيات توليد الخصية هذه مجموعة أدوات يسهل الوصول إليها ويمكن استنساخها للمبادرات البحثية في تكوين الأعضاء الخصية وعلم وظائف الأعضاء في المختبر.
الخصية هي تقنية رائدة لدراسة تطوير الخصية ، والحيوانات المنوية ، وعلم وظائف الأعضاء في المختبر1،2،3،4. وقد تم استكشاف عدة طرق لتوليد organoid; وتشمل هذه مجموعة متنوعة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) وECM- أنظمة الثقافة الخالية، في كل من ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) التوجهات. يمكن أن تعزز أساليب التوليد المختلفة استراتيجيات تجميع خلوية متميزة؛ وهذا يؤدي إلى مستوى عال من التباين المورفولوجي والوظيفي بين النماذج العضوية المنشورة. الغرض من هذه المقالة هو مناقشة الحالة الراهنة للنماذج الخصية في المختبر، ولخدمة كنموذج للمحققين في المستقبل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وقد وافقت على جميع تجارب الماوس لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة نورث وسترن، وتم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب بروتوكولات وافقت عليها اللجنة.
1. إعداد محلول الإنزيمي للتفكك الأنسجة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
واعتبر جيل العضوية غير ناجحة إذا لم الخلايا الخصية تجميع الذاتي داخل 72 ساعة من الثقافة، ومع ذلك، جميع الأساليب المعروضة هنا تجميع داخل 24 ساعة عند استخدام خلايا مورين الأحداث (5 ديسيبل). فشل بناء البيولوجية جيل قدم على أنه استمرار للخلايا علقت بحرية (0 عمود ح في الشكل 1)حتى بعد ثقافة ممتدة (72 ح). في غياب الأنسجة التجميع الذاتي، أي مجموعات الخلايا الظاهرة تفرق بسهولة في خلايا فردية حتى على التلاعب لطيف (أي، pipetting). وقد لوحظت في البداية الأنسجة التي تم إنشاؤها بنجاح كخلية ثلاثية الأبعاد .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
مع الانتهاء من هذا البروتوكول الجيل العضوي، سيكون للمستخدم أربع تقنيات ثقافة مختلفة متاحة لهم لتجميع التشييد الخصية و organoids في أي ECM أو ECM-البيئات الخالية من. الأهم من ذلك، جميع الأساليب الأربع تسمح للباحث لمراقبة غير الغازية التجميع الذاتي organoid مع مرور الوقت من خلال التصوير الفاصل الزمني أو تسجيل الفيديو، وجمع وسائل الإعلام غير مشروط غير الباضعة لتحليل الهرمونات السرية والسيكوكاينات، دون إزعاج الأنسجة خلال الثقافة. في جميع الأساليب، على مدى 24 ح، يمكن للمجرب توليد ما يصل إلى عدة مئات من العضية / الخصية الانشاء.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) F31 HD089693، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية / المركز الوطني للنهوض بالعلوم الترجمية (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 و4UH3ES029073-03، وSessed.000.03 توماس ج. واتكين.
الكتاب يود أن أشكر اريك و. روث لمساعدتهم في المجهر الإلكترون انتقال. وقد استفاد هذا العمل من مرفق BioCryo التابع لمركز جامعة نورث وسترنللعلوم والتكنولوجيات النووية (NUANCE) التابع لجامعة نورث وسترن، الذي تلقى الدعم من الموارد التجريبية لتكنولوجيا النانو (SHyNE) (NSF ECCS-1542205)؛ برنامج MRSEC (NSF DMR-1720139) في مركز أبحاث المواد؛ المعهد الدولي لتكنولوجيا النانو (IIN)؛ و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.22 ميكرومتر مرشحات الوسائط المعقمة | Millipore Sigma | scgpu05re | لوسائط الترشيح المعقمة |
| 3 & beta ؛ الأجسام المضادة الأولية HSD | Cosmo Bio Co | K0607 | علامة خلية Leydig ، 1: 500 التخفيف |
| AlexaFluor 568 &alpha ؛ - الفأر | الحراري فيشر Scientific | A-21202 | الجسم المضاد الثانوي الموسوم بالتألق |
| AlexaFluor 568 & alpha ؛ -Rabbit | Thermo Fisher Scientific | A10042 | جسم مضاد ثانوي الموسومة |
| بعلامة ألفا الحد الأدنى الأساسي المتوسط | الحراري فيشر العلمي | 11-095-080 | قاعدة وسائط |
| الثقافة كولاجيناز I | Worthington Bio | LS004197 | لحل التفكك 1 |
| مصفوفة غشاء Corning Matrigel ، مصفوفة | Corning | 354234 | خارج الخلية الخالية من LDEV تستخدم لصب المواد الهلامية لثقافة ECM ثنائية الأبعاد و 3D |
| عداد خلايا الكونتيسة | Thermo Fisher Scientific | C10227 | عداد الخلايا التلقائية (آلة قياس الدم) |
| شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسة | Thermo Fisher Scientific | C10228 | شريحة مقياس الدم للاستخدام مع عداد الكونتيسة الآلي |
| DDX4 الجسم المضاد الأساسي | Abcam | 138540 | المنوية ، 1: 500 تخفيف |
| Deoxyribonuclease I (2،280 u / mgDW) | Worthington Bio | LS002140 | لحل التفكك 1 |
| DPBS 1X ، + CaCl + MgCl | Thermo Fisher Scientific | 14040182 | لإعادة تشكيل Hyaluronidase |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline + Ca / + Mg | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | PBS |
| Embryo Grade H2O | MIllipore Sigma | W1503 | لإعادة تكوين الكولاجيناز I و Dnase I |
| مصل الأبقار | الجنيني Thermo Fisher Scientific | 16000044 | لإخماد محاليل تفكيك الإنزيم |
| بصيلات هرمون تحفيز | Abcam | ab51888 | للثقافة العضوية طويلة الأمد |
| الغدد التناسلية المشيمية البشرية | Millipore Sigma | C1063 | للثقافة العضوية طويلة الأمد |
| Hyaluronidase ، من الخصيتين البقرية | Millipore Sigma | H4272 | لمحلول التفكك 2 |
| Inhibin B مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم | Ansh Labs | AL-107 | Inhibin B ELISA Kit |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | مصدر مصل للوسائط القاعدية |
| MicroTtissue 3D Petri Dish micro-mould spheroids (24-35 ، 5x7 array) | Millipore Sigma | Z764051 | لتصنيع العضويات الخالية من ECM 3D |
| Nunc ، نظام شرائح غرفة Lab Tek II ، 4 آبار | Thermo Fisher Scientific | 12-565-7 | ل 2D ECM خالية من ، و 2D ، 3D ECM ثقافة |
| البنسلين / الستربتومايسين | ثيرمو فيشر العلمي | 15-140-122 | مضاد حيوي للإعلام |
| ريتشارد آلان العلمي ؛ Histogel ، جل معالجة العينات | Thermo Fisher Scientific | HG-4000-012 | للمساعدة في تضمين البارافين |
| SOX9 الجسم المضاد الأساسي | Millipore Sigma | AB5535 | Sertoli Marker ، 1: 500 تخفيف |
| Tedklad Global Mouse Chow (Breeder) | Teklad Global | 2920 | طعام الفأر بدون فيتويستروغنز |
| Tedklad Global Mouse Chow (صيانة) | Teklad Global | 2916 | طعام الفأر بدون فيتويستروغنز |
| اختبار الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التستوستيرون | Calbiotech | TE373S | Testosterone ELISA Kit |
| Trypan Blue Solution ، 0.4٪ | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | لعد الخلايا |
| & ألفا ؛ SMA الجسم المضاد الأساسي | Millipore Sigma | A2547 | علامة محيطة الأنابيب ، 1: 500 تخفيف |
| بيتا ؛ الجسم المضاد الأولي Catenin | BD Biosciences | 610154 | علامة سيرتولي سيتوبلازم ، تخفيف 1: 100 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن