نهج قياس التدفق الخلوي لتوصيف الخصائص البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة البالغة المعزولة بشكل حاد والبلاعم الدماغية في المختبر

ملخص

يمكن أن يوفر تقييم الخصائص البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم الدماغية بعدا وظيفيا قيما لدراسات التنميط الجزيئي. نصف بروتوكولا تم التحقق من صحته يستخدم قياس التدفق الخلوي لقياس البلعمة بسرعة وموثوقية للكريات المجهرية الفلورية وألياف بيتا الأميلويد بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بشكل حاد والبلاعم الدماغية من نماذج الفئران.

الملخص

تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المتسللة للجهاز العصبي المركزي (CNS) ، والتي تسمى مجتمعة الخلايا البلعمية أحادية النواة للجهاز العصبي المركزي (CNS-MPS) ، أدوارا مركزية في الأمراض العصبية بما في ذلك التنكس العصبي والسكتة الدماغية. يشارك الجهاز العصبي المركزي MPS في التصفية البلعمية للبروتينات المرضية والحطام والمشابك العصبية ، ولكل منها مسارات جزيئية أساسية مميزة. يمكن أن يوفر توصيف هذه الخصائص البلعمية قراءة وظيفية تكمل التنميط الجزيئي للخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام أساليب قياس التدفق الخلوي التقليدية والنسخ والبروتينات. اعتمد التنميط البلعمي للخلايا الدبقية الصغيرة على التصور المجهري والثقافات المختبرية للخلايا الدبقية الصغيرة لحديثي الولادة في الفئران. يعاني النهج الأول من أخذ عينات محدودة بينما يعكس النهج الأخير بطبيعته بشكل سيئ الحالة الحقيقية في الجسم الحي لأعضاء البرلمان البالغين في الجهاز العصبي المركزي. تصف هذه الورقة البروتوكولات المحسنة لخصائص البلعمة من النمط الظاهري للفأر المعزول بشكل حاد CNS-MPS عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم عزل الجهاز العصبي المركزي بشكل حاد عن دماغ الفأر البالغ باستخدام التفكك الميكانيكي متبوعا بالطرد المركزي المتدرج للكثافة ، المحتضن بكريات مجهرية فلورية أو ألياف فلورية Aβ ، وغسلها ، ثم يتم تصنيفها بألواح من الأجسام المضادة ضد علامات السطح (CD11b ، CD45). باستخدام هذا النهج ، من الممكن مقارنة الخصائص البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ مع البلاعم المتسللة للجهاز العصبي المركزي ثم تقييم تأثير الشيخوخة وأمراض الأمراض على هذه الأنماط الظاهرية البلعمة. تحمل هذه الطريقة السريعة أيضا إمكانية النمط الظاهري للجهاز العصبي المركزي البشري المعزول بشكل حاد وظيفيا من عينات الدماغ بعد الوفاة أو الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التحقيق في آليات محددة للبلعمة بواسطة مجموعات فرعية من الجهاز العصبي المركزي - MP عن طريق تثبيط مسارات البلعمة المختارة.

المقدمة

تتكون الخلايا المناعية الفطرية للجهاز العصبي المركزي (CNS) في الغالب من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الوحيدة / الضامة المتسللة ، والتي تسمى معا الخلايا البلعمية أحادية النواة (CNS-MPS)¹. يتورط الجهاز العصبي المركزي MPS في الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر (AD) ، واضطرابات الالتهاب العصبي ، والسكتة الدماغية^2،3،4. الجهاز العصبي المركزي-MPS ، جنبا إلى جنب مع الخلايا النجمية والخلايا العضاقية والخلايا البطانية العصبية ، لها وظائف البلعمة^5،6. في حالتها ا....

البروتوكول

أجريت جميع دراسات الفئران بعد الحصول على موافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة إيموري (IACUC) ، وبما يتفق بدقة مع دليل رعاية واستخدام المختبر التابع للمعاهد الوطنية للصحة.

1. التحضير في يوم العزل

1. قم بإعداد دلو ثلج للحفاظ على برودة جميع الكواشف والمخازن المؤقتة ومعلقات الخلايا طوال عملية العزل.
2. ضع زجاجة 1× محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1 لتر على الأقل) عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة قبل التروية واحتفظ ب 1× PBS على الجليد أثناء إجراء التروية والعزل.
3. قم بإعداد تركيز العمل لوسط تدرج الكثافة (يشار إليه باسم 35٪ SIP ، انظر جدول المواد)....

النتائج

لتجسيد النتائج النموذجية لامتصاص البلعمة للكريات المجهرية وألياف Aβ42 بواسطة الجهاز العصبي المركزي المعزول بشكل حاد ، تم الحصول على الجهاز العصبي المركزي المعزول بشكل حاد من نصف الكرة الأرضية المماثل بعد انسداد الشرايين الدماغية الوسطى العابر (MCAO)⁸. للحصول على تفاصيل حول الخصائص البلعمية ل CNS-MPS في نموذج MCAO ، يرجى الرجوع إلى المنشورات السابقة⁸. باختصار ، بعد 72 ساعة من التعافي ، تم عزل الجهاز العصبي المركزي بشكل حاد عن الدماغ الجديد باستخدام التفكك الميكانيكي متبوعا ب.......

المناقشة

قياس التدفق الخلوي هو تقنية يمكنها اكتشاف التعبير عن البروتينات أو علامات الاهتمام على سطح الخلية أو في المقصورات داخل الخلايا باستخدام مجسات مصنفة بالفلورسنت (عادة الأجسام المضادة) لتسمية هذه العلامات ذات الأهمية. عادة ما يتم اقتران الأجسام المضادة لسطح الخلية أو داخل الخلايا مع الفلوروكرومات القابلة للإثارة بالليزر والتي لها أطياف انبعاث فريدة. يمكن تصنيف الخلايا المحتضنة بهذه الأجسام المضادة إلى مجموعات سكانية فرعية متعددة بناء على أنماط التعبير عن هذه العلامات. تحتوي الجهاز العصبي ال.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10x محلول الملح المتوازن من Hank (10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	يخزن عند 4 درجات مئوية يستخدم لصنع SIP كما هو موضح في البروتوكول
1x محلول الملح المتوازن من Hank (1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	يخزن عند 4 درجات مئوية. يستخدم لصنع 35٪ SIP كما هو موضح في البروتوكول
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html قم بتخزين 10xPBS في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد 1xPBS طازج عن طريق تخفيف جزء واحد 10xPBS إلى تسعة أجزاء من MilliQ dH20 وتخزينه عند 4 درجات ؛ ج لمدة ساعة قبل الاستخدام. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني ل 1xPBS هو 7.0 قبل إعادة التبريد.
35٪ SIP			لصنع 20 مل من 35٪ SIP ، استخدم 7 مل من SIP و 13 مل من الثلج البارد 1 & مرات ؛ HBSS. استمر في وضع الجليد حتى مزيد من المعالجة
APC-Cy7 الفئران المضادة ل CD11b	BD Pharmingen	557657	تخزين في 4 درجات ؛ C أو احتفظ بها على الثلج عند الاستخدام. شيلد من الضوء. تخفيف قياس التدفق الخلوي - 1: 100
FITC الفئران المضادة للفأر CD145	BD Pharmingen	553080	تخزين في 4 درجات ؛ C أو احتفظ بها على الثلج عند الاستخدام. شيلد من الضوء. تخفيف قياس التدفق الخلوي - 1: 100
LIVE / DEAD Fix Blue Dead Dead Dead Stain	Kit ThermoFisher	L34961	Store at -20 & °C. أضف 50 لتر من DMSO إلى أنبوب واحد من الصبغة ، والدوامة بالكامل وجهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة. L aliquots وتخزينها عند -20 درجة مئوية. استخدم كمية جديدة لكل تجربة وأضفها إلى العينات عند تخفيف 1: 500.
OneComp eBeads تعويض الخرز	ThermoFisher	01-1111-42	تخزين في 4 & درجات; C ، قم بدوامة الأنبوب بالكامل قبل إضافته إلى أنبوب (أنبوب) العينة ، واحتفظ بالثلج عند الاستخدام.
PE-Cy7 الفئران المضادة للفأر CD145	BD Pharmingen	552848	مخزن في 4 درجات ؛ C أو احتفظ بها على الثلج عند الاستخدام. شيلد من الضوء. تخفيف قياس التدفق الخلوي - 1: 100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. لصنع 10 مل من Percoll متساوي التوتر القياسي (SIP): استخدم 9 مل من Percoll البارد و 1 مل من البرد 10 مرات ؛ HBSS.
الكريات المجهرية المترافقة Phycoerythrin-ThermoFisher		F13083	مخزن في 4 درجات ؛ C أو احتفظ بها على الثلج عند الاستخدام.
بيتا ؛ - الأميلويد (1 - 42) ، HiLyte Fluor 488 - المسمى ، Human	AnaSpec	AS-60479-01	التركيز النهائي للألياف Ab هو 200 & micro ؛ M الذي يتم تخفيفه بعد ذلك قبل الاستخدام. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، قم بإعداد حل عمل جديد لكل تجربة.