مقالة منهجية

تقييم المشاركة المستهدفة الخلوية من قبل SHP2 (PTPN11) مثبطات Phosphatase

5.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61457

⸱

يوليو 17, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Metabolism & Signaling Networks Program, NCI-Designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute

في هذه المقالة

ملخص

إن القدرة على تقييم المشاركة المستهدفة من قبل مثبطات المرشح في الخلايا السليمة أمر بالغ الأهمية لاكتشاف المخدرات. يصف هذا البروتوكول 384 شكل جيد فحص التحول الحراري الخلوي الذي يكشف بشكل موثوق الاشتباك الهدف الخلوي من مثبطات تستهدف إما البرية من نوع SHP2 أو المتغيرات oncogenic لها.

الملخص

وSrc-homology 2 (SH2) المجال التي تحتوي على phosphatase 2 (SHP2), المشفرة من قبل PTPN11 بروتو-oncogene, هو وسيط رئيسي لمستقبلات التيروزين كيناز (RTK) يحركها خلية الإشارات, تعزيز بقاء الخلايا والانتشار. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تجنيد SHP2 من قبل مستقبلات نقطة الاختيار المناعية لمنع تنشيط الخلية B و T. وقد تورطت وظيفة SHP2 الشاذ في التنمية, التقدم, و الانبثاث من العديد من أنواع السرطان. في الواقع ، دخلت مثبطات SHP2 جزيء صغير مؤخرا التجارب السريرية لعلاج الأورام الصلبة مع تنشيط مسار راس / راف / ERK ، بما في ذلك الأورام مع بعض الطفرات رأس oncogenic. ومع ذلك، فإن الفئة الحالية من مثبطات SHP2 ليست فعالة ضد المتغيرات على اللوكوجينية SHP2 التي تحدث بشكل متكرر في اللوكيميا، وتطوير جزيئات صغيرة محددة تستهدف SHP2 oncogenic هو موضوع البحوث الحالية. وهناك مشكلة شائعة مع معظم حملات اكتشاف المخدرات التي تنطوي على البروتينات الخلوية مثل SHP2 هو أن المقايسات الأولية التي تدفع اكتشاف الكيميائية وغالبا ما تكون في المختبرات التي لا الإبلاغ عن الاشتباك الهدف الخلوي من المركبات المرشحة. لتوفير منصة لقياس الاشتباك الهدف الخلوية، قمنا بتطوير كل من نوع البرية ومتحول SHP2 المقايسات التحول الحراري الخلوي. هذه المقايسات تكشف بشكل موثوق الاشتباك الهدف من مثبطات SHP2 في الخلايا. هنا، ونحن نقدم بروتوكول شامل من هذا الفحص، الذي يوفر أداة قيمة لتقييم وتوصيف مثبطات SHP2.

المقدمة

التيروزين الفسفر يلعب دورا هاما في نقل إشارة في الخلايا1،2. هذا التعديل ما بعد الترجمة هو تحفيزه من قبل كينازات التيروزين البروتين (PTKs) وعكسها من قبل فوسفاتاتات التيروزين البروتين (PTPs). لذلك ، فإن وظيفة PTK أو PTP الشاذة تؤدي إلى العديد من الأمراض البشرية الموروثة أو المكتسبة3و4و5و6. وSrc-homology 2 (SH2) المجال التي تحتوي على phosphatase 2 (SHP2) هو نوع غير مستقبلات أعرب عنها على نطاق واسع PTP PTP من قبل بروتو أونكوجين PTPN117 وهو المنظم الرئيسي للعديد من العمليات الفسيولوجية التي تنطوي على نقل إشارة عن طريق تفعيل راس / راف / ERK ، PI3K / AKT ، أو JAK / STAT إشارات المسارات8. عادة، يتم تنظيم نشاط SHP2 بإحكام من أجل منع الإشارات المنحرفة. تحت الظروف القاعدية SHP2 هو autoinhied من قبل المجال N- المحطة الطرفية SH2، الذي يمنع الوصول إلى الموقع النشط ضمن المجال الفوسفاتيز الحفاز (الشكل 1A)9،10. عند تنشيط الخلية، تقوم بروتينات الربط الفوسفورية التيروزين بتجنيد SHP2، مما يؤدي إلى اعتماد تركيبها النشط، حيث يمكن الوصول إلى الموقع النشط الآن إلى ركائزه. في العديد من أنواع السرطان SHP2 النشاط مرتفع. وقد تم تحديد الطفرات الجسدية كسب من وظيفة (GOF) في PTPN11 أساسا في اللوكيميا ومنع ربط المجال N-SH2 إلى المجال فوسفاتاتيز، مما أدى إلى SHP2 نشط بشكل تأسيسي (الشكل 1B)11. الطفرات GERMLINE GOF في PTPN11 هي المسؤولة عن ~ 50٪ من حالات متلازمة نونان, اضطراب النمو مع زيادة خطر الإصابة بالخطورة12. في الأورام الصلبة، حيث الطفرات PTPN11 نادرة، مستويات أكبر من البروتينات ملزمة الفوسفورية تؤدي إلى تعزيز نشاط SHP2(الشكل 1C). SHP2 مهم أيضا للإشارة نقطة تفتيش المناعة، كما مستقبلات نقطة تفتيش مثل BTLA أو PD-1 تجنيد SHP2 لجزيئات الإشارات الرئيسية ديفوسفوريلا، ومنع تنشيط الخلايا المناعية13،14،15.

وقد كان استهداف PTPs مع جزيئات صغيرة تحديا، وذلك لأن الموقع النشط من PTPs هو الحفاظ على درجة عالية من مشحونة؛ مثبطات التي تستهدف الموقع النشط غالبا ما تكون قوية، ولكن تظهر الانتقائية الفقراء والتوافر البيولوجي عن طريق الفم16،17،18،19،20،21،22. في الواقع، العديد من المثبطات SHP2 ذكرت تعاني من ضعف الانتقائية وعدم الفعالية في الخلايا23. في الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن مثبطات اللويسترية من SHP2 مع قوة جيدة وانتقائية ممتازة (على سبيل المثال، SHP09924 و RMC-455025) وأثارت اهتماما متجددا في مثبطات SHP2. المركبات على أساس SHP099 و RMC-4550 حاليا في المرحلة الأولى التجارب السريرية لعلاج الأورام الصلبة مع مستقبلات كيناز التيروزين (RTK) تفعيل المسار26,27. في حين وضع حجر الأساس، هذه المركبات غير فعالة ضد العديد من المسوخ SHP2 oncogenic التي تدفع تولد الكرية في عدد كبير من مرضى سرطان الدم28،29،30. هذا النقص في قوة المركبات الشبيهة بـ SHP099 نحو المتغيرات SHP2 oncogenic ينبع من آلية التليسية الفريدة ، لأنها تمنع نشاط SHP2 عن طريق الربط وتثبيت التشكل غير النشط والمغلق ، والذي يتم تعطيله في المسوخ SHP2. علاوة على ذلك, استنادا إلى تقرير31مؤخرا , آليات المقاومة التكيفية في المرضى الذين عولجوا مع مثبطات مثل SHP099 يمكن تصورها تماما. وبالتالي، فإن تطوير الجيل القادم من مثبطات SHP2 التي تستهدف حالته النشطة والمفتوحة هو موضوع بحث مكثف.

توصيف مثبطات SHP2 رواية في الخلايا هو جانب أساسي من عملية تحسين الرصاص. بشكل حاسم، ثبت المشاركة المستهدفة من المانع في ظل الظروف الفسيولوجية يوفر مستوى إضافي من الثقة التي يتم نشرها بكفاءة الموارد للكيمياء الطبية على المركبات مع الكفاءة الخلوية الواعدة. في الماضي، تم تطوير عدة طرق لتقييم ربط مثبطات الجزيئات الصغيرة لأهدافها، في المقام الأول بالنسبة للبروتينكيناز 32. لتطوير SHP2 الخلية الهدف الاشتباك المقايسة، استخدمنا الخلوية التحول الحراريالمقايسة 33. هذا الفحص، على غرار التحول الحراري في المختبر (PTS) للبروتينات34، يراقب الاستقرار الحراري البروتيني المستهدف ، والذي عادة ما يتم تغييره من خلال ربط الجزيئات الصغيرة. المقايسة الأصلية هي تحليل منخفض الإنتاجية يستخدم الأجسام المضادة لتحديد مستويات البروتين المستهدفة. بدلا من ذلك، اخترنا البديل ذكرت مؤخرا من تحليل التحول الحراري الذي يستخدم β-galactosidase إنزيم تكملة جزء (EFC) مقايسة(الشكل 2)35. لهذه التجارب، يتم التعبير عن البروتين من الفائدة في الخلايا كبروتين الانصهار N- أو C-المحطة الطرفية تحمل علامة ProLabel المحسنة (ePL، وهو جزء من الأحماض الأمينية 42 من β-galactosidase). ثم يتم نقل الخلايا إلى 384 جيدا لوحات متوافقة PCR ومحتضنة مع المركبات ذات الفائدة. ويستخدم الدراجات الحرارية لتطبيق تدرج درجة الحرارة على الخلايا، التي البروتينات سوف التكهد والتجميع كما يزيد درجة الحرارة على أساس استقرارها الحراري. إن قدرة المركب المرشح على ربط البروتين الذي يهمه وتثبيته سيؤدي إلى زيادة الاستقرار الحراري لهذا البروتين. لذلك ، بعد تحلل الخلايا ، ستظل البروتينات الموسومة التي استقرت من قبل مركب مرشح في الحل في درجات حرارة أعلى من بروتينات الخلايا الموسومة من الخلايا المحتضنة مع التحكم في السيارة. مراسل إنزيم acceptor (EA) قادر على استكمال البروتينات ذات العلامات ePL القابلة للذوبان ، مما يؤدي إلى نشاط β -galactosidase قابل للكشف باستخدام ركيزة الإنارة.

لقد طورنا مؤخرًا مقايسة حرارية خلوية قوية لـ SHP2 من النوع البري (SHP2-WT) ومتغير SHP2 oncogenic المتكرر (SHP2-E76K) فيتنسيق384-well مصغر. هنا، نحن الإبلاغ عن بروتوكول مفصل من هذا الفحص، الذي يكشف بشكل موثوق الاشتباك المستهدف من قبل مثبطات SHP2 في الخلايا ويظهر درجة عالية من الارتباط بين قوة المانع وبيانات التحول الحراري الخلوي. ويتضح سير العمل في الحسبة العامة في الشكل 3. تستخدم منصتنا بروتينات الاندماج ePL-SHP2 ذات الطول الكامل EPL-SHP2. للحصول على توليد pICP-ePL-N-SHP2-WT وpICP-ePL-N-SHP2-E76K التعبير، يرجى الرجوع إلى نشرنا الأخيرة36. ويمكن إجراء هذا الفحص باستخدام التدرج الحراري لإنشاء SHP2 الملامح الحرارية وتحديد SHP2 ذوبان درجات الحرارة في وجود أو عدم وجود المانع. وبمجرد تحديد الملامح الحرارية، يمكن أيضاً تنفيذها في ظل ظروف متساوية، مما يسمح بتقييم استجابة الجرعة المانعة. ويرد أدناه وصف لكلا النوعين من التجارب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1- إعداد ثقافة الخلايا والكواشف

  1. صياغة زجاجة 500 مل من وسائل الإعلام النمو مع 10٪ مصل الأبقار الجنين، 1x مضاد حيوي / مضاد للحساسية، 20 مل HEPES، و 1 mM بيروفات الصوديوم. يُخزن عند 4 درجة مئوية.
  2. ذوبان الكواشف الحرارية الخلوية التحول (EA الكاشف، العازلة تحلل، والركيزة) من زجاجات المخزون الأصلي المجمدة.
  3. الاستغناء الكواشف والمخزن المؤقت كما aliquots مل 2 وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: تجنب التجميد/الذوبان لقابلية التكاثر واستخدام هذا الحجم فقط من الكاشف المطلوب لإجراء الفحص.

2. نمو وصيانة خلايا HEK293T

  1. الحصول على انخفاض ممر تنتق خلايا HEK293T من تخزين التبريد.
  2. الحفاظ على خلايا HEK293T في وسائل الإعلام النمو في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  3. تقسيم الخلايا كل 4 أيام في نسبة 1:14.
    ملاحظة: للحصول على أفضل أداء، خلايا HEK293T غير مسموح بتمرير أكبر من 25 مرة.

3. HEK293T إعداد الخلية لtransfet عابرة

  1. فصل خلايا HEK293T من لوحات 16 مل باستخدام 3 مل من كاشف مفرزة الخلية.
  2. تمييع مع 12 مل من وسائل الإعلام النمو. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1400 س ز لمدة 4 دقائق.
  3. إعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام نمو 10 مل. قياس تركيز وديموجة الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وعداد الخلية.
  4. لوحة 7.0 × 105 تنمو بشكل كبير خلايا HEK293T في بئر في 6 جيدا خلية لوحة ثقافة 24 ساعة قبل transfection.
    ملاحظة: حجز بئر واحد لكل بلازميد أن تكون مصابة.
  5. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.

4. Transfection من خلايا HEK293T

  1. من مخزون بلازميد المنقى من pICP-ePL-N-SHP2-WT أو pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~ 200 نانوغرام/ميكرولتر) تمييع 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 200 ميكرولتر من العازلة عبر.
  2. دوامة لمدة 10 s والطرد المركزي في 1400 × ز لمدة 4 دقائق.
  3. أضف 4 ميكرولتر من كاشف الملوثات عبر الشبكي إلى الحمض النووي المخفف. دوامة لمدة 10 s والطرد المركزي في 1400 × ز لمدة 4 دقائق.
  4. احتضان في 23 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  5. إزالة 6 جيدا لوحة تحتوي على خلايا HEK293T المتنامية من الحاضنة. أضف مزيج transfection إلى الخلايا المرفقة في لوحة 6-جيدا. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.

5. إعداد لوحات فحص

  1. إعداد 10 mM حلول المخزون في DMSO من المركبات ليتم اختبارها.
  2. الاستغناء عن حلول مثبطات في 384-جيدا انخفاض حجم اللوحة المصدر الميت للاستخدام الفوري.
  3. بقعة الحجم المطلوب من مثبطات أو مركبة (DMSO) باستخدام معالج السائل في 384 جيدا في الوقت الحقيقي لوحات PCR في حجم النهائي المستهدف من أقل من 0.5٪ DMSO (V / الخامس). ختم لوحة باستخدام ختم لوحة مع تطهير الغاز الخامل.
    ملاحظة: بالنسبة لمقايسات استجابة الجرعة المانعة، تأكد من ردم DMSO وفقًا لذلك بحيث يتم استخدام كميات متساوية من DMSO لكل تركيز مثبط. للحصول على أفضل النتائج، لوحات تخزين في 23 درجة مئوية واستخدام لوحات داخل 24 ساعة.

6- انفصال الخلايا المُصابة بالعدوى وإعدادها

  1. Preincubate نمو وسائل الإعلام وخلية مفرزة في حمام الماء 37 °C. إزالة الخلايا المُصابة بالعدوى من الحاضنة. تُشعّر الوسائط بلطف من آبار اللوحة.
    ملاحظة: استخدام التعرق جديدة لكل بئر يحتوي على بلازميد مختلف عبر العدوى.
  2. إضافة 0.3 مل من كاشف مفرزة الخلية. صخرة بلطف لوحة ذهابا وإيابا لتغطية سطح لوحة أسفل بدقة. احتضان في 23 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  3. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام النمو إلى كل بئر. بلطف ماص وسائل الإعلام والخلايا في البئر ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي فالكون 15 مل. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 1400 س ز لمدة 4 دقائق.
  4. بلطف ولكن بدقة الطامح قبالة وسائل الإعلام.
    ملاحظة: المتبقية الفينول الأحمر في كاشف مفرزة الخلية يمكن أن تتداخل مع الفحص.
  5. بعناية إعادة تعليق خلية بيليه في 2 مل من وسائل الإعلام النمو. قياس تركيز وديموجة الخلايا باستخدام تريبان الأزرق وعداد الخلية.
    ملاحظة: يجب أن تكون قابلية الخلية > 90% للحصول على أفضل النتائج.
  6. تخفيف الخلايا إلى تركيز 125 الخلايا /μL. على سبيل المثال، بالنسبة لمحسب 5 ميكرولتر هذا هو ~ 625 خلية/ميكرولتر. للحصول على قابلية البقاء الأمثل إبقاء الخلايا في التعليق لمدة لا تزيد عن 2 ساعة.

7. حضانة الخلايا مع مثبطات SHP2

  1. توزيع الخلايا في معقمة وحيد قناة حل الحوض الصغير.
  2. جهاز طرد مركزي 384-جيدا في الوقت الحقيقي لوحة PCR التي تم إعدادها مسبقا من قبل ترسيب مثبطات SHP2 في 2500 × ز لمدة 5 دقائق في 23 درجة مئوية.
  3. إزالة الختم من لوحة المجمع. باستخدام ماصة متعددة القنوات 125 ميكرولتر، أضف 5 ميكرولتر من الخلايا المخففة إلى الآبار المرغوبة.
  4. الطرد المركزي لوحة في 42 × ز لمدة 30 s دون غطاء على لوحة. نعلق غطاء ختم على لوحة بعد نسج لوحة أسفل واحتضان لوحة المقايسة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 ل 1 ساعة.

8. إعداد مزيج مُكَدِر الكُشف

  1. إزالة الكمية اللازمة من الكواشف الكشف (كاشف EA، العازلة التحلل، والركيزة) من -20 درجة مئوية تخزين بعد خلايا الطلاء. ذوبان الكواشف في 23 درجة مئوية.
    ملاحظة: للحصول على الراحة في النقل، قم بإعداد وحدة تخزين 1.5x الحجم الإجمالي للخلايا التي تم إيداعها في اللوحة. لا تستخدم الكواشف بعد الاستخدام.
  2. إعداد مزيج رئيسي من الكواشف باستخدام شرط EA-10، والذي يتكون من الكسر المكون وحجم كما يلي: كاشف EA (0.17)، العازلة تحلل (0.17)، الركيزة (0.67).
    ملاحظة: تستند نسب الكاشف إلى تجارب التحسين التي يتم تنفيذها على النحو المحدد في دليل المورد.

9. النبض الحراري الحراري أو الحرارية التدرج الحراري

  1. برنامج الترموسيل الحراري قادرة على التدرج لتسليم نبض الحرارة.
    1. بالنسبة لتجارب التدرجات الشخصية الحرارية، قم ببرمجة التسوية الحرارية مع المواصفات التالية:
    2. نبض الحرارة: 3 دقيقة درجة حرارة الذوبان المطلوب (تدرج عمودي أو أفقي +/- 15 درجة مئوية؛ مثال 38-68 درجة مئوية موزعة على 24 بئراً تعطي زيادات في درجة الحرارة تبلغ 1.25 درجة مئوية).
  2. خطوة استرداد التوازن: 3 دقيقة 20 درجة مئوية مع سرعة المنحدر = 1 درجة مئوية / الثانية
    1. لتجارب الأيزوات الحرارية إعداد البروتوكول إعداد على النحو التالي:
    2. نبض الحرارة: 3 دقيقة 55 درجة مئوية. خطوة استرداد التوازن: 3 دقيقة 20 درجة مئوية مع سرعة المنحدر = 1 درجة مئوية / الثانية
      ملاحظة: لزيادة إعادة التكاثر، كما أنه يمكن أن يكون من الصعب وضع لوحة بدقة في الوقت الذي يصل درجة الحرارة الحرارية إلى درجة الحرارة المرجوة، وإعداد البرنامج لحساب أسفل 15 s قبل البدء في نبضة 3 دقيقة. لcycler المستخدمة في هذه التجربة انظر جدول المواد، يتم الاحتفاظ الغطاء أثناء نبض الحرارة.

10. تحلل الكشف والقياس

  1. لوحات فحص الملحق مع مزيج سيد الكشف عن التحلل عن طريق إضافة وحدات التخزين المتساوية (5 ميكرولتر) إلى كل بئر ليتم تحليلها باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  2. جهاز طرد مركزي لوحة 42 × ز لمدة 30 s. يُحفظ عند درجة حرارة 23 درجة مئوية في الظلام لمدة 30-60 دقيقة.
  3. قياس chemiluminescence باستخدام قارئ microplate قادرة على الكشف عن الإنارة في شكل 384 جيدا. تنفيذ قياس الإنارة مع نوع لوحة ووقت التكامل الأمثل (وقت التكامل 1000 مللي ثانية، تسوية الوقت 0 s). قياس القيم كقيم/قيم ونواتج لمزيد من التحليل.

11 - تحليل البيانات

  1. تحليل بيانات الإنارة باستخدام برنامج رسم بياني وإحصاءات علميين 2D.
  2. توليد ملامح الحرارية من خلال تحليل بيانات الإنارة تطبيع (تطبيع لمراقبة السيارة) باستخدام الانحدار غير الخطية ونموذج بولتزمان sigmoidal.
    ملاحظة: في تجارب الملف الشخصي الحراري، فإن درجة الحرارة المحسوبة V50، وهي نقطة منتصف الطريق بين أسفل المنحنى وأعلىه، تحدد درجة حرارة الذوبان SHP2. في التجارب الحرارية، يحدد EC50 تركيز المانع الذي يعطي استجابة نصف قصوى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وأسفرت تجربة التدرج الحراري لـ SHP2-WT عن تشكيل حراري خلوي من السيني مع انتقال ضيق للذوبان نموذجي ومتسق للبروتين المطوي (الشكل 4A). SHP2 يتكون من ثلاثة مجالات مستقلة : اثنين من المجالات SH2 والمجال الحفاز(الشكل 1). في ال أتمتة يُسَبّقّ ينقّلّة مغلقة هذا مجالات ذاتية الإقران; الانتقال الذوبان الذي لوحظ في تجربة الملف الشخصي الحراري يعكس هذه الحالة في الخلية. حضانة SHP2-WT مع مثبطات اللوستري SHP099 في 10 μM استقرت SHP2-WT الملف الحراري إلى درجة كبيرة وقابلة للقياس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد قدمنا فحص الاشتباك الهدف التي يمكن أن تؤكد الربط المباشر للجزيئات الصغيرة إلى phosphatase SHP2 في الخلايا. يمكن أن تميز المقايسة بين مثبطات التقارب المنخفضة والعالية ، والأهم من ذلك ، تؤكد عدم فاعلية مثبطات اللوسترية من نوع SHP099 لـ GOF oncogenic SHP2-E76K. قوة هذا المقايسة المصغرة هي قدرتها على الاندماج في حملة فحص مثبطات SHP2. إن قدرة المقايسة على تأكيد الربط داخل الخلايا لـ SHP2 من قبل مادة كيميائية غير معروفة هي قدرة مهمة على ضمان إمكانية نشر موارد الفحص بكفاءة. وعموما، فإن البروتوكول المصغر قوي وموثوق به.

<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن المؤلفان أنهما لا يوجد لديهما أي تضارب في المصالح مع محتويات هذه المادة.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة 1R21CA195422 (ل. T.) ، وجائزة مؤسسة إبشتاين الأسرة (إلى N. D. P.C.) ، ومركز NCI دعم مركز P30CA030199. وبالإضافة إلى ذلك، تم تمويل هذا المشروع كليا أو جزئيا بأموال اتحادية من المعهد الوطني للسرطان، والمعاهد الوطنية للصحة، بموجب عقد اتحاد البيولوجيا الكيميائية رقم 1. HHSN261200800001E. لا يعكس محتوى هذا المنشور بالضرورة آراء أو سياسات وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، ولا يتضمن ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات تأييدًا من قبل حكومة الولايات المتحدة. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحده ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دورة حرارية مجهزة بتدرج 384 بئرإيبندورف إيه جيX50h
384 بئر منخفض الحجم الميت مؤهل لصيحة ميكرولوح إيكوشركة بيكمان كولتر، إنك.LP-0200
ألواح زراعة الخلايا ذات ال6 آبارغرينر بيو-ون657 160معقم مع غطاء
مضاد حيوي-مضاد للفطريات (مضاد للفطريات) 100 Xثيرمو فيشر العلمي15240-062
عداد الخلاياثيرمو فيشر العلميالكونتيسة الثانية الشريقة
دولبيكو موديفايد إيجل ميديوم 1X + جلوتاماكسثيرمو فيشر العلمي10566-016500 مل
معالج السوائل الصوتية إيكوشركة بيكمان كولتر، إنك.إيكو 550
الماصة الإلكترونية متعددة القنواتثيرمو فيشر العلميE1 ClipTip
مصل الأبقار الجنينيثيرمو فيشر العلمي26140-079500 مل
مخزن HEPESثيرمو فيشر العلمي15630-680100 مل
مجموعة بدء نبضات InCellشركة يوروفينز ديسكفر إكس.94-4007تشمل المكونات مخزن EA، مخزن التحلل، والركيزة
قارئ الميكروبليتشركة تيكان تريدينغ إيه جيالشرارة
حوض محلول القناة الواحدةثيرمو فيشر العلميS253012005
بيروفات الصوديومثيرمو فيشر العلمي11360-010100 مللي موتر
سد الصفائح الحراريةشركة أجيلينت تكنولوجيز، إنك.بلايتلوك
كواشف النقلتحويل متعدد النقاطjetPRIME
تريبان بلوثيرمو فيشر العلميT10282
واكل TrypLE Expressثيرمو فيشر العلمي12605-010
لوحات PCR الفورية من نوع Twin.tec 384إيبندورف إيه جي30132734

المراجع

  1. Hunter, T. Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting. Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).
  2. Alonso, A., et al. Protein tyrosine phosphatases in the human genome. Cell. 117 (6), 699-711 (2004).
  3. Cohen, P. Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309(2002).
  4. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  5. Stanford, S. M., Bottini, N. Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).
  6. Tonks, N. Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction. FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).
  7. Chan, R., Feng, G. PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase. Blood. 109 (3), 862-867 (2007).
  8. Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer. Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).
  9. Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2. Cell. 92 (4), 441-450 (1998).
  10. Barford, D., Neel, B. Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2. Structure. 6 (3), 249-254 (1998).
  11. Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. Handbook of Cell Signaling (Second Edition). 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).
  12. Tartaglia, M., et al. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome. Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).
  13. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  14. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  15. Watanabe, N., et al. BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1. Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).
  16. Bialy, L., Waldmann, H. Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs. Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).
  17. Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase. Methods. 35 (1), 9-21 (2005).
  18. Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. Targeting the PTPome in human disease. Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).
  19. Tautz, L., Mustelin, T. Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors. Methods. 42 (3), 250-260 (2007).
  20. Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. The therapeutic potential of phosphatase inhibitors. Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).
  21. Barr, A. Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development. Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).
  22. He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases. FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).
  23. Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors. FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).
  24. Chen, Y. N., et al. Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases. Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).
  25. Nichols, R. J., et al. RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers. Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).
  26. Clinical Trial NCT03114319. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1 (2019).
  27. Clinical Trial NCT03634982. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1 (2019).
  28. Sun, X., et al. Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099. Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).
  29. LaRochelle, J. R., et al. Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition. Nature Communication. 9 (1), 4508(2018).
  30. Padua, R. A. P., et al. Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2. Nature Communication. 9 (1), 4507(2018).
  31. Lu, H., et al. Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR. Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).
  32. Smyth, L. A., Collins, I. Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors. Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).
  33. Martinez Molina, D., et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay. Science. 341 (6141), 84-87 (2013).
  34. Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  35. McNulty, D. E., et al. A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1. SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).
  36. Romero, C., et al. A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors. Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).
  37. Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2. Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SHP2 HEK293 T SHP099 SHP2

مقالات ذات صلة