أساليب معدلة لتحميل عالية الإنتاجية ألواح استخراج الحمض النووي يقلل من احتمال التلوث

Summary

يمكن أن تكون الطرق الحالية لتحميل 96-صحون البئر لاستخراج الحمض النووي عرضة للتلوث. نحن تفاصيل طريقة جديدة لتحميل 96-آبار لوحات أن يقلل من خطر التلوث المتبادل بين الآبار. ستساعد طريقتنا الباحثين الآخرين على الاستفادة من كفاءة تقنيات استخراج الحمض النووي عالية الإنتاجية وتقليل خطر التلوث.

Abstract

وقد ساهمت تقنيات تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية بشكل كبير في التقدم في فهمنا للعلاقات بين المجتمعات الميكروبية، وخصائص المضيف، ووظائف النظام الإيكولوجي الأوسع. مع هذه الزيادة السريعة في اتساع وعمق قدرات التسلسل قد حان أساليب لاستخراج وتضخيم وتحليل وتفسير الحمض النووي البيئي بنجاح مع أقصى قدر من الكفاءة. لسوء الحظ، يمكن أن يأتي إجراء عمليات استخراج الحمض النووي بسرعة على حساب زيادة خطر التلوث بين العينات. وعلى وجه الخصوص، فإن عمليات الاستخراج العالية الإنتاجية التي تستند إلى عينات موجودة في لوحة من 96 بئراً توفر طريقة سريعة نسبياً، مقارنة باستخراجات أحادية الأنبوب، ولكنها تزيد أيضاً من فرص التلوث العابر من البئر إلى الجيد. لتقليل خطر التلوث المتبادل بين العينات، مع الاحتفاظ بفوائد تقنيات الاستخراج عالية الإنتاجية، طورنا طريقة جديدة لتحميل العينات البيئية في ألواح 96 بئر. استخدمنا ختم PCR قابل للخرق لأفلام لتغطية كل لوحة أثناء تحميل العينات وأضاف عينات أولاً إلى أنابيب PCR قبل نقلها إلى الآبار؛ وهذه الممارسات معاً تقلل من خطر الانجراف العينة والتحميل المزدوج غير المقصود للآبار. وتوفر الطريقة المبينة في هذه الورقة للباحثين نهجاً لتحقيق أقصى قدر من تقنيات الاستخراج العالية الإنتاجية المتاحة مع الحد من خطر التلوث المتبادل الملازم للوحات 96 بئراً. نحن نقدم خطوة مفصلة من الخطوط العريضة لكيفية الانتقال من جمع العينات إلى استخراج الحمض النووي مع التقليل من خطر التلوث المتبادل غير المرغوب فيه.

Introduction

إن التقدم الذي تحقق مؤخراً في التسلسل عالي الإنتاجية للمجتمعات الميكروبية يوفر عمق تسلسل لا مثيل له، وبالتالي، لمحة غير مسبوقة عن أداء وتنوع ميكروبيوم الأرض¹. كما يزيد القدرة على تعدد العينات أكثر وأكثر على مسار تسلسل واحد، استخراج الحمض النووي أنبوب واحد لديه القدرة على أن تصبح خطوة تحد من معدل في توليد البيانات البيئية. ومع ذلك ، طرق جديدة في استخراج الحمض النووي عالية الإنتاجية عقد الوعد لمعالجة كميات كبيرة من العينات البيئية مع كفاءة أكبر مما كان ممكنا في السابق^2. وغالباً ما تنطوي هذه الطرق على استخدام 96 بئراً بدلاً من أنابيب واحدة، مما يزيد من العدد المحتمل من عمليات الاستخراج التي يمكن أن تحدث في وقت واحد. على هذا....

Protocol

1. مختبر مقاعد البدلاء وإعداد أداة لتحميل لوحة 96-جيدا

1. واضح أعلى مقاعد البدلاء عن طريق الضباب مع 70٪ الإيثانول. مسح والسماح للهواء الجاف قبل رش أعلى مقاعد البدلاء مع 10٪ التبييض. امسح أعلى مقاعد البدلاء الجافة.
2. تعقيم ملعقة صغيرة، ملعقة، ومقص الجراحية (منحني) عن طريق غمس في 95٪ الإيثانول ومن ثم تعرض لهب. تراجع كل في 10٪ التبييض والسماح لتجف الهواء قبل الاستخدام.
   ملاحظة: يجب أن يتم تعقيم أدوات بين كل عينة.

2- أخذ العينات الفرعية وإعداد العينات

1. تعقيم القفازات باستخدام الإيثانول قبل أخذ العينات الفرعية.
2. التجانس عينات التربة بدقة قبل أخذ العينات الفرعية.
3. باستخدام أدوات معقمة، تحميل أنبوب....

Results

تم استخدام هذه الطريقة الجديدة بنجاح لتحميل 96-جيدا لوحات استخراج الحمض النووي. وأظهرت المقارنة بين طرق تحميل الألواح أن لدينا طريقة أن يكون أدنى تركيز الحمض النووي في الآبار الفارغة. وكان تركيز الحمض النووي في الآبار الفارغة أقل بكثير من الطريقة المقترحة My McPherson et al.⁹ (p < 0.05)، على الرغم من أن تركيزات الحمض النووي في طريقتنا لم تختلف إحصائيا عن طريقة Qiagen الافتراضية(الشكل 2). كل الطرق الثلاث المنتجة تعني تركيزات الحمض النووي تحت 2 نانوغرام/ميكرولتر، على.......

Discussion

هذه الطريقة يقلل من فرص جيدا إلى جيد عبر التلوث أثناء تحميل عالية الإنتاجية عينات استخراج لوحات ويوفر وسيلة أكثر رقابة لتحميل 96-آبار لوحات وراء القائمة لوحات تحميل الاستراتيجيات^9,10. التلوث بين الآبار يمكن أن يكون أكثر انتشارا في استخراج 96 جيدا لوحة من في عمليات الاستخراج أنبوب واحد، وخاصة عندما الآلي^6،,7،وعلى الرغم من عدم اختبارها على وجه التحديد في أي منهجية، يمكن افتراض خطر التلوث المتبادل أعلى عندما.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 أوقية WhirlPak	Nasco	B01065
2 مل أنابيب الطرد المركزي	Fisherbrand	05-408-129
200 & micro ؛ أنابيب L-micro-PCR	Thermo Scientific	AB 2000
96-well PowerSoil DNA kit	Qiagen	12955-4	استخدمنا مجموعة استخراج التربة ولكن أي مجموعة بتنسيق 96 بئرا ستعمل.
كتلة الثلج لأنابيب الطرد المركزي 2 مل أي		أي	كتلة ثلج مصنوعة لأنابيب 2 مل ستعمل
كتلة الثلج ل 200 & L أنابيب micro-PCR	أي	أي	كتلة ثلج مصنوعة ل 200 & مايكرو ؛ ستعمل أنابيب L
مغرفة صغيرة	أي	فيلم
ختم قابل للثقب	مسبقا Excel Scientific	XPS25
	ملعقة أي
مقص جراحي	أي