يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

كمية فيروس داء الكلب في مختلف هياكل الدماغ البقري

3.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61429

⸱

مايو 22, 2021

 ,  ,  , 
1Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA), INIFAP, 2Campus Toluca, Universidad del Valle de México, 3Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autónoma de Querétaro

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول نهجا قائما على qRT-PCR لتحديد رقم نسخة الجينات لفيروس داء الكلب (N) داخل مختلف الهياكل التشريحية للدماغ البقري باستخدام النسخ المختبري.

الملخص

داء الكلب الأبقار الشللي (BPR) هو شكل من أشكال التهاب الدماغ الفيروسي الذي له أهمية اقتصادية كبيرة في جميع أنحاء أمريكا اللاتينية، حيث يشكل خطرا حيوانيا كبيرا. هنا، كان هدفنا هو استخدام بروتوكول مختبري لتحديد عدد النسخ النسبية من جينوم فيروس داء الكلب (RABV) في الهياكل التشريحية المختلفة للدماغ البقري باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل النسخ العكسي الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR). يحدد qRT-PCR عدد النسخ الجينية المحددة الموجودة في عينة استنادا إلى الفلورسينس المنبعث بعد التضخيم الذي يتناسب بشكل مباشر مع كمية الحمض النووي المستهدف الموجودة في العينة. هذه الطريقة مفيدة نظرا لقصر مدة، وانخفاض خطر التلوث، وإمكانية الكشف عن الأحماض النووية الفيروسية في عينات مختلفة بسهولة أكبر بالمقارنة مع التقنيات الأخرى. تم تقسيم أدمغة ستة مسعورة إلى ستة هياكل تشريحية ، وهي قرن الأمون والمخيخ والقشرة والمولدة والمهور والمهاد. تم تحديد جميع الأدمغة على أنها إيجابية لمضادات RABV استنادا إلى اختبار المناعة المباشر. كما تم تقييم نفس الهياكل التشريحية من أدمغة أربعة أبقار سلبية من RABV. تم استخراج الحمض النووي الريبي من كل هيكل واستخدامها لQRT-PCR. تم إجراء فحص لتحديد أرقام نسخ جينات RABV باستخدام جين نوكليوبروتين منقول في المختبر. أظهر المنحنى القياسي المستخدم لقياس الحمض النووي الريبي الفيروسي كفاءة 100٪ وخطية 0.99. وكشف التحليل أن القشرة، والذبولة، والمهاد هي الأجزاء المثالية من الجهاز العصبي المركزي لاستخدامها في الكشف عن رابعة التدخل السريع، استنادا إلى ملاحظة أن هذه الهياكل تمتلك أعلى مستويات RABV. كانت خصوصية الاختبار 100٪. وكانت جميع العينات إيجابية، ولم يتم الكشف عن أي إيجابيات كاذبة. يمكن استخدام هذه الطريقة للكشف عن RABV في العينات التي تحتوي على مستويات منخفضة من RABV أثناء تشخيص BPR.

المقدمة

يمكن تأكيد داء الكلب قبل الوفاة وبعد الوفاة من خلال تقنيات مختلفة تمكن من الكشف عن الأحماض النووية الفيروسية في الدماغ أو الجلد أو البول أو اللعاب1. الكشف عن فيروس داء الكلب نيوكليوبروتين(N)الجين يستخدم في المقام الأول لتشخيص داء الكلب عن طريق الاختبارات الجزيئية. ويستخدم هذا الجين أيضا لل genotyping الفيروسية. يمكن تشخيص داء الكلب في الحيوانات باستخدام أي جزء من الدماغ المصاب. ومع ذلك ، لاستبعاد احتمال داء الكلب ، يجب اختبار الأنسجة من منطقتين على الأقل في الدماغ2. توجد عدة طرق تشخيصية للكشف عن داء الكلب في الحيوانات؛ ومع ذلك ، فإن اختبار المناعة المباشر يبقى التقنية المرجعية القياسية3. وتشمل الاختبارات الأخرى الاختبارات البيولوجية التي تتضمن تلقيح الفئران، والعدوى في زراعة الأنسجة، والبوليميراز سلسلة من ردود الفعل (PCR)4. وتوصي منظمة الصحة العالمية والمنظمة العالمية للصحة الحيوانية (OIE) جميع هذه التقنيات لتشخيص داء الكلب في البشر والحيوانات، على التوالي5.

وقد أحدثت تقنيات الكشف عن الحمض النووي والتضخيم ثورة في تشخيص داء الكلب في السنوات الأخيرة6 وتلعب هذه التقنيات دورا هاما في تشخيص داء الكلب البشري قبل الوفاة. تم تقييم العديد من الاختبارات القائمة على PCR لاستكمال الاختبارات التقليدية لتشخيص داء الكلب قبل الوفاة وبعد الوفاة 7و8و9و10. معظم المقايسات تستهدف داء الكلب الفيروسية نيوكليوبروتين الجينات للتضخيم الذي هو المنطقة الأكثر حفظا للغاية في الجينوم الفيروسي1،11. في السنوات العشرين الماضية، تم تطوير مختلف المقايسات الجزيئية لتشخيص RABV، وقد استخدمت بعض هذه المقايسات لتحديد خصائص الفيروس. وقد استهدفت معظم التجارب للكشف عن الجينات المحفوظة داخل الجينوم الفيروسي، والأكثر شيوعا باستخدام التقليدية أو الكمية في الوقت الحقيقي البوليميراز سلسلة من ردود الفعل (qRT-PCR) المقايسات12،13.

PCR هو تقنية تشخيص حساسة للغاية يمكنها اكتشاف جينوم مسببات الأمراض المعطى داخل الأنسجة ، حتى عندما تتحلل هذه الأنسجة. باستخدام النهج القائمة على PCR ، يمكن اكتشاف كميات ضئيلة من العامل المعدي في عينة سريرية من خلال التضخيم الانتقائي والمتكرر لتسلسل نيوكليوتيد الحمض النووي14. وقد استخدم qRT-PCR الذي يتضمن مسابير فلورية (مثل TaqMan) أو الأصباغ الملزمة للحمض النووي (مثل SYBR Green) في التجارب لتشخيص RABV قبل- وبعد- الوفاة بحساسية عالية؛ غير أن هذا النهج يتطلب معدات متخصصة. وللتغلب على هذا القيد، اقترح التضخيم الحراري (RT-LAMP) بوساطة حلقة النسخ العكسي، استنادا إلى تكلفته المنخفضة وبساطته وخصائصه المستصوبة للكشف عن رابعة رابعة. هذا المقايسة مهمة بشكل خاص حيث يمكن استخدامها في البلدانالنامية 15.

ويستند qRT-PCR على الكشف عن وتكميم جزيء، حيث زيادات إشارة الفلورسنت هي في نسبة مباشرة إلى كمية المنتج PCR في رد فعل واحد. كما يزيد عدد نسخ من هدف الحمض النووي، وكذلك لا الفلورسينس. وتستخدم عادة الأصباغ المتشابكة غير محددة مثل صبغة الحمض النووي الأخضر SYBR ملزمة أو مسابير أوليغونوكليوتيد تسلسل محددة تحمل الفلوروفور وquencher لتوفير قراءات الفلورسنت في qRT-PCR. هذا المقايسة يوفر مزايا على RT-PCR التقليدية التي تشمل أقصر وقت الاختبار (2-4 ساعة), انخفاض خطر التلوث بسبب نظام أنبوب مغلق (عدم وجود تلاعب بعد PCR من المنتجات تضخيم), والقدرة على الكشف عن أهداف مختلفة في وقت واحد16. يمكن استخدام qRT-PCR لتشخيص داء الكلب قبل الوفاة من اللعاب وعينات أخرى. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا المقايسة كاختبار عالمي في الوقت الحقيقي للكشف عن أنواع مختلفة من فيروس ليسا أو الأنساب من RABV15. في هذا التحرير والسرد RT-PCR النهج، يتم استخدام اثنين من ردود الفعل. الأول يكشف عن النعور الوراثية المختلفة ل RABV، والثاني يكشف عن أنواع فيروس ليسا. تتضمن كلتا الخطوتين فحوصات qRT-PCR ، حيث تستخدم الأولى مسابير التهجين وتستخدم الثانية الأصباغ15. نظرا للعدد الكبير من الاختبارات التي أثبتت نجاح الكشف الجزيئي عن RABV باستخدام هذه التقنية ، يوصي الدليل الأرضي الحالي لمنظمة OIE (2018) باستخدام PCR للكشف الجزيئي عن RABV17.

والمكسيك بلد لديه إمكانات كبيرة في الثروة الحيوانية. وتحتوي الولايات التي لديها أعلى إنتاج من الماشية على كل من المناطق المدارية الرطبة والمناطق الجافة المعرضة لخطر تفشي داء الكلب بسبب وجود خفاش مصاصي الدماء ديسمودوس روتوندوس، وهو المرسل الرئيسي لداء الكلب. لذلك، من الضروري تطوير المزيد من الأدوات للوقاية من داء الكلب الأبقار ومكافحة (BPR) في المكسيك. وبناء على ذلك، كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام qRT-PCR الكمي لتحديد عدد الجسيمات الفيروسية في الهياكل التشريحية المختلفة للأدمغة البقرية بعد الوفاة بسبب عدوى داء الكلب.

تبرع مختبر خارجي بستة أدمغة تم الحصول عليها من الأبقار الإيجابية ل RABV لاستخدامها في تطوير بروتوكول qRT-PCR الموضح أدناه. تم نقل عينات بنية الدماغ البقري إلى مختبر INIFAP CENID-MA BSL-2 وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم الحصول على الأدمغة من الحيوانات من ولايات كامبيتشي، يوكاتان، وكيريتارو. قبل الاستلام، تم تشريح هياكل مختلفة من العقول. وشملت هذه الهياكل القرن الأمون، المخيخ، القشرة، النخاع، المهور، والمهاد18،19. تم استخراج المواد الوراثية كما هو موضح أدناه. تم تأكيد تشخيص RABV باستخدام الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA)20. وكعنصر تحكم إيجابي، تم استخدام أدمغة الفئران التي تم تلقيحها ب RABV21. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت أربعة أدمغة ماشية سلبية من RABV (كما يحددها DFA) كضوابط سلبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة وأجريت وفقا للتوصيات المتعلقة باستخدام الحيوانات التي قدمتها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) التابعة للجنة الوطنية ل Investigación Disciplinaria en Microbiología Animal (CENID-MA).

1. عينات

  1. استخدام مناطق مختلفة من الدماغ تشريح من 6 مختلف العقول البقرية إيجابية داء الكلب لتحليل RT-PCR.

2. الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFAs) لتأكيد داء الكلب

ملاحظة: الكشف عن مستضد داء الكلب من قبل DFA هو طريقة نوعية لتحديد وجود نواة داء الكلب باستخدام الأجسام المضادة المسمى الفلورسين. تم إجراء الاختبار باستخدام البروتوكول المقدم من دين وآخرون (1966)20، كما هو موضح أدناه.

  1. جعل انطباعين من كل الأنسجة تشريحها من هياكل الدماغ المختلفة على شريحة معقمة من قطر 15 ملم تقريبا. استخدام قضيب خشبي لتشويه ما يقرب من 3 ملم3 جزء من الأنسجة على الشريحة العقيمة. لإنشاء اللطاخة، اضغط برفق على قضيب خشبي ضد الشريحة يدويا.
  2. إصلاح الشرائح مسحة عينة عن طريق submersing الشرائح في الأسيتون 100٪ لمدة 1 ساعة في -20 درجة مئوية. بعد الحضانة، قم بتجفيف الشرائح على قطعة قماش جافة عند 21 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة للنيوكليوبروتين المسماة بالفلورسين إلى كل مسحة دماغية في تخفيف 1:10 عن طريق الاستغناء عن طريق حقنة.
  4. احتضان الشرائح مع اقتران في غرفة رطبة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. بعد الحضانة، اغسل الشرائح مرتين بالماء ومع برنامج تلفزيوني للقضاء على التوازم الزائد. السماح للشرائح لتجف عند 21 درجة مئوية. لطخة بعناية لإزالة السائل الزائد ومن ثم لفترة وجيزة الهواء الجاف قبل تصاعد.
  6. إضافة قطرة من 50٪ الجلسرين الفوسفات لتغطية سطح القسم، ومن ثم تغطية مع coverslip. مراقبة المقاطع تحت المجهر epifluorescence في التكبير 40x.
    1. معالجة ومراقبة الضوابط الإيجابية والسلبية (التحكم الإيجابي: أدمغة الفئران الملقحة مع RABV؛ الضوابط السلبية: RABV-العقول البقرية السلبية) بنفس الطريقة التي العينات.

3. توليد السيطرة الإيجابية لRT-PCR

  1. الحصول على خلايا BHK-21 من بنك الجرثومة. استخدام الخلايا تصل إلى مرور70 لتكرار RABV إيفلين روكتينيكي-أبيلسيث (ERA) سلالة باستخدام الممر 2.
  2. الحفاظ على الخلايا BHK-21 ونشرها في زجاجات تحتوي على الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) تكملها 10٪ مصل العجل الجنيني (FCS) في 37 درجة مئوية في وجود CO2 (5٪) وفي ظل ظروف رطبة. تنمو الخلايا في 25 سم2 قوارير الثقافة حتى تصل إلى التقاء 80٪ ومن ثم الثقافة الفرعية.
  3. إزالة وسيط الثقافة من الخلايا وغسل زجاجة مع الفوسفات المالحة المخزنة مؤقتا (PBS). تلقيح الثقافة مع 105 TCID / مل من RABV سلالة ERA. احتضان الإينوكوم الفيروسي لمدة 2 ساعة تحت الاهتزاز المستمر عند 37 درجة مئوية في وجود ثاني أكسيد الكربون(5٪) وفي ظل ظروف رطبة.
  4. إزالة المتوسطة العدوى وإضافة MEM تكملها مع 5٪ (مصل الجنين البقري) SFB. حضانة لمدة 72 ساعة في 37 درجة مئوية في وجود ثاني أكسيد الكربون(5٪) في الظروف الرطبة.
  5. حصاد RABV 3 أيام بعد التطعيم عندما تظهر الخلايا آثار cytopathic. تجميد الخلايا المصابة ومن ثم إذابة لهم في 4 درجة مئوية لlyse الخلايا. جمع المتوسطة من زجاجة، ومن ثم وضع الخلايا في أنبوب الطرد المركزي للطرد المركزي في 1050 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  6. تخزين المضادات من RABV في -80 درجة مئوية، وإعداد aliquots العمل للتخزين في -70 درجة مئوية.
  7. تلقيح intracerebrally الفيروس التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة إلى الفئران CD1 الإناث 21 يوما من العمر. استخدام حقنة 1 مل لتطعيم 50 ميكرولتر من الحلول التي تحتوي على 106 MICLD50 (الماوس المعدية ثقافة جرعة قاتلة 50٪) جرعات في الفئران22.

4. استخراج الحمض النووي الريبي

ملاحظة: تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي مباشرة من الأدمغة البقرية باستخدام طريقة استخراج عضوية وفقا للبروتوكول التالي.

  1. استخدام 100 ملغ من أنسجة المخ من كل بنية تشريحية لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام كاشف المتاحة تجاريا تحتوي على ايزوثيوسيانات جوانيديوم.
  2. تجانس يدويا ما مجموعه 100 ملغ من الأنسجة من كل هيكل في 1 مل من كاشف ايزوثيوسيانات guanidium عن طريق الدوامة باستخدام المتجانس Dounce مع حشرات صغيرة داخل microtube لمدة 15 ق في أقصى سرعة.
  3. احتضان العينات على الجليد لمدة 5 دقائق، ومن ثم إضافة 200 ميكرولتر من الكلوروفورم. امزج العينات بقوة لمدة 15 s، واحتضنها على الجليد لمدة 2 إلى 3 دقائق، ثم طارد مركزي عند 12000 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب نظيف وإضافة 500 ميكرولتر من الكحول isopropyl. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة عند 21 درجة مئوية.
  5. طرد مركزي العينات في 12000 س غ لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية. يستنشق العملاق المائي عن طريق الأنابيب. الجيش الملكي النيبالي المعزول سيكون حاضرا كبيليه في الأنبوب.
  6. بعد ذلك، اغسل بيليه الحمض النووي الريبي مع 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ عن طريق الأنابيب، والطرد المركزي عند 7500 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية.
  7. decant العملاقة والهواء الجاف بيليه الحمض النووي الريبي في درجة حرارة الغرفة (21 درجة مئوية). بعد ذلك، تمييع بيليه في 50 ميكرولتر من المياه الخالية من النيوكليز.
  8. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي وجودته في 260 نانومتر باستخدام مطياف. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  9. إزالة الحمض النووي من عينات الحمض النووي الريبي عن طريق الهضم مع DNase I. إضافة 2 U من DNase I لكل 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المستخرجة في الخطوة السابقة. بعد ذلك، أضف 5 ميكرولتر من حاجز التفاعل 10x ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تعطيل DNase I بإضافة 1 ميكرولتر من EDTA إلى الخليط يليه الحضانة لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية.

5. توليف cDNA وPCR

  1. توليف cDNA حبلا الأولى باستخدام oligo dT وعكس transcriptase. لكل 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي، إضافة 1 ميكرولتر من Oligo DT (500 ميكروغرام / مل)، 1 ميكرولتر من مزيج DNTP 10 mM، والمياه المقطرة الخالية من النيوكليز إلى حجم نهائي قدره 12 ميكرولتر. احتضان الخليط في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. يبرد خليط التفاعل إلى 4 درجة مئوية. الطرد المركزي أنبوب لمدة 30 ثانية في 1050 س غ، ثم إضافة 4 ميكرولتر من العازلة رد الفعل ، 2 ميكرولتر 0.1 M DTT ، و 1 ميكرولتر من مثبط ريبونوكليز (40 U / μL).
  3. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم إضافة 1 ميكرولتر من النسخ العكسي (200 U). بعد ذلك، احتضان خليط التفاعل لمدة 50 دقيقة في 37 درجة مئوية، ومن ثم تعطيل رد الفعل في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. تخزين cDNA في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    ملاحظة: للتحقق من جودة cDNA المركبة، قم بإجراء تضخيم جزء 761 bp من جين RABV N قبل إجراء التركيب في المختبر. استخدم البروتوكول الذي وصفه لوزا روبيو وآخرون11 كما هو موضح في الخطوة 5.5 أدناه.
  5. إجراء PCR باستخدام Taq DNA بوليمرات في ظل الظروف التالية. تنفيذ رد الفعل إعداد على النحو التالي: 10x Taq العازلة التي تحتوي على 20 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1 يو تاك بوليمراز، 10 ميكرومتر من كل التمهيدي (SuEli +: 5′ cgtrgaycaatatgagtaca 3′ وسويلي-: 5′ caggctcraacatttctta 3′), 2.5 ميكرولتر من cDNA, والمياه فائقة الشراء إلى حجم نهائي من 50 ميكرولتر.
  6. أداء التضخيم في thermocycler باستخدام ظروف ركوب الدراجات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق; 35 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. دورة واحدة من 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  7. تقييم وجود منتجات PCR 761 bp باستخدام هلام الآغاروز 1٪.

6. في النسخ في المختبر

ملاحظة: في المختبر النسخ يولد مرنا من الجين المستهدف. استخدم زوج التمهيدي الذي يضخم الجين RABV N كاملة واحد يستخدم كتحكم إيجابي في المقايسة QRT-PCR. تم تصميم هذه التمهيديات لتضخيم الجين الكامل RABV N وإضافة المروج الذي يتعرف على البوليمر T7 (TAATACGACTCACTATAG).

  1. لتضخيم الجين N RABV بأكمله، استخدم المبرزات عبر Nrab إلى الأمام (5'gatgagtcactcgaatatgtctt 3') وعكس (5'caataatacactcactatagggatggatggatggaagagatagtt 3') ومجموعة PCR عالية الدقة.
    1. لكل رد فعل، وإعداد مزيج PCR الرئيسية بإضافة إلى تفاعل أنبوب PCR نظيفة العازلة 10x، 2 mM DMSO, 25 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 ميكرومتر من كل التمهيدي, 0.5 U من البوليمرات عالية الدقة, 1.5 ميكرولتر من cDNA (أعدت في الخطوة 5), والمياه فائقة النقاء إلى حجم نهائي من 50 ميكرولتر.
    2. استخدام مجموعة ثيرموسيكلر للشروط التالية للتضخيم: 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة؛ 4 دورات من 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 40 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ التمديد النهائي ل 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  2. لاستخدام منتج PCR كقالب لتركيب المختبر وإزالة مكونات التفاعل الأنزيمي من الخطوة 6.1.2 ، قم بتنقية منتج PCR باستخدام مجموعة مكثفة تستند إلى العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ثم قم بتحديدها باستخدام مطياف.
  3. لتخليق الحمض النووي الريبي، استخدم عدة نسخ في المختبر مع خليط التفاعل التالي: 5 ميكرولتر T7 النسخ العازلة 5x، 1.9 ميكرولتر من كل نيوكليوتيد ثلاثي الفوسفات، 10 ميكروغرام من الحمض النووي RABV N DNA VP2 المنقى، و 2.5 ميكرولتر من خليط الإنزيم. بعد ذلك، احتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة. ثم، إضافة 1 ميكرولتر من 1 U/μg RNase خالية من DNase إلى خليط التفاعل واحتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية للقضاء على تلوث الحمض النووي.
  4. تنقية الحمض النووي الريبي في المختبر منقول ومن ثم التركيز عليه باستخدام الفينول: الكلوروفورم: الكحول isoamyl (25:24:1).
  5. إعادة إنفاق بيليه الحمض النووي الريبي المنقى إلى 70 ميكرولتر من العازلة TE، ومن ثم تخزين في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  6. كرر بروتوكول PCR من الخطوة 6.1 حتى يتم الحصول على ما يقرب من 5 ميكروغرام من منتج PCR. بعد تنقية وتركيز, في المختبر منقول N الجينات مرنا سيكون حاضرا في تركيز 4.711 ميكروغرام / ميكرولتر.
  7. تأكد من أن الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر يتوافق مع جين N بعد الخطوة 5 من هذا البروتوكول واستخدم هذا كتحكم إيجابي في تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR).

7. النسخ العكسي في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (qRT-PCR)

  1. بالنسبة ل qRT-PCR، استخدم نسخة mRNA في المختبر لترميز الجين N الكامل كتحكم إيجابي إلى جانب مجموعة qRT-PCR تجارية من خطوة واحدة باستخدام مسابير التهجين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام المسبار والمبرمجين وصفها Carneiro وآخرون (2010)23 للكشف عن منطقة حفظها من الجين RABV N (BRDesrot-Rev: 5′ aaactcaagagaaggccaacca 3′, BRDesrot-Fwd: 5′ cgtactgatgtgggaggaattg 3′, وBRDesrot-التحقيق: 5′-FAM-acaagggctactgttagagcatgc-3′-BHQ).
  2. استخدم ظروف ركوب الدراجات الحرارية التالية: دورة واحدة من 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 s و 50 °C لمدة 30 s.

8. منحنى المعايرة أو منحنى قياسي

  1. تنفيذ التخفيفات التسلسلية من الحمض النووي الريبي في المختبر المنسوخة عن طريق الأنابيب تسلسليا 1 ميكروغرام / ميكرولتر من مرنا في أنابيب حتى يتم الحصول على ستة تخفيفات ديكوبل. إعداد أنابيب في حجم 100 ميكرولتر في ثلاثة نسخ لاستخدامها في خلق منحنى القياسية. قم بإجراء qRT-PCR كما هو موضح في الخطوة 7.
  2. قم بإجراء qRT-PCR في دراجة حرارية مع دوار من خلال معالجة عينات الدماغ المختلفة في وقت واحد مع ردود الفعل الجارية لإنشاء المنحنى القياسي واستخدام عناصر التحكم الإيجابية والضوابط السلبية والطوابير المعزولة عن ثقافة الخلية.
  3. لتقييم حد الكشف وفعالية الاختبار وحساسية الاختبار، استخدم منحنى قياسي في ثلاثية الظروف.

9. qRT-PCR من العينات البيولوجية

  1. للكشف عن الجين RABV N، استخدم الحمض النووي الريبي من عينات الحقل، والضوابط الإيجابية، والضوابط السلبية، والمواد الخارقة ثقافة الخلية لأداء qRT-PCR باستخدام عدة PCR الموصوفة في الخطوة 7.
  2. لتحديد عدد نسخ جينوم RABV الموجود في عينات الدماغ البقري، احصل على بيانات Ct من المنحنى القياسي والعينات البيولوجية ومن تلك المستأنسة من معادلة منحنى المعايرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأظهرت نتائج DFA 100٪، 100٪، 83.3٪، 66٪، و 50٪ الإيجابية لرابف في القشرة والمهاد والميدالية والمهور والقرن، على التوالي. وأكدت هذه النتائج النتائج السابقة، وكانت ثلاثة على الأقل من الهياكل التي تم تشريحها من كل دماغ إيجابية ل RABV. يظهر ممثل إيجابي DAF تلطيخ في الشكل 1.

ويبين الشكل 2 تضخيم جزء من الجين RABV N (الخطوة 5.5) مع البادئات الأولىالتي ذكرتها لوزا روبيو وآخرون. وقد أظهر ذلك أن المواد التي تم الحصول علي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد أظهرت الدراسات السابقة أن DFA يمكن الكشف عن RABV فقط في غضون سبعة أيام من العينة التي يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة (21 درجة مئوية)14. وعلى النقيض من ذلك، أظهر هذا العمل أن حساسية RT-PCR تبدأ في الانخفاض بعد تعرض العينات لدرجة حرارة الغرفة لمدة 12 يوما. لذلك، يمكن الكشف عن جينوم RABV عن طريق qRT-PCR في العينات المعرضة لدرجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 23 يوما. وهذا يدل على أن حساسية qRT-PCR أعلى نسبيا للعينات أكثر تحللا. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الضروري تطوير أساليب أبسط التي لا تمس

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للبحوث الزراعية والحرجية والحيوانية. نشكر جيرزاين فراوسترو إسكيفل على تعاونه في تطوير الفيديو المرتبط بهذه الوثيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكلوروفورمSIGMAC7559يسهل استعادة المرحلة المائية من تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تم تغطيتها بالزيوت المعدنية.
الحمض النووي نظيف & المكثف -500ZimoD4031الحمض النووي نظيف & تم تصميم المكثف -500 (DCC-500) لتنقية سريعة وكبيرة الحجم وتركيز يصل إلى 500 وميكرو. ز من الحمض النووي عالي الجودة من العينات بما في ذلك هضم نوكلياز داخلي تقييد واسع النطاق ومستحضرات الحمض النووي غير النقية.
الإيثانولأمريسكو193-500تنقية الأحماض النووية
مجموعة نظام PCR عالية الدقة FastStart ، dNTPackRoche3553400001إنزيم عالي الدقة لتضخيم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لتجنب التغييرات الأساسية العشوائية
GelDoc XRBioRadXR +يحلل البروتين الأكبر حجما والمواد الهلامية للحمض
النووي GelRedBiotium41003جيل جديد من بقع هلام الحمض النووي ، تمتلك ميزات كيميائية جديدة مصممة لتقليل فرصة تفاعل الأصباغ مع الأحماض النووية في الخلايا الحية.
iCycler Thermal Cycler GradientBioRad582BRيمكن مراقبة درجة الحرارة والتحكم فيها عن طريق خوارزمية الأدوات أو المسبار داخل العينة أو أوضاع كتلة
iTaq Universal Probes One-StepBioRad1725141خليط التفاعل لتنفيذ تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي باستخدام مجسات التهجين من نوع TaqMan
كحول الأيزوبروبيلAmresco0918-500ترسيب الأحماض النووية
تحتوي مجموعة استخراج الجل QIAquickQiagen28706QIAquick على مجموعة غشاء السيليكا لربط الحمض النووي في عازلة عالية الملح والشطف باستخدام محلول منخفض الملح أو ماء. يزيل إجراء التنقية البادئات والنيوكليوتيدات والإنزيمات والزيوت المعدنية والأملاح والأغاروز وبروميد الإيثيديوم والشوائب الأخرى من عينات الحمض النووي
M-MLV Reverse TranscriptaseInvitrogen28025-021يستخدم Moloney Murine Cancer Cancer Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RT) الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أحادي الشريطة في وجود برايمر لتصنيع خيط DNA تكميلي
.
NanoDrop 2000Thermo-ScientificND2000الطيف الضوئي ذو الحجم
الصغير Oligo (dT) 18 التمهيديInvitrogenSO132التمهيدي oligo (dT) 18 عبارة عن قليل النوكليوتيد الاصطناعي أحادي الشريطة 18 mer مع نهايات 5 'و 3'-hydroxyl.
مجموعة أنظمة إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاق واسع RiboMAX SP6 و T7PromegaP1300تفاعلات النسخ في المختبر لتجميع كميات ميكروغرام من مجسات الحمض النووي الريبي من قوالب الحمض النووي المؤتلف. تم تحسين معظم تفاعلات النسخ المصممة لتوليد مجسات الحمض النووي الريبي لتعظيم دمج الريبونوكليوتيدات ذات العلامات المشعة بدلا من إنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي
Taq DNA PolymeraseInvitrogen#EP0402Taq DNA Polymerase هو بوليميراز DNA عالي الثبات للحرارة من البكتيريا المحبة للحرارة Thermus aquaticus. يحفز الإنزيم 5 ' و 3 ' تخليق الحمض النووي
  ؛
كاشف TRIzolInvitrogen15596026كاشف TRIzol هو كاشف كامل وجاهز للاستخدام ، مصمم لعزل الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة أو العزل المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات من مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية.
العينة مقياس تستخدم

المراجع

  1. Subramaniam, M. R., Madhusudana, S. Laboratory diagnosis of human rabies: recent advances. ScientificWorld Journal. 2013 (569712), 1-10 (2013).
  2. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/diagnosis/animals-humans.html (2019).
  3. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  4. Prabhu, K. N., et al. Application and comparative evaluation of fluorescent antibody, immunohistochemistry, and reverse transcription polymerase chain reaction tests for the detection of rabies virus antigen or nucleic acid in brain samples of animals suspected of rabies in India. Veterinary Science. 5 (1), 24(2018).
  5. Woldehiwet, Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 49-63 (2005).
  6. Singh, R., et al. Rabies - epidemiology, pathogenesis, public health concerns and advances in diagnosis and control: a comprehensive review. Veterinary Quarterly. 37 (1), 212-251 (2017).
  7. David, D. Role of the RT-PCR method in ante-mortem & post-mortem rabies diagnosis. Indian Journal of Medical Research. 135 (6), 809-811 (2012).
  8. Biswal, M., Ratho, R. K., Mishra, B. Role of reverse transcriptase polymerase chain reaction for the diagnosis of human rabies. Indian Journal of Medical Research. 135, 837-842 (2012).
  9. Wacharapluesadee, S., et al. Comparative detection of rabies RNA by NASBA, real-time PCR and conventional PCR. Journal of Virological Methods. 175 (2), 278-282 (2011).
  10. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for ante mortem and post-mortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
  11. Loza-Rubio, E., Rojas-Anaya, E., Banda-Ruiz, V. M., Nadin-Davis, S. A., Cortez-Garcia, B. Detection of multiple strains of rabies virus RNA using primers designed to target Mexican vampire bat variants. Epidemiology and Infection. 133 (5), 927-934 (2005).
  12. Dedkov, V. G., et al. Development and evaluation of a RT-qPCR assay for fast and sensitive rabies diagnosis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 90, 18-25 (2018).
  13. Boldbaatar, B., et al. Rapid detection of rabies virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Japanese Journal Infectious Diseases. 62, 187-191 (2009).
  14. Rojas Anaya, E., Loza Rubio, E., Banda Ruiz, V., Hernández-Baumgarten, E. Use of reverse transcription-polymerase chain reaction to determine the stability of rabies virus genome in brains kept at room temperature. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 18 (1), 98-101 (2006).
  15. Dacheux, L. Dual combined Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction assay for the diagnosis of Lyssavirus infection. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 004812(2016).
  16. Tamay De Dios, L., Ibarra, C., Velasquillo, C. Fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigigación en Discapacidad. 2 (2), 70-78 (2013).
  17. Chapter 2.1.17. Rabies (infection with rabies virus and other Lyssaviruses. OIE. , Available from: https://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.p (2018).
  18. Wacharapluesadee, S., Hemchudha, T. Ante-and post-mortem diagnosis of rabies using nucleic acid-amplification tests. Expert Reviews of Molecular Diagnostics. 10 (2), 207-218 (2010).
  19. Protocol for Postmortem Diagnosis of Rabies in Animals by Direct Fluorescent Antibody Testing. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf (2017).
  20. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, W. The fluorescent antibody technique in rabies. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. , WHO. Switzerland. (1996).
  21. Cuevas-Romero, S., Colmenares, V. G., Batalla, C. D., Hernández, B. E. Selección de un virus rábico de origen vampiro para utilizarse como cepa de desafío en bovino. Veterinaria México. 20, 271-275 (1989).
  22. Mendez-Ojeda, M. L., et al. Detection of rabies virus in organs unrelated to the central nervous system of experimentally inoculated vampire bats. Revista Méxicana de Ciencias Pecuarias. 9 (3), 435-450 (2018).
  23. Carneiro, A. J., et al. Rabies virus RNA in naturally infected vampire bats, Northeastern Brazil. Emerging Infectious Diseases. 16, 2004-2006 (2010).
  24. Andrew, S. Calculator for determining the number of copies of a template. URI Genomics & Sequencing. , Available from: http://cels.uri.edu/gsc/cdna.html (2020).
  25. Beltran, F. J., Dohmen, F. G., Del Pietro, H., Cisterna, D. M. Diagnosis and molecular typing of rabies virus in samples stored in inadequate conditions. The Journal of Infection in Developing Countries. 13 (8), 1016-1021 (2018).
  26. Finke, S., Cox, J. H. Differential transcription attenuation of rabies virus genes by intergenic regions: generation of recombinant viruses overexpressing the polymerase gene. Journal of Virology. 74 (16), 7261-7269 (2000).
  27. Fooks, A. R., et al. Rabies. 3, Macmillan Publishing Limited. 1-18 (2017).
  28. Bingham, J., Van Der, M. M. Distribution of rabies antigen in infected brain material: determining the reliability of different regions of the brain for the rabies fluorescent antibody test. Journal Virological Methods. 101 (1-2), 85-94 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

qRT PCR RNA
كمية فيروس داء الكلب في مختلف هياكل الدماغ البقري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.