مقالة منهجية

Methylation محددة متعددة القطرية PCR باستخدام بوليمر جهاز مولد قطرة لتشخيص الدم

DOI:

10.3791/61421

⸱

يونيو 29, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Life Sciences Division, National Research Council of Canada, 2Galenvs Sciences, Inc.

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم علامات اللاجينية لخلايا الدم البيضاء (WBC) subtyping من خلال القياس الكمي للأنماط المثيلة الحمض النووي. يقدم هذا البروتوكول طريقة تفاعل سلسلة البوليمرات القطرة المتعددة (mdPCR) باستخدام جهاز مرقّم حراري (TPE) قائم على microfluidic لتوليد القطرات مما يسمح بالتخصيص الكمي الدقيق والمضاعف للميثيل المحدد للعد التفاضلي WBC.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد وصف لسير عمل متعدد التكرار (mdPCR) وبروتوكول مفصل لتحديد الخلايا الدم البيضاء المستندة إلى اللاجينية (WBC) تفاضلية، جنبا إلى جنب مع مولد الدران الحراري (TPE) microfluidic جيل الجهاز. وتستخدم علامات اللاجينية لcC subtyping الذي هو من قيمة التكهن الهامة في أمراض مختلفة. ويتحقق ذلك من خلال القياس الكمي لأنماط المثيلات بالحمض النووي لمناطق معينة غنية بـ CG في الجينوم (Cpg loci). في هذه الورقة، يتم تغليف الحمض النووي المعالج بالثنائية الفقار من خلايا الدم أحادية النوى الطرفية (PBMCs) في قطرات مع كواشف mdPCR بما في ذلك الاعوئ والمسبارات الفلورية التحللية المائية المحددة لـ Cpg loci التي ترتبط مع مجموعات السكان الفرعية WBC. ويسمح نهج تعدد الخواص باستجواب العديد من مراكز Cpg loci دون الحاجة إلى تفاعلات منفصلة من المعالجة بالنظم المتعددة البروم في المواد الكيميائية، مما يتيح تحديد أكثر دقة للسكان شبه المحيطيين باستخدام التحليل اللاجيني لمواقع المثيل. ويمكن توسيع نطاق هذا القياس الكمي الدقيق إلى تطبيقات مختلفة ويسلط الضوء على فوائد التشخيص السريري والتكهن اللاحق.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل تكوين خلايا الدم البيضاء (WBCs) هو من بين الاختبارات المختبرية المطلوبة في كثير من الأحيان في التشخيص الدموي. يعتبر عدد الكريات البيض التفاضلي بمثابة مؤشر لطائفة من الأمراض بما في ذلك العدوى والالتهابات وفقر الدم وسرطان الدم ، وهو قيد التحقيق كعلامة بيولوجية تنبؤية مبكرة للعديد من الحالات الأخرى أيضًا. معيار الذهب في شرك WBC ينطوي على مناعة و / أو تدفق استئصال الدراجات على حد سواء التي تتطلب مكلفة، غير استقرار الأجسام المضادة الفلورية، وغالبا ما تعتمد اعتمادا كبيرا على كفاءة المشغل في إعداد العينة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة تنطبق على عينات الدم الطازجة فقط، بحيث لا يمكن تجميد العينات للشحن أو التحليل اللاحق.

ظهرت مؤخراً علامات اللاجينية كأدوات تحليلية قوية لدراسة الاختلافات الظاهرية. وفي وقت لاحق، تبين أن مجموعات الكريات البيض البشرية لديها أنماط لتلوين الحمض النووي لخلايا تسمح بالتأسم الدقيق للمجموعات الفرعية للWBC. subtyping على أساس علامات اللاجينية يوفر بديلا واعدا لا يعتمد على جمع عينة الدم الطازجة أو الأجسام المضادة باهظة الثمن ويمكن استغلالها كعلامة حيوية لظهور المرض والحساسية1،2،3،4،5.

وقد أجريت دراسات على نطاق الجينوم من أجل رسم خرائط واسعة النطاق لمناطق محددة ميثيلية من المناطق الغنية بـ CG في الجينوم (جزر Cpg) في أنواع فرعية من الكريات البيض لتحديد علامات اللاجينية المرشحة الخاصة بالأنماط الفرعية الكريات البيض. وقد تم تطوير بروتوكولات PCR لهذا السبب لمناطق الجينات الميثيلية، مثل CD3Z و FOXP3، المقابلة لـ CD3+ T-Cells و CD4+ CD25+ الخلايا T-التنظيمية (T-Regs) على التوالي. وقد أظهرت Wiencke وآخرون فائدة من الوتير PCR مزدوجة من أجل subtyping اللاجينية من الخلايا T، مما أسفر عن نتائج التي ترتبط ارتباطا كبيرا مع تدفق الخلايا النشطة الفرز (FACS) تحليل6. تعتمد طريقة التحليل الجيني الكمي هذه على تقسيم جزيئات الحمض النووي القالب والكواشف PCR إلى آلاف من منفصلة، الحجمية المعرفة، دون نانولتر الحجم قطرات الحجم التي تحتوي على صفر، واحد أو أكثر من النسخ الحمض النووي الهدف، وذلك باستخدام مستحلبات المياه في النفط التي مكنها microfluidics7،8. ويتم إجراء تضخيم PCR داخل كل قطرة على حدة ويتم قياس شدة الفلورية نقطة النهاية لكل قطرة، مما يسمح بالتقمّد الكمي المطلق للأهداف الموجودة في العينة. وقد تم إنشاء القطيرة PCR لتكون أكثر دقة ودقة، وأبسط من الناحية الفنية من qPCR القياسية، مما يجعلها أكثر ملاءمة الحمض النووي على أساس طريقة القائمة على التقييم السريري للخلايا T. على الرغم من أن منهجية فرعية الناشئة بسرعة ، وتحليل متعدد اللاجينية للتحقيق لمختلف المناطق Cpg الميثيلية في وقت واحد غير موجود. وهذا ضروري للعد التفاضلي الكريات البيض الروتينية.

هنا، يتم تقديم جهاز ميكروفلورويديك ميكروفلورويدي للبلاستيك اللدائن الحرارية (TPE) واستخدامها في وحدات PCR متعددة الوميضات الخاصة بالميثيل (mdPCR). وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لتحديد أنواع فرعية معينة من الكريات البيض، CD3+ T-Cells و CD4+ CD25+ T-Regs، استناداً إلى أنماط صبغة الحمض النووي الخلوي، أي التباين اللاجيني لمناطق CD3Z وFOXP3 CpG على التوالي. يوصف بروتوكول مفصل لاستخراج الحمض النووي وتحويل البيسولفيت وmdPCR بالتنسيق مع طريقة تصنيع لجهاز توليد قطرات TPE. وتقارن النتائج التمثيلية لهذه الطريقة بنتائج تلطيخ الفلوروس المناعي الذي يبرز فائدة النهج المقترح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وافق مجلس الأخلاقيات التابع للجنة النرويجية على جميع التجارب التي أجريت في هذه الدراسة التي شملت عينات بشرية، وتمت وفقاً لسياسات اللجنة التنظيمية النووية التي تحكم المواضيع البشرية التي تتبع المبادئ التوجيهية للبحوث المعمول بها وتمتثل للقوانين المعمول بها في كيبيك، كندا.

1. إعداد الخلية

  1. ذوبان الخلايا أحادية النواة الدموية الطرفية البشرية (PBMCs) على الفور عن طريق وضع cryovial في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. عكس الكريوفي مرتين لإعادة تعليق الخلايا بلطف واستخدام ماصة 1 مل نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
  3. إضافة 10 مل من قبل الدفء (37 درجة مئوية) متوسطة النمو تكملها 10٪ مصل الأبقار الجنين (1640 - 10 + 10 ٪ FBS) إلى أنبوب 15 مل التي تحتوي على PBMCs.
  4. الطرد المركزي تعليق الخلية في جهاز طرد مركزي دلو يتأرجح في درجة حرارة الغرفة بسرعة 330 × ز لمدة 10 دقيقة مع تسارع سريع والفرامل على ارتفاع.
  5. مرة واحدة تدور هو أكثر، وdedeant بعناية فائقة. Resuspend بيليه الخلية في 3 مل من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) pH 7.2، التي تحتوي على 2 MMethylenediaminetetraacetic حامض (EDTA) عن طريق التنصت على جانب الأنابيب.
  6. اخلط الخلايا عن طريق عكس الأنبوب مع الغطاء المغلق بإحكام.
  7. إعداد اثنين من 1.5 مل microtubes واستخدام ماصة aliquot 1.5 مل من تعليق الخلية في كل أنبوب، واحد منها يستخدم لتلوين المناعة اللاحقة واحد لاستخراج الحمض النووي.

2. تلطيخ المناعة وبروتوكول التصوير

  1. خلايا الـ Resuspend (من 1.7) في 200 ميكرولتر من العازلة PBS التي تحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم و 2٪ FBS وضبط التركيز النهائي من تعليق الخلية إلى حد أقصى 2 × 107 خلايا / مل.
  2. تقسيم تعليق الخلية عن طريق الأنابيب 100 μL حجم في اثنين من الأنابيب الدقيقة 1.5 مل منفصلة.
  3. إضافة 20 μL حجم من مضادة لل هيو CD3/CD4 مترافق مع الفلوريسين isothiocyanate (FITC) وPhycoerythrin (PE) إلى أنبوب واحد ومكافحة هو CD4/CD25 مترافق مع FITC وPE (انظر جدول المواد)إلى أنبوب الثاني، على التوالي.
  4. إضافة 1 قطرة من الأزرق الفلورسنت بقعة الخلية الحية (انظر جدول المواد)إلى كل أنبوب.
  5. احتضان في درجة حرارة الغرفة باستخدام أنبوب الدوار لمدة 2 ساعة. حماية من الضوء.
  6. الطرد المركزي تعليق الخلية في درجة حرارة الغرفة في 330 × ز لمدة 10 دقيقة مع تسارع سريع والفرامل على ارتفاع.
  7. Decant فائقة و resuspend بعناية بيليه الخلية عن طريق التنصت على الأنبوب. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني، وhH 7.2 تحتوي على 2 mM EDTA. ضمان أن يتم إغلاق غطاء بإحكام، وخلط الخلايا عن طريق عكس أنبوب 2x.
  8. كرر الخطوات 2.6 و 2.7 ثلاث مرات.
  9. خلايا إعادة الارتزاب في 20 ميكرولتر من PBS pH 7.2 تحتوي على 2 mM EDTA.
  10. Pipette 10 μL قطرة من تعليق الخلية على شريحة المجهر borosilicate والانتظار لمدة 2 دقيقة للخلايا إلى الرواسب ببطء إلى أسفل من قطرة.
  11. ضع غطاء زجاجي بعناية على أعلى شريحة المجهر ووضع الشريحة على خشبة المجهر المقلوب.
  12. تسجيل صور الخلايا باستخدام هدف 10x وكاميرا EMCCD متصلة بالمجهر لكل من الفلوروفوريس لكل من عينات تعليق الخلايا.
  13. عد الخلايا التي تحمل اسم الفلورسنت يدوياً (انظر المعلومات التكميلية للبيانات الأولية).
  14. اتخاذ نسبة من مضادة لل هو CD3 ومكافحة هو CD4/CD25 الخلايا المسمى لDAPI- ملون الخلايا للحصول على نسب CD3+ T-الخلايا وD4+ CD25+ T-Regs إلى مجموع الكريات البيض.

3- استخراج الحمض النووي وتحويل البيسولفيت

  1. استخراج الحمض النووي
    ملاحظة: استخراج الحمض النووي من PBMCs المعدة في القسم 1 باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي المغناطيسي (انظر جدول المواد)باتباع الإجراءات التي قدمها الصانع.
    1. في أنبوب 1.5 مل تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإضافة 20 ميكرولتر من البروتينات K و 400 ميكرولتر من Lysis / ملزم العازلة. مزيج عن طريق الأنابيب صعودا إلى أسفل 10x، ثم تنفيذ الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. التقاط مجمع الحمض النووي حبة عن طريق وضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة 1-2 دقيقة، ثم إزالة بعناية وتجاهل supernatant.
    3. إزالة أنبوب يحتوي على مجمع الحمض النووي حبة من رف المغناطيسي وإعادة ربط الخرز في 600 ميكرولتر من غسل العازلة #1 لغسل أي ربط غير محددة.
    4. وضع أنبوب مرة أخرى على الرف المغناطيسي وإزالة بعناية وتجاهل افرا.
    5. كرر الخطوات 3.1.3 و 3.1.4 مع 600 ميكرولتر من #2 الغسيل المؤقت.
    6. اتركي الأنبوب مفتوحاً لتجفيف الهواء لمدة دقيقة.
    7. إزالة أنبوب من رف المغناطيسي وlute الحمض النووي عن طريق الاستغناء 100 ميكرولتر من عازلة Elution و pipetting مجمع الحمض النووي / الخرز صعودا وهبوطا 20x.
    8. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الحمض النووي المائل مرة أخرى على الرف المغناطيسي واحتضان لمدة 1-2 دقيقة لفصل الخرز المغناطيسي من الحمض النووي المائل.
    9. نقل محلول الحمض النووي المنقى إلى أنبوب نظيف جديد.
    10. تقييم تركيز عينة الحمض النووي المنقى عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس طيفي.
  2. تحويل بيسولفيت
    ملاحظة: إجراء تحويل البيسلفيت على الحمض النووي المنقى باستخدام مجموعة الميثيل (انظر جدول المواد)باتباع الإجراءات التي تقدمها الشركة المصنعة.
    1. إلى 20 ميكرولتر من عينة الحمض النووي (200-500 نانوغرام) في أنبوب PCR إضافة 130 ميكرولتر من كاشف التحويل. تخلط جيدا وتدور لفترة وجيزة.
    2. نقل أنبوب PCR إلى دورة حرارية وتنفيذ بروتوكول ركوب الدراجات على النحو التالي: 98 درجة مئوية لمدة 8 دقائق؛ 54 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة والاحتفاظ عند 4 درجة مئوية.
    3. أضف 600 ميكرولتر من مخزن الربط المؤقت إلى عمود لوني (IC) يوضع في أنبوب جمع.
    4. أضف عينة الحمض النووي إلى عمود IC الذي يحتوي على المخزن المؤقت للربط واخلطه عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. جهاز طرد مركزي لمدة 30 s بأقصى سرعة. تجاهل التدفق الذي تم جمعه من خلال.
    5. إلى العمود الآن إضافة 100 μL من مخزن الغسيل. تنفيذ الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 3.2.4 وتجاهل تدفق-عبر.
    6. إضافة 200 ميكرولتر من عازلة إزالة الكبريت وتنفيذ الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة. الطرد المركزي والتخلص من تدفق من خلال كما هو موضح في الخطوات أعلاه.
    7. أضف 200 ميكرولتر من الغسيل المؤقت إلى العمود. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 30 s والتخلص من تدفق من خلال.
    8. كرر الخطوة 3.2.7.
    9. نقل العمود إلى أنبوب جمع 1.5 مل جديدة وإضافة 100 μL من المياه PCR الصف على غشاء العمود. جهاز طرد مركزي في سرعة كاملة لمدة 1 دقيقة ل elute الحمض النووي.
    10. تقييم تركيز عينة الحمض النووي المحولة من مادة البيسولفيت عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيفي.
      ملاحظة: استخدم قيمة 40 ميكروغرام/مل للامتصاص عند 260 نانومتر = 1.0.
    11. تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير أو في -70 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

4. تصنيع الجهاز الجيل القطير

ملاحظة: جهاز microfluidic المستخدمة لتوليد قطرات (ملف CAD المقدمة في المعلومات التكميلية)تم تصنيعها في غرفة نظيفة (فئة 1000) في اللدائن الحرارية (انظر جدول المواد)باستخدام النقش الساخن ولدت من قبل البروتوكولالتالي.

  1. SU-8 تصنيع العفن
    1. إعداد قالب SU-8 على رقاقة السيليكون 6 "باستخدام التصوير الضوئي القياسية على النحو المفصل أدناه.
    2. تنظيف رقاقة السيليكون 6 "باستخدام بلازما الأكسجين في 500 W لمدة 10 ق.
    3. تدور معطف SU-8 مقاومة على رقاقة السيليكون في 900 دورة في الدقيقة لمدة 40 ثانية لتحقيق سمك الفيلم الإجمالي من 100 μm.
    4. ضعي الرقاقة على طبق ساخن واخبزي قبل 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية، تليها 2 ساعة عند 95 درجة مئوية.
    5. فضح للأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر (زئبق I-line) من خلال قناع ضوئي شفاف عالي الوضوح باستخدام جرعة التعرض من 1000 mJ/cm2.
    6. ضعي الرقاقة على طبق ساخن وخبزي لمدة 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية، تليها 40 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
    7. تطوير عن طريق الغمر في البروبيلين غليكول أحادية الميثيل خلات الأثير (PGMEA) لمدة 5 دقائق.
    8. شطف مع PGMEA وisopropanol وجافة مع تيار من غاز النيتروجين.
    9. ضعي الرقاقة على طبق ساخن وخبزي 2 ساعة عند 135 درجة مئوية.
    10. Silanize رقاقة في desiccator فراغ تحتوي على قطرة من وكيل سيلانينغ (tricholoro perfluorooctyl silane) وضعت على شريحة المجهر الزجاجي المجاورة لمدة 2 ساعة.
      ملاحظة: يتم ذلك لجعل السيلانيات تشكل أحادية الطبقة على سطح سيد SU-8. وينبغي دائما معالجة السيلان البيرفلورو فلوريكتيل في غطاء الدخان والاحتفاظ بها بعيدا عن مصادر المياه.
  2. نسخة متماثلة من بوليديميثيل الأكسان (PDMS)
    1. إعداد prepolymers السائل من PDMS (انظر جدول المواد)بنسبة 10:1 ث / ث من قاعدة elastomer لعلاج عامل في كوب من البلاستيك.
    2. وضع الكأس في الخلاط فراغ الطرد المركزي الكواكب لخلط و degas خليط PDMS.
    3. صب خليط PDMS على القالب الموضوع في حامل المعادن المخصصة التي تمنع تسرب الراتنج وعلاج في 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    4. باستخدام ملاقط، قشر بعناية قبالة قالب PDMS من سيد SU-8.
  3. ايبوكوكسي العفن
    ملاحظة: تم تصنيع قالب الايبوكسي من سيد SU-8/السيليكون باستخدام عملية تكرار وسيطة مع PDMS.
    1. إعداد راتنج الايبوكسي (انظر جدول المواد)باستخدام نسبة 100/83 ث / ث من الراتنج / تصلب.
    2. Degas الخليط تحت ضغط مخفض باستخدام فراغ فرن التجفيف لمدة 30 دقيقة.
    3. صب الراتنج على النسخة المتماثلة PDMS وعلاج في 80 درجة مئوية ل 12 ساعة.
    4. إزالة قالب الايبوكسي الشفاء من النسخة المتماثلة PDMS، ومكان على لوحة ساخنة والخبز الثابت لمدة 2 ساعة في 120 درجة مئوية.
  4. جهاز TPE
    1. extrude الكريات من TPE (انظر جدول المواد)في 165 درجة مئوية في 2.0 مم سميكة و 7 " ورقة واسعة من عدة أمتار في الطول وتخزينها على أنها لفة للاستخدام في المستقبل.
    2. قطع ورقة TPE من لفة باستخدام مقص في مربع 7 ".
    3. ضع ورقة TPE بين قالب الايبوكسي ورقاقة سيليكون غير منقوشة (انظر الخطوة 4.1.10 لإجراء الويفر).
    4. أداء النقش الساخن عند درجة حرارة 125 درجة مئوية، قوة تطبيقية من 10 كيلو ن، وضغط من10-2 mbar لمدة 10 دقائق.
    5. Demold بعناية في درجة حرارة الغرفة باستخدام رذاذ الميثانول لفصل TPE المنقوش من رقاقة السيليكون والعفن الايبوكسي.
    6. قطع آخر 7 "ورقة مربعة من TPE ووضعها بين اثنين من رقائق السيليكون غير المنقوشة.
    7. أداء النقش الساخن عند درجة حرارة 140 درجة مئوية، وقوة تطبيقية من 10 كيلو ن، وضغط من 10-2 mbar لمدة 10 دقائق لتشكيل سطح مُسطح لإغلاق القنوات وختم الجهاز.
    8. Demold بعناية في درجة حرارة الغرفة باستخدام رذاذ الميثانول لفصل TPE المنقوش من رقائق السيليكون اثنين.
    9. قطع كل من أوراق TPE منقوش إلى حجم الجهاز باستخدام شفرة الطبيب.
    10. لكمة ثقوب الوصول إلى قنوات مدخل ومدخل في الجهاز منظم باستخدام 1 مم خزعة إبرة لكمة مع المكبس.
    11. أرفق القنوات بوضع جهاز TPE على اتصال مباشر مع القنوات في درجة حرارة الغرفة.
    12. اختياريا، ضع في فرن في 70 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتعزيز الترابط الجهاز.
    13. تناسب فتحات الوصول مع أنابيب سائلة يمكن التخلص منها (0.25 مم، O.D. 0.8 مم). ختم المفاصل باستخدام الغراء الايبوكسي لضمان تسرب واقية من التلاعب.

5. توليد القطيرات و PCR

ملاحظة: يحدد الجدول 1 المعلومات المتعلقة بالبث التمهيدي الأمامي والعكوس إلى جانب مسابير التحلل المائي المزدوجة الإخماد للجينات C-LESS و CD3Z و Foxp3، المطلوبة للتضخيم المتعدد لأهداف الجينات المزيلة للغموض.

  1. إعداد المزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 2.
  2. ذاب جميع مكونات المزيج الرئيسي باستثناء مزيج انزيم. مزيج ماجستير جيدا عن طريق pipetting صعودا إلى أسفل وتدور أسفل لفترة وجيزة.
  3. إضافة حجم مناسب (1 ميكرولتر) من الحمض النووي ثنائي السلفيت تحويلها (من القسم 3.2) إلى مزيج رئيسي في أنبوب PCR. مزيج رد فعل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا وتدور لفترة وجيزة.
  4. قم بتوصيل الأنابيب السائلة القابلة للتخلص (0.25 مم، 0.25 مم، O.D. 1.6 مم) إلى حقنتين زجاجيتين دقيقتين (250 ميكرولتر) باستخدام تركيبات PEEK.
  5. قبل ملء حقنة زجاجية دقيقة مع 250 ميكرولتر من زيت الناقل تحتوي على 5٪ فلورو السطحي.
  6. قم بملء حقنة زجاجية دقيقة أخرى بـ 50 ميكرولتر من زيت الناقل قبل تحميل 100 ميكرولتر من مزيج PCR لضمان الاستغناء عن حجم العينة بالكامل أثناء الاستحلاب.
  7. إعداد جهاز microfluidic قطرات على خشبة المسرح من المجهر الخفيف تستقيم مجهزة كاميرا عالية السرعة لمراقبة وتسجيل تشكيل قطرات في الوقت الحقيقي.
  8. وضع الحقن المعبأة مسبقا على مضخة حقنة للبرمجة واستخدام اتحاد PEEK مع التجهيزات (انظر جدول المواد)،وربط أنابيب من المحاقن إلى أنابيب قنوات مدخلها من الجهاز microfluidic قطرة.
  9. ضع الأنابيب من مأخذ مولد القطرات داخل أنبوب PCR 0.5 مل.
  10. ضبط معدل تدفق مضخة حقنة إلى 2 ميكرولتر / دقيقة والسماح لحجم قطرات لتحقيق الاستقرار قبل جمع مستحلب الناتجة.
  11. جمع مستحلب ونقل 75 ميكرولتر إلى أنبوب PCR 0.2 مل للدراجات الحرارية.
  12. تأكد من أن محتوى الزيت في أنبوب PCR يطابق حجم المرحلة المشتتة منعًا لتكتّن القطرات أثناء الدراجات الحرارية.
  13. ضع أنبوب PCR 0.2 مل في دورة حرارية وقم بإجراء بروتوكول الدراجات على النحو التالي: التسخين المسبق عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم 45 دورة من الdenaturation عند 95 درجة مئوية لمدة 15 s ودل / التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ث.
  14. استخدم المستحلب المتبقي لملء أنبوب الشعيرات الدموية البورسليكات (عمق 100 ميكرومتر) مع ملف تعريف مستطيل من أجل صورة قطرات وتقييم قطر القطرة.
  15. ضع أنبوب البورسليكات المليء بالمسحل على شريحة المجهر. استخدم مجهر مقلوب مزود بكاميرا EMCCD وهدف 10x لتسجيل صور الحقول الساطعة من القطرات.
  16. قياس قطر القطر باستخدام برنامج تحليل الصور كما هو مفصل أدناه.
  17. تعيين مقياس المسافة المعروفة في ميكرون المقابلة لعدد وحدات البكسل في الصورة عن طريق تحديد الزر "تحليل" ثم "تعيين مقياس' .
  18. قم بتحويل الصورة إلى تدرج الرمادي عن طريق تحديد زر "الصورة" ثم "اكتب". ضبط السطوع والتباين إذا لزم الأمر. تعيين عتبة دليل لتحديد وملء الدوائر عن طريق تحديد 'صورة' زر ثم 'ضبط عتبة'.
  19. تحليل الجسيمات عن طريق اختيار الزر"تحليل الجسيمات"وتعيين الدائري إلى 0.75 – 1.
  20. الحصول على المساحة الناتجة وقطر قطرات قياس التي يتم عرضها تلقائيا في البرنامج.
  21. حساب قطر القطرة المتوسطة وبافتراض قطرة كروية، تقدير حجم القسم، والتي سيتم استخدامها لحساب التركيز المستهدف المطلق.
  22. تأكد من أن القطرات أحادية الdispers من خلال تحليل معامل التباين (CV) الذي يؤخذ كنسبة من الانحرافات المعيارية إلى القيم المتوسط(ك = 1) ، لقطرات (< 3 ٪).

6. التصوير الفلوري وتحليل الصور

  1. التصوير المفلور
    1. بعد التضخيم، نقل مستحلب PCR إلى أنبوب بوروسيليكات الشعرية (عمق 50 ميكرومتر) مع ملف تعريف مستطيل من أجل ترتيب قطرات في أحادية معبأة قريبة للتصوير.
    2. إصلاح الشعيرات الدموية المليئة على شريحة المجهر وختم كلا الجانبين باستخدام لاصق الأشعة فوق البنفسجية الاكريليك. تطبيق مصدر الأشعة فوق البنفسجية الضوء على لاصقة الأشعة فوق البنفسجية مع الحرص على عدم إلقاء الضوء على مستحلب لتجنب تبييض العينة.
    3. قم بتحميل الشريحة الزجاجية على مجهر مقلوب مزود بكاميرا EMCCD وهدف 10x.
    4. باستخدام برنامج التصوير بالمجهر، حدد الحصول على | مباشر - سريع لبدء اقتناء الكاميرا في الوقت الحقيقي، ومراقبة العينة، وضمان أن يتم التقاط عرض شعري.
    5. تعيين مصباح الحقل مشرق للإضاءة diascopic في 3.5 V.
    6. تعيين مصباح الفلورسنت LED واسع الطيف لإضاءة الإبيسكوبيك في كثافة 20٪.
    7. ضبط إعدادات الالتقاط لكافة الأطوال الموجية (حقل ساطع، FAM، HEX و Cy5) يدويًا عن طريق تحديد المعايرة | أمر التكوينات البصرية في برنامج التصوير. لكل فلوريوفور، يجب تبديل مكعب مرشح الفلوريسين المقابل يدويًا. يجب استخدام مكعب تصفية للتصوير الحقل الساطع للحفاظ على نفس المسار البصري.
    8. ضبط وقت التعرض ضوئيًا يدويًا قبل الحصول على الصورة باستخدام Acquire | أمر إعدادات الكاميرا لكل فلوريوفور كما هو ملخص في الجدول 3. تعيين طريقة القراءة EM كسب 17 ميغاهيرتز في 16 بت مع مضاعف ربح من 100 في 'التقاط إعدادات' قائمة البرنامج.
    9. في نافذة LUT من البرنامج، تعيين مقياس LUTs بحيث يتم ضم إشارة الإرسال ضمن نطاق المجموعة. في هذه التجربة، تم تعيين مقياس من 500 إلى 12،000 تقريبا.
    10. أتمتة التقاط باستخدام برنامج الاستحواذ متعددة النقاط باستخدام كل من فحص XY وخيارات الطول الموجي متعددة في هذا الترتيب المحدد. تأكد من أن المرحلة تنتقل إلى الموضع الأولي، والتقاط جميع الأطوال الموجية المختلفة، ومن ثم المضي قدما إلى الموضع التالي.
    11. أولاً، قم بإعداد فحص XY عن طريق تخصيص ملف تعريف الفحص XY في قائمة فحص XY للبرنامج. في 'مخصص تعريف متعدد النقاط' ، اختر مربع تعريف الصورة الكبيرة وتعيينه إلى 40.0 × 1.0 ملم تقريبا (طول ملء مستحلب). استخدام 1% تراكب.
    12. تمكين الخيار'استخدام سطح التركيز'وإعداد منحنى سطح التركيز عن طريق ضبط مستوى التركيز في نقاط مختلفة على العينة باستخدام مقبض التركيز على المجهر.
    13. ثانياً، قم بإعداد المسح الضوئي متعدد الطول الموجي عن طريق تحديد علامة التبويب المسح الضوئي. إضافة كل تكوين من التكوينات البصرية التي تم إنشاؤها في الخطوة 6.1.7 لكل طول موجة.
    14. انقر فوق خيار إغلاق الغالق النشط أثناء حركة المرحلة وأثناء تغيير التصفية لتجنب تبييض العينة وتشغيل عملية الاستحواذ عن طريق الضغط على زر تشغيل' بدء التشغيل. قم بتصدير كل إطار امتلاك إلى ملفات tiff وتقسيم كل قناة إلى ملف منفصل باستخدام خيار تقسيم ملفات متعددة وتطبيق إعدادات LUTs المحفوظة. استخدم اسم النقطة و خيار اسم القناة للتمييز بسهولة بين كل ملف صورة.
  2. تحليل الصور
    1. فرز جميع الصور المكتسبة من قبل مرشحات brightfield و fluorescence لتحميلها إلى برنامج تحليل الصور مفتوحة المصدر.
    2. استخدم برنامج تحليل الصور لإنشاء خط أنابيب من أجل تحديد جميع القطرات باستخدام صور الحقول الساطعة ، ثم قياس كثافة قطرات الفلورسنت المرتبطة بها.
    3. إلى خط الأنابيب، تحميل brightfield وseescence صور tiff ثم إضافة وحدات 'ColorToGray'، 'IdentifyPrimaryObjects'،'MeasureObjectIntensity'، و'ExportToSpreadsheet'. استخدم صور قطرات الحقول المضيئة لتحديد الكائنات، ثم استخدم الكائنات كقناع لقياس كثافة الصور الفلورية.
    4. تشغيل خط أنابيب مع صور tiff مختارة لاستخراج متوسط كثافة الفلوريسنس من الصور قطرات الفلوريسين. إجراء التجربة في ثلاثية، مع كل مجموعة تتكون من ~ 5،000 قطرات للتحليل.
    5. تطبيق خوارزمية'definetherain'(http://definetherain.org.uk/) لتحديد مجموعات القطرات الإيجابية والسلبية. يجب أن تكون الإيجابيات ضمن 3 انحرافات معيارية من الوسط. وهذا يحدد شدة عتبة قطرات إيجابية لاستخدامها في العد.
    6. مرة أخرى استخدام برنامج تحليل الصور لتنفيذ خط أنابيب جديد حيث يتم تعيين عتبة الفلوريسنس لكل هدف الجينات كما هو محدد في الخطوة السابقة.
    7. تحميل الصور brightfield والفلورسنت إلى خط الأنابيب. إضافة وحدات 'ColorToGray', 'RescaleIntensity', 'عتبة', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectSizeShape', 'تصفيةObjects', و 'ExportToSpreadsheet'. إنشاء وحدات فريدة من نوعها لصور brightfield وكل مرشح الفلوريسنس للقطرات.
    8. إعادة قياس مقياس كثافة الصورة من 0 إلى 1 لكل مجموعة صور مضنية. ثم تعيين عتبة لتحديد و حساب الكائنات فوق عتبة المنشأة. إذا لزم الأمر، إضافة'ExpandOrShrinkObjects' وحدة 'لتقليص الكائنات لتسهيل العد وتحديد قطرات في brightfield.
    9. تحديد الكائنات فقط ضمن حجم مختار من 20-30 بكسل وتصفية الكائنات التي تم حسابها للاحتفاظ فقط تلك الكائنات ذات القطر المحدد (أي، قطرات في نطاق 75 ميكرومتر) وغريب الأطوار كروية مستديرة من 0.5 وأقل.
    10. تصدير النتائج إلى جدول يسرد إجمالي عدد القطرات من صور الحقول الساطعة، بالإضافة إلى عدد القطرات لجميع قنوات الفلوريسنس المستخدمة؛ وهي Cy5 للجين C-LESS، HEX لميثيل الجين CD3Z، و FAM لميثيل FOXP3 الجينات (انظر المعلومات التكميلية للحصول على البيانات التجريبية الخام التي تم الحصول عليها لمقايسة MDPCR المعروضة).
    11. حساب نسبة قطرات سلبية لكل هدف الجينات وتطبيق توزيع بواسون للحصول على نسخ كل قطرة (CPD) باستخدام المعادلة 1:
      figure-protocol-1
      حيث تمثل x عدد القطرات التي تحتوي على 0 أو 1 أو 2 أو أكثر من الجزيئات، وتمثل λ قيمة CPD.
    12. حساب، التركيز الهدف المطلق عن طريق أخذ نسبة قيمة CPD وحجم القطيرات التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.20 مع المعادلة 2:
      figure-protocol-2
      حيث تمثل القيمة (1-p) كسر القطرات السالبة.
    13. حساب النسبة المئوية لـ CD3+ T-Cells و CD4+ CD25+ T-Regs بقسمة قيم CPD الخاصة بجينات CD3Z و FOXP3 الميثيلية على قيم C-LESS - أو الخلية الإجمالية - CPD (راجع المعلومات التكميلية لحسابات CPD من البيانات الأولية).
    14. قارن هذه القيم في المئة لتلك التي تم الحصول عليها من التصوير المناعي باستخدام الأجسام المضادة لـ CD3+ T-Cell و CD4+ CD25+ T-Reg.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصنيع جهاز مولدات قطرات ميكروفلورويديك القائم على TPE باستخدام البروتوكول الموصوف كما هو موضح في الشكل 1. تم استخدام قناع الشفافية في التصوير الضوئي للحصول على السيليكون (سي) الماجستير. تم إجراء الطباعة الحجرية لينة للحصول على نسخة طبق الأصل PDMS العكسي من سيد Si الذي كان يستخدم بعد ذلك لاختلاق قالب الايبوكسي. سكب السلائف الايبوكسي على PDMS وعلاجها إلى crosslink وتصلب. وكان هذا القالب، الذي يمثل النسخة المتماثلة الدقيقة من سيد سي أكثر مرونة للحرارة اللاحقة من اللدائن الحرارية باستخدام الن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول التجريبي المعروض والأساليب تسمح لdPCR في المنزل باستخدام مولد قطرات TPE ملفقة، ودورة حرارية، والمجهر الفلورانس. الجهاز ملفقة باستخدام TPE لينة إلى TPE الترابط يتيح خصائص سطح الماء التي هي موحدة عبر جميع جدران القناة، بحيث الجهاز النهائي لا يتطلب أي معالجة السطح للاستخدام اللاحق كمولد قطرة. وقد استخدمت هذه المواد بشكل روتيني في منصة نقطة الرعاية التي تتطلب التوافق مع عالية الإنتاجية تصنيع9،10،11،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا توجد تعارضات للإعلان عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويقر المؤلفون بالدعم المالي المقدم من المجلس الوطني للبحوث في كندا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Bio-Rad ، ميسيسوجا ، ONTFI0201أنبوب
RAN Biotechnologies ، بيفرلي ، MA008-FluoroSurtuantFluoro-surqant
Silicon Quest International ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا
أكسفورد إنسترومنتس ، أبينجدون ، المملكة المتحدةكاميرا
Thermo Fisher Scientific ، والثام ، ماساتشوستسMA5-16728
Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA22-8425-71
CellProfilerالمستخدمة لتحليل
نيكون ، اليابانالموضوعية 10x
(ATCC) ، ماناساس ، فيرجينياPCS-800-011
Ram & eacute ؛ -Hart Instrument Co. (Netcong ، NJ)p / n 200-U1
فيشر ، كندا
Vitrocom ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية5015 و 5010أنبوب
(http://definetherain.org.uk/)
هاماماتسو ، اليابانLC-L1V5DEL مصدر
الدولوميت3200063سائل يمكن التخلص
الدولوميتأنابيب السوائل التي يمكن التخلص منها
rding ، النمسا
Zymo Research ، إيرفين ، كاليفورنياD5030
Photron ، سان دييغو ، كاليفورنيا
IDT ، كورالفيل ، IA
Gersteltec ، بولي ، سويسراللضوء SU-8
Fineline Imaging ، كولورادو سبرينغز ، CO
Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا203603
صورة Jتستخدم لتقييم فقر الدم بقطر
، مونتريال ، QC
Excelitas ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةالفلورسنت LED واسع الطيف
Galenvs Sciences Inc. ، مونتريال ، QCDE1010
Hexpol TPE ، & Aring ؛ م & أرينج; ل ، المطاط الصناعي السويديبالحرارة (TPE)
Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA13-400-518
نيكون ، اليابانتستخدم للحصول على الصور
3M ، سانت بول ، مينيسوتاCarrier Oil
Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MAR37605الخلايا الحية الفلورية الزرقاء (DAPI)
آيدكس للصحة & العلوم ، أوك هاربور ، واشنطنP-881PEEK التجهيزات
Sigma-Aldrich ، أوكفيل ، ON806552
داو كورنينج ، ميدلاند ، ميشيغان
ThinkyUSA ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةARV 310
Ihc World ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكيةIW-125-0
Zinsser NA ، نورثريدج ، كاليفورنيا2607808
Cetoni GmbH، كوربوسن ، ألمانيا
سيجما ألدريتش ، أوكفيل ، أونتاريو484431
بيو راد ، ميسيسوجا ، أونتاريو1861096
هيتاشي هاي تكنولوجيز ، ميسيسوجا ، أونتاريو
نيكون ، ميلفيل ، نيويوركمجهر
نيكون ، اليابان
لوكتايتأ 352
PCREMCCDالصور الفلورية مجموعة ثقافة النوع الأمريكي كابيلاري البورسليكاتضوء الأشعة فوق البنفسجية أنابيب منها 3200302 IDT ، كورالفيل ، IA نيكون ، ميلفيل ، نيويورك مجهر ضوئي مستقيم Cytec Industries ، Woodland Park ، NJ EV Group ، Sch & auml ؛ التصوير المقاوم القطرات مصباح صبغة مقلوب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
  2. Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
  3. Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
  4. Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
  5. Zouali, M. The Autoimmune Diseases. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
  6. Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
  7. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  8. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  9. Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
  10. Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
  11. Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
  12. Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
  13. Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Multiplex Droplet PCRDNA Methylation AnalysisEpigenetic BiomarkersWhite Blood Cell SubtypingPeripheral Blood Mononuclear CellsBisulfite ConversionDroplet Generation DeviceFluorescence ImagingHematological DiagnosticsCpG Loci Quantification

مقالات ذات صلة