يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نهج قياس التدفق الخلوي لتوصيف الخصائص البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة البالغة المعزولة بشكل حاد والبلاعم الدماغية في المختبر

3.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61467

⸱

يونيو 23, 2020

 ,  , 
1Department of Neurology, Emory University

في هذه المقالة

ملخص

يمكن أن يوفر تقييم الخصائص البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة والبلاعم الدماغية بعدا وظيفيا قيما لدراسات التنميط الجزيئي. نصف بروتوكولا تم التحقق من صحته يستخدم قياس التدفق الخلوي لقياس البلعمة بسرعة وموثوقية للكريات المجهرية الفلورية وألياف بيتا الأميلويد بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بشكل حاد والبلاعم الدماغية من نماذج الفئران.

الملخص

تلعب الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المتسللة للجهاز العصبي المركزي (CNS) ، والتي تسمى مجتمعة الخلايا البلعمية أحادية النواة للجهاز العصبي المركزي (CNS-MPS) ، أدوارا مركزية في الأمراض العصبية بما في ذلك التنكس العصبي والسكتة الدماغية. يشارك الجهاز العصبي المركزي MPS في التصفية البلعمية للبروتينات المرضية والحطام والمشابك العصبية ، ولكل منها مسارات جزيئية أساسية مميزة. يمكن أن يوفر توصيف هذه الخصائص البلعمية قراءة وظيفية تكمل التنميط الجزيئي للخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام أساليب قياس التدفق الخلوي التقليدية والنسخ والبروتينات. اعتمد التنميط البلعمي للخلايا الدبقية الصغيرة على التصور المجهري والثقافات المختبرية للخلايا الدبقية الصغيرة لحديثي الولادة في الفئران. يعاني النهج الأول من أخذ عينات محدودة بينما يعكس النهج الأخير بطبيعته بشكل سيئ الحالة الحقيقية في الجسم الحي لأعضاء البرلمان البالغين في الجهاز العصبي المركزي. تصف هذه الورقة البروتوكولات المحسنة لخصائص البلعمة من النمط الظاهري للفأر المعزول بشكل حاد CNS-MPS عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم عزل الجهاز العصبي المركزي بشكل حاد عن دماغ الفأر البالغ باستخدام التفكك الميكانيكي متبوعا بالطرد المركزي المتدرج للكثافة ، المحتضن بكريات مجهرية فلورية أو ألياف فلورية Aβ ، وغسلها ، ثم يتم تصنيفها بألواح من الأجسام المضادة ضد علامات السطح (CD11b ، CD45). باستخدام هذا النهج ، من الممكن مقارنة الخصائص البلعمية للخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ مع البلاعم المتسللة للجهاز العصبي المركزي ثم تقييم تأثير الشيخوخة وأمراض الأمراض على هذه الأنماط الظاهرية البلعمة. تحمل هذه الطريقة السريعة أيضا إمكانية النمط الظاهري للجهاز العصبي المركزي البشري المعزول بشكل حاد وظيفيا من عينات الدماغ بعد الوفاة أو الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التحقيق في آليات محددة للبلعمة بواسطة مجموعات فرعية من الجهاز العصبي المركزي - MP عن طريق تثبيط مسارات البلعمة المختارة.

المقدمة

تتكون الخلايا المناعية الفطرية للجهاز العصبي المركزي (CNS) في الغالب من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الوحيدة / الضامة المتسللة ، والتي تسمى معا الخلايا البلعمية أحادية النواة (CNS-MPS)1. يتورط الجهاز العصبي المركزي MPS في الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر (AD) ، واضطرابات الالتهاب العصبي ، والسكتة الدماغية2،3،4. الجهاز العصبي المركزي-MPS ، جنبا إلى جنب مع الخلايا النجمية والخلايا العضاقية والخلايا البطانية العصبية ، لها وظائف البلعمة5،6. في حالتها الاستتبابية ، تشارك CNS-MPS في المراقبة المستمرة للبيئة المكروية المحلية ، جنبا إلى جنب مع الإزالة البلعمية لحطام الخلايا المبرمج والبروتينات ، والتقليم المشبكي لإعادة تشكيل الوصلات العصبية7،8،9،10. في الحالات التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر ، تتبنى الجهاز العصبي المركزي أنماطا ظاهرية جزيئية ووظيفية متميزة مرتبطة بالمرض والتي يمكن أن تلعب أدوارا مرضية بما في ذلك إزالة الأميلويد بيتا المجمعة (Aβ) والعناصر العصبية ، بالإضافة إلى السيتوكين الالتهابي وإطلاق العوامل ، مما يؤدي إلى أدوار وقائية معقدة مؤيدة للالتهابات وضارة وكذلك مضادة للالتهابات11،12،13،14. يتم التوسط في البلعمة للجسيمات الكبيرة والحطام الخلوي والبروتينات والجسيمات المعدية الأخرى بواسطة الجهاز العصبي المركزي MPS بواسطة مستقبلات مميزة يتم التعبير عنها علىسطحها 9. يمكن أن يؤدي الاضطراب في هذه المسارات البلعمية إلى تصفية معيبة وتراكم تدريجي ل Aβ مما يؤدي في النهاية إلى تلف الخلايا العصبية التدريجي في4،9 بعد الميلاد. في حين أن التقدم في التنميط الجزيئي للجهاز العصبي المركزي باستخدام الأساليب النسخية والبروتينية قد قدم رؤى لا تقدر بثمن حول عدم التجانس الجزيئي داخل الجهاز العصبي المركزي MPS في الأمراض العصبية15،16 ، فإن التوصيف الوظيفي للخصائص البلعمية ل CNS-MPS ومجموعاتها الفرعية غير موجودة حاليا. يمكن أن يكمل التوصيف الوظيفي لخصائص البلعمة للجهاز العصبي المركزي - MPS استراتيجيات التنميط الجزيئي ، ويسهل التنميط الظاهري الوظيفي بشكل أفضل ، ويساعد في تقييم فعالية العلاجات التي يمكن أن تصحح البلعمة المعيبة في نماذج المرض17.

تشمل فحوصات البلعمة التقليدية للجهاز العصبي المركزي احتضان الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية جنبا إلى جنب مع ركائز الفلورسنت مثل Aβ أو جزيئات اللاتكس / البوليسترين. ثم تتم دراسة البلعمة كدالة لامتصاص الركيزة الفلورية باستخدام الفحص المجهري المناعي18،19،20. من الثابت أن أعضاء مجلس النواب في الجهاز العصبي المركزي ، عند الحفاظ عليهم في الثقافات الطويلة ، يمكنهم تغيير مورفولوجيتهم وملفات تعريف النسخ بشكل كبير21،22. هذا يعيق دراسة الخصائص البلعمية لأعضاء البرلمان في الجهاز العصبي المركزي في حالتهم التمثيلية في الجهاز العصبي المركزي. يمكن أن يوفر مقايسة قياس التدفق الخلوي الوظيفي لتعريف الجهاز العصبي المركزي الحية المعزولة بشكل حاد تقييما سريعا لخصائص البلعمة ويمكنه أخذ عينات من مجموعة أكبر بكثير من الجهاز العصبي المركزي - MPS من نهج الفحصالمجهري 9،23. علاوة على ذلك ، يلغي قياس التدفق الخلوي الحاجة إلى الحفاظ على الجهاز العصبي المركزي-MPS في الثقافة بالإضافة إلى توفير منصة لدراسة خصائص البلعمة في مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. تصف هذه المخطوطة البروتوكولات المحسنة لخصائص البلعمة للنمط الظاهري للفأر المعزول بشكل حاد CNS-MPS عن طريق قياس التدفق الخلوي. يسمح تكييف فحوصات البلعمة باستخدام قياس التدفق الخلوي بتعدد الإرسال السريع للنمط الظاهري البلعمي للجهاز العصبي المركزي العصبي المركزي إلى جانب التنميط الظاهري المناعي ، وبالتالي توفير رؤى حول عدم تجانس خصائص البلعمة داخل الجهاز العصبي المركزي-MPS بدقة الخلية الواحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع دراسات الفئران بعد الحصول على موافقة من اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة إيموري (IACUC) ، وبما يتفق بدقة مع دليل رعاية واستخدام المختبر التابع للمعاهد الوطنية للصحة.

1. التحضير في يوم العزل

  1. قم بإعداد دلو ثلج للحفاظ على برودة جميع الكواشف والمخازن المؤقتة ومعلقات الخلايا طوال عملية العزل.
  2. ضع زجاجة 1× محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1 لتر على الأقل) عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إلى ساعة واحدة قبل التروية واحتفظ ب 1× PBS على الجليد أثناء إجراء التروية والعزل.
  3. قم بإعداد تركيز العمل لوسط تدرج الكثافة (يشار إليه باسم 35٪ SIP ، انظر جدول المواد).
  4. قم بتسمية جميع أنابيب قياس الخلايا المخروطية والتدفق المستخدمة في التجربة قبل عزل الخلية لتجنب التأخير في أوقات المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، اجمع جميع المستلزمات الأخرى اللازمة للعزل قبل التروية ، مثل مصافي الخلايا والمحاقن والإبر 40 ميكرومتر.

2. العزلة الحادة للخلايا الدبقية الصغيرة للفأر البالغ

  1. تخدير فأر بالغ عن طريق وضع الفأر في حجرة تحريض زجاجية مع الأيزوفلوران (5 مل) حتى يتوقف الفأر عن التنفس ويفشل في الاستجابة لقرص مخلب الطرف الخلفي.
  2. استخدم إبرة 26 جم وحقنة 10 مل لإجراء نضح القلب مع 30 مل من 1× PBS المثلج حتى لا يكون هناك دم مرئي.
  3. اقطع رأس الفأر بمقص جراحي. استخدم مقصا صغيرا لقطع الجلد ، وتعريض الجمجمة. إزالة الجمجمة دون الإضرار بأنسجة المخ كما هو موضح24. قم بإزالة الدماغ على الفور ونقله إلى مصفاة خلوية معقمة سعة 40 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
  4. استخدم الجانب الخلفي من مكبس حقنة سعة 3 مل لدفع الدماغ عبر المصفاة وفصل أنسجة المخ بأكملها ميكانيكيا. اغسل مصفاة الخلية والمكبس بشكل متقطع أثناء التفكك باستخدام 2 مل من 1× PBS المثلج في كل مرة لضمان مرور جميع الأنسجة عبر المصفاة.
  5. اكشط الجزء السفلي من مصفاة الخلية باستخدام المكبس لجمع أي تعليق متبقي في المخروطي. اغسل مصفاة الخلية جيدا باستخدام 1× PBS المثلج واسكب التعليق في الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
    ملاحظة: عند معالجة متعددة على التوالي ، ضع معلقات الخلية على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
  6. أضف 1× PBS المثلج لرفع حجم تعليق الخلية إلى 30 مل وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. اسكب المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات وأعد تعليق الحبيبات في 6 مل من 35٪ SIP باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. انقل معلق الخلية + خليط SIP بنسبة 35٪ إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بسعة 800 × جم لمدة 25 دقيقة عند 15 درجة مئوية بدون فرامل.
    تنبيه: توخ الحذر بشكل خاص لتجنب إدخال الفقاعات أثناء إعادة التعليق. يمكن أن تكون الفقاعات الزائدة ضارة بإنتاجية الخلايا.
  8. قم بإزالة الأنبوب المخروطي سعة 15 مل بعناية من جهاز الطرد المركزي دون إزعاج الطبقات واستنشاق طبقة المايلين العفوية العائمة.
  9. انقل خليط معلق الخلية + 35٪ SIP باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل يحتوي على 30 مل من 1× PBS المثلج وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية بعناية ، تاركا وراءها حبيبات الخلية مع 500-800 ميكرولتر من 1× PBS.
  10. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة p1000 ونقلها إلى أنبوب سفلي دائري سعة 5 مل. أضف 2 مل من 1× PBS المثلج إلى الأنبوب السفلي المستدير وجهاز الطرد المركزي عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية بسرعة ، تاركا حبيبات الخلية التي تحتوي على الجهاز العصبي المركزي-MPS في حوالي 100 ميكرولتر من 1× PBS (الشكل 1).

3. إعداد البلعمة وتلوين التدفق الخلوي

  1. انقل 20 ميكرولتر (≈200,000 خلية) من الجهاز العصبي المركزي العصبي المركزي المعاد تعليقه إلى أنبوب دائري جديد سعة 5 مل وأضف 80 ميكرولتر من 1× PBS المثلج. لا تضيف أي ركائز فلورية أو أجسام مضادة لقياس التدفق الخلوي إلى هذا الأنبوب. تعمل هذه الخلايا كعنصر تحكم سلبي لتحديد مضان الخلفية ل CNS-MPS لتحليلات قياس التدفق الخلوي.
  2. لتحديد جدوى أعضاء البرلمان المعزولة في الجهاز العصبي المركزي ، استخدم الأصباغ الحية / الميتة القائمة على الأمين (على سبيل المثال ، الأشعة فوق البنفسجية الزرقاء القابلة للإصلاح).
    1. أعد تعليق باقي حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من 1× PBS وأضف 1 ميكرولتر من الصبغة المعاد تكوينها إلى كل أنبوب عينة باستثناء التحكم السلبي.
    2. دوامة برفق ، وقم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 1 مل من 1× PBS إلى كل أنبوب ودوامة برفق.
    3. الطرد المركزي للخلايا عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية بسرعة وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1× PBS.
      ملاحظة: سوف ترتبط الأصباغ القائمة على الأمين بألياف Aβ خارج الخلية مما يؤدي إلى إرباك نتائج البلعمة. قد تتداخل المؤشرات الحية / الميتة الأخرى مع تألق ألياف / الكريات المجهرية Aβ. ومن ثم ينصح باستخدام مؤشر Live / Dead فقط في التجارب الأولية لتحديد جدوى أعضاء البرلمان المعزولين CNS.
  3. قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على كريات مجهرية من البولي إيثيلين البوليسترين جيدا وأضف 2 ميكرولتر (≈200 كرة مجهرية / خلية) إلى 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنابيب التدفق باستثناء التحكم السلبي. قم بدوامة كل أنبوب برفق لضمان التوزيع المتساوي للركيزة مع الخلايا ووضع الأنابيب السفلية المستديرة في حاضنة معقمة مرطبة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    1. قم بدوامة واحتضان أنبوب التحكم السلبي برفق لضمان ظروف تجريبية مماثلة بين العينات الموجبة والسالبة.
      ملاحظة: في حالة استخدام ألياف Aβ بدلا من الكريات المجهرية PE ، قم بإعداد ألياف HiLyte488 Aβ الفلورية كما هو موضحسابقا 9. التركيز النهائي للألياف Aβ هو 200 ميكرومتر ثم يتم تخفيفه لتحضير مخزون طازج 20 ميكرومتر في PBS من مونومرات الفلورسنت Aβ. أضف 12.5 ميكرولتر من مونومرات Aβ 20 ميكرومتر إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا معزولة.
  4. قم بإزالة الخلايا من الحاضنة وأضف 1 مل من 1× PBS إلى كل أنبوب ودوامة برفق. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية وصب المادة الطافية بسرعة. كرر الغسيل مع 1 مل 1× PBS ، وجهاز طرد مركزي عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين ، ثم اسكب المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1× PBS.
    ملاحظة: بعد كل دورة ، من المهم إبقاء الخلايا على الجليد لمنع امتصاص البلعمة المستمر.
  5. قم بدوامة الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي وقم بطردها في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 10 ثوان. أضف إلى كل أنبوب تعليق خلية 1 ميكرولتر لكل من CD11b-APC / Cy7 و CD45-PE / Cy7 لمقايسة البلعمة Aβ ، أو CD45-FITC لبلعمة PE المجهرية. قم بدوامة كل أنبوب برفق واحتضانه في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يمكن للمستخدمين أيضا تضمين أنبوب منفصل يحتوي على خلايا البلعمة القوية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 المستنبتة أو البلاعم البريتونية كتحكم إيجابي ومعالجتها باستخدام كريات البولي إيثيلين المجهرية ، والأجسام المضادة لقياس الخلايا كما هو موضح أعلاه. يمكن استخدام البيانات من هذه العينة لتحديد التحكم الإيجابي الذي يدل على البلعمة الحقيقية في التجارب الأولية.
  6. أثناء الحضانة ، قم بإعداد أنابيب تعويض باستخدام أربعة أنابيب تدفق مستديرة القاع سعة 5 مل. دوامة حبات التعويض تماما وإضافة قطرة واحدة إلى كل أنبوب. أضف 1 ميكرولتر من CD11b-APC / Cy7 إلى الأنبوب الأول و CD45-FITC للأنبوب الثاني. أضف 1 ميكرولتر من البوليسترين PE إلى الأنبوب الثالث واحتفظ بخرز التعويض غير الملوثة في الأنبوب الرابع. استخدم هذا الأنبوب الرابع كعنصر تحكم سلبي لإعداد لوحة تعويض على مقياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: عند استخدام ألياف Aβ لدراسة البلعمة ، أضف CD45-PECy7 إلى الأنبوب الثاني بدلا من CD45-FITC. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المنفصل لقياس التدفق الخلوي الموسوم ب FITC أو الجسم المضاد الثانوي FITC (أي نوع) إلى أنبوب التعويض الثالث. هذا مهم لأن الخرزات لا يمكن أن تلتصق بألياف Aβ وسيتم غسلها عند غسل أنابيب التعويض.
  7. اسمح لحبات التعويض بالاحتضان بالأجسام المضادة الخاصة بها لمدة 10 دقائق على الأقل. بعد الحضانة ، أضف 1 مل من 1× PBS إلى كل أنبوب ، وجهاز طرد مركزي عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ، واسكب المادة الطافية بسرعة. ضع أنابيب التعويض على الجليد وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم حتى قياس التدفق الخلوي.
  8. بعد الحضانة بالأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي ، اغسل الخلايا الملطخة ب 1 مل من 1× PBS. قم بدوامة الخلايا بلطف وطرد مركزي عند 1,400 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. اسكب المادة الطافية بسرعة وكرر الغسيل بمقدار 1 مل 1× PBS. بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من 1× PBS.
  9. ضع أنابيب العينة على الثلج وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم حتى قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: استخدم 1× PBS (درجة الحموضة 7.0) بدون Ca2 + / Mg2+ كمخزن مؤقت للتدفق طوال التجربة. تأكد من استبعاد مصل الأبقار الجنيني (FBS) في مخزن التدفق لتجنب التنشيط المحتمل للدبقية الصغيرة.

4. قياس التدفق الخلوي وتحليله

  1. إعداد الأداة والتعويض
    ملاحظة: أجريت التجارب في هذه المخطوطة على مقياس التدفق الخلوي باستخدام ليزر فوق بنفسجي وبنفسجي وأزرق وأصفر وأخضر وأحمر. يمكن أيضا تكييف هذه التجربة مع مقاييس التدفق الخلوي ثلاثية الليزر باستخدام الليزر الأزرق والأصفر والأخضر والأحمر فقط. يحتاج المستخدمون إلى الخضوع لتدريب رسمي قبل التعامل مع الأداة.
    1. أعد ملء خزان غمد التدفق العازل وقم بتشغيل مقياس الخلايا. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج التحليل على الكمبيوتر المتصل بمقياس التدفق الخلوي بأنبوب تدفق سفلي دائري سعة 5 مل يحتوي على ddH2O. قم بتسجيل الدخول إلى برنامج التحليل على الكمبيوتر المتصل بمقياس التدفق الخلوي. قم بإنشاء "تجربة" وحدد FSC و SSC و FITC و PECy7 و APC-Cy7 كمعلمات. في حالة استخدام كريات PE المجهرية، حدد PE بدلا من PECy7 في لوحة المعلمات.
    2. قم بإنشاء لوحة تعويض مناسبة.
      ملاحظة: في تجاربنا ، عادة ما تكون الفولتية FSC / SSC لخرز التعويض حوالي 350/280 ، في حين أن جهد FSC / SSC ل CNS-MPS يبلغ حوالي 320/260. يمكن أن تختلف هذه القيم بين أي مقياسين مختلفين للخلايا وتحتاج إلى معايرتها قبل التجربة الفعلية.
    3. أعد تكوين كل تعويض وأنبوب تعليق خلية مع 500 ميكرولتر من 1× PBS ، دوامة لفترة وجيزة ، وضعها على الجليد. قم بتشغيل أنبوب التحكم السلبي / الخرزة غير الملوثة لضبط الفولتية المناسبة بحيث تكون الذروة في كل رسم بياني فلوروفور أقل من 102. قم بتشغيل أنابيب التعويض الأخرى أحادية اللون لتحديد قممها الإيجابية المميزة.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك فرق نصف لوغاريتمي على الأقل (الأساس 10) بين القمم الموجبة والسالبة لكل فلوروفور.
    4. سجل 5000 حدث من كل أنبوب تعويض للسماح للكمبيوتر بحساب إعداد التعويض تلقائيا. اربط إعداد التعويض بالتجربة الحالية25.
    5. قم بإنشاء "أنبوب" جديد ضمن علامة تبويب العينة. قم بتدوير أنبوب التحكم السلبي برفق وتشغيل أنبوب التحكم السلبي الذي يحتوي على CNS-MPS غير ملوث. اضبط الفولتية المبعثرة الأمامية والجانبية لالتقاط السكان المعنيين. سجل الأحداث والبوابة الفرعية على أعضاء البرلمان المباشرين للجهاز العصبي المركزي كما هو مذكور أدناه.
    6. التقط الأحداث وسجلها من جميع الأنابيب اللاحقة كملفات منفصلة مع الحفاظ على اتساق المعلمات والفولتية. قم بتدوير كل أنبوب برفق قبل تشغيله على مقياس التدفق الخلوي.
  2. استراتيجية البوابات وقياس البلعمة
    1. ارسم بوابة أولية أحادية النواة لالتقاط جميع أعضاء مجلس الأمن المركزي. يجب أن تكون هذه الخلايا أحادية النواة الحية مسورة في الرسم البياني التالي لتشمل خلايا مفردة فقط ، باستثناء المقاطع والثلاثة.
    2. قم بعرض مجموعة أعضاء CNS-MPS المفردة المسورة على رسم بياني لاحق يعرض الفلوروفورات CD11b و CD45.
      ملاحظة: عادة ما تكون الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة في الدماغ وسيطة CD11b + CD45، في حين أن البلاعم المتسللة تكونعالية CD11b + CD45. يمكن تضمين علامات إضافية مثل Ly6c في اللوحة لفصل الخلايا الوحيدة الالتهابية بثقة (Ly6c عالية وCD45 عالية) عن الخلايا الدبقية الصغيرة (Ly6cمنخفضة CD45متوسطة).
    3. قم بتطبيق البوابات المناسبة لمزيد من دراسة البلعمة في المجموعات السكانية المعنية كما هو موضح في الشكل 2F.
      ملاحظة: يتم قياس البلعمة في الجهاز العصبي المركزي-MPS كدالة لامتصاص مضان Hilyte488 / Alexa488 (Aβ) أو PE (الكرة المجهرية). تشير الذروة الإيجابية المميزة في الرسوم البيانية الخاصة بها إلى أن أعضاء مجلس النواب العصبي المركزي قد قاموا ببلعمة الركيزة. كمية المواد البلعمة تتناسب طرديا مع شدة الفلورة. ومن ثم ، يجب تفسير وجود قمم متعددة على أنه بلعمة أعلى. يمكن تأكيدها لاحقا عن طريق الكيمياء المناعية.
    4. بعد تسجيل جميع أنابيب العينة على مقياس التدفق الخلوي ، قم بتصدير ملفات البيانات بتنسيق .fcs لمزيد من التحليل.
  3. تحليل البيانات الإحصائية
    1. استخدم أي برنامج لتحليل قياس التدفق الخلوي جنبا إلى جنب مع جداول البيانات وبرامج التحليل الإحصائي لجميع تحليلات البيانات.
    2. أضف ملفات .fcs إلى برنامج التحليل وانقر نقرا مزدوجا فوق الملف الأول. رسم بياني يعرض كل ما تم تسجيله
      ستظهر الأحداث. اتبع استراتيجية بوابات مماثلة كما هو موضح في الشكل 2 لبوابة الخلايا أحادية النواة الحية وحيدة النواة لاحقا ودراسة البلعمة على مجموعة سكانية معينة ، على سبيل المثال الخلايا الدبقية الصغيرةالوسيطة CD11b + CD45 (الشكل 2H).
      ملاحظة: يتم تقييم مؤشر البلعمة بناء على نسبة الخلايا التي تستوعب ألياف الفلورسنت Aβ أو ≥1 كرة (كريات) دقيقة. كما هو محدد سابقا ، فإن البلعمة منخفضة المستوى هي امتصاص 1 ميكروكروي على الأقل والبلعمة عالية المستوى هي >1 امتصاص حبة 8,9. بناء على التجارب السابقة ، فإن تثبيط العمليات المعتمدة على الأكتين بواسطة السيتوكالاسين D يمنع تماما امتصاص حبة >1 ويمنع جزئيا امتصاص حبة1 9 بالإضافة إلى أنه يمنع امتصاص Aβ تماما ، مما يؤكد امتصاص البلعمة المعتمد على الأكتين بدلا من الارتباط السلبي بسطح الخلية. تؤكد الكيمياء الخلوية المناعية أيضا أن كل ذروة متسلسلة في مقايسة الغلاف المجهري تمثل زيادة موحدة في عدد الخرزات البلعمة8،9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتجسيد النتائج النموذجية لامتصاص البلعمة للكريات المجهرية وألياف Aβ42 بواسطة الجهاز العصبي المركزي المعزول بشكل حاد ، تم الحصول على الجهاز العصبي المركزي المعزول بشكل حاد من نصف الكرة الأرضية المماثل بعد انسداد الشرايين الدماغية الوسطى العابر (MCAO)8. للحصول على تفاصيل حول الخصائص البلعمية ل CNS-MPS في نموذج MCAO ، يرجى الرجوع إلى المنشورات السابقة8. باختصار ، بعد 72 ساعة من التعافي ، تم عزل الجهاز العصبي المركزي بشكل حاد عن الدماغ الجديد باستخدام التفكك الميكانيكي متبوعا ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

قياس التدفق الخلوي هو تقنية يمكنها اكتشاف التعبير عن البروتينات أو علامات الاهتمام على سطح الخلية أو في المقصورات داخل الخلايا باستخدام مجسات مصنفة بالفلورسنت (عادة الأجسام المضادة) لتسمية هذه العلامات ذات الأهمية. عادة ما يتم اقتران الأجسام المضادة لسطح الخلية أو داخل الخلايا مع الفلوروكرومات القابلة للإثارة بالليزر والتي لها أطياف انبعاث فريدة. يمكن تصنيف الخلايا المحتضنة بهذه الأجسام المضادة إلى مجموعات سكانية فرعية متعددة بناء على أنماط التعبير عن هذه العلامات. تحتوي الجهاز العصبي ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم الدراسة من خلال جوائز المعاهد الوطنية للصحة للدكتور رانجاراجو (NINDS K08 NS099474-1 و R01 NS114130-01A1) والدكتور رايابرولو (NIA F32AG064862). تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل Emory Flow Cellular Core، أحد المرافق الأساسية المتكاملة في إيموري (EICF) ومدعومة من كلية الطب بجامعة إيموري. تم تقديم دعم إضافي من قبل تحالف جورجيا للعلوم السريرية والتحويلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (UL1TR002378). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يعكس بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10x محلول الملح المتوازن من Hank (10x HBSS)ThermoFisher14065056يخزن عند 4 درجات مئوية يستخدم لصنع SIP كما هو موضح في البروتوكول
1x محلول الملح المتوازن من Hank (1x HBSS)ThermoFisher14175095يخزن عند 4 درجات مئوية. يستخدم لصنع 35٪ SIP كما هو موضح في البروتوكول
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html قم بتخزين 10xPBS في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد 1xPBS طازج عن طريق تخفيف جزء واحد 10xPBS إلى تسعة أجزاء من MilliQ dH20 وتخزينه عند 4 درجات ؛ ج لمدة ساعة قبل الاستخدام. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني ل 1xPBS هو 7.0 قبل إعادة التبريد.
35٪ SIPلصنع 20 مل من 35٪ SIP ، استخدم 7 مل من SIP و 13 مل من الثلج البارد 1 & مرات ؛ HBSS. استمر في وضع الجليد حتى مزيد من المعالجة
APC-Cy7 الفئران المضادة ل CD11bBD Pharmingen557657تخزين في 4 درجات ؛ C أو احتفظ بها على الثلج عند الاستخدام. شيلد من الضوء. تخفيف قياس التدفق الخلوي - 1: 100
FITC الفئران المضادة للفأر CD145BD Pharmingen553080تخزين في 4 درجات ؛ C أو احتفظ بها على الثلج عند الاستخدام. شيلد من الضوء. تخفيف قياس التدفق الخلوي - 1: 100
LIVE / DEAD Fix Blue Dead Dead Dead StainKit ThermoFisherL34961Store at -20 & °C. أضف 50 لتر من DMSO إلى أنبوب واحد من الصبغة ، والدوامة بالكامل وجهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة. L aliquots وتخزينها عند -20 درجة مئوية. استخدم كمية جديدة لكل تجربة وأضفها إلى العينات عند تخفيف 1: 500.
OneComp eBeads تعويض الخرزThermoFisher01-1111-42تخزين في 4 & درجات; C ، قم بدوامة الأنبوب بالكامل قبل إضافته إلى أنبوب (أنبوب) العينة ، واحتفظ بالثلج عند الاستخدام.
PE-Cy7 الفئران المضادة للفأر CD145BD Pharmingen552848مخزن في 4 درجات ؛ C أو احتفظ بها على الثلج عند الاستخدام. شيلد من الضوء. تخفيف قياس التدفق الخلوي - 1: 100
Percoll pH8.5-9.5SigmaP1644يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. لصنع 10 مل من Percoll متساوي التوتر القياسي (SIP): استخدم 9 مل من Percoll البارد و 1 مل من البرد 10 مرات ؛ HBSS.
الكريات المجهرية المترافقة Phycoerythrin-ThermoFisherF13083مخزن في 4 درجات ؛ C أو احتفظ بها على الثلج عند الاستخدام.
بيتا ؛ - الأميلويد (1 - 42) ، HiLyte Fluor 488 - المسمى ، HumanAnaSpecAS-60479-01التركيز النهائي للألياف Ab هو 200 & micro ؛ M الذي يتم تخفيفه بعد ذلك قبل الاستخدام. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، قم بإعداد حل عمل جديد لكل تجربة.

المراجع

  1. Jordan, F. L., Thomas, W. E. Brain macrophages: questions of origin and interrelationship. Brain Research. 472 (2), 165-178 (1988).
  2. Heneka, M. T., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. Lancet Neurology. 14 (4), 388-405 (2015).
  3. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. Journal of Leukocyte Biology. 87 (5), 779-789 (2010).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  5. Bellesi, M., et al. Sleep Loss Promotes Astrocytic Phagocytosis and Microglial Activation in Mouse Cerebral Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (21), 5263-5273 (2017).
  6. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 6(2013).
  7. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial Phagocytosis and Its Regulation: A Therapeutic Target in Parkinson's Disease. Frontiers in molecular neuroscience. 11, 144(2018).
  8. Gao, T., et al. Temporal profiling of Kv1. 3 channel expression in brain mononuclear phagocytes following ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 116(2019).
  9. Rangaraju, S., et al. Differential Phagocytic Properties of CD45(low) Microglia and CD45(high) Brain Mononuclear Phagocytes-Activation and Age-Related Effects. Frontiers in Immunology. 9, 405(2018).
  10. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  11. Dubbelaar, M. L., Kracht, L., Eggen, B. J. L., Boddeke, E. The Kaleidoscope of Microglial Phenotypes. Frontiers in Immunology. 9, 1753(2018).
  12. Ransohoff, R. M., El Khoury, J. Microglia in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (1), 020560(2015).
  13. Venegas, C., et al. Microglia-derived ASC specks cross-seed amyloid-beta in Alzheimer's disease. Nature. 552 (7685), 355-361 (2017).
  14. Sarlus, H., Heneka, M. T. Microglia in Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  17. Rangaraju, S., et al. Identification and therapeutic modulation of a pro-inflammatory subset of disease-associated-microglia in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 24(2018).
  18. Mutzke, E., Chomyshyn, E., Nguyen, K. C., Blahoianu, M., Tayabali, A. F. Phagocytosis-coupled flow cytometry for detection and size discrimination of anionic polystyrene particles. Analytical Biochemistry. 483, 40-46 (2015).
  19. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. Journal of Neuroscience. 25 (36), 8240-8249 (2005).
  20. Pul, R., Chittappen, K. P., Stangel, M. Quantification of microglial phagocytosis by a flow cytometer-based assay. Methods in Molecular Biology. 1041, 121-127 (2013).
  21. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  23. Grasse, M., Rosenkrands, I., Olsen, A., Follmann, F., Dietrich, J. A flow cytometry-based assay to determine the phagocytic activity of both clinical and nonclinical antibody samples against Chlamydia trachomatis. Cytometry A. 93 (5), 525-532 (2018).
  24. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, (2011).
  25. Szalóki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  26. Chen, M. J., et al. Microglial ERK activation is a critical regulator of pro-inflammatory immune responses in Alzheimer's disease. J bioRxiv. , 798215(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD11b CD45
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.