هنا ، نحن وصف طريقة للاحترار البلاستوسيستات البشرية vitrified ، وزراعة لهم من خلال فترة زرع في المختبر ، وهضمها في خلايا واحدة وجمع الخلايا الأرومية في وقت مبكر لمزيد من التحقيق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
زرع الإنسان، والرضا والالتصاق على سطح الرحم epithelia والغزو اللاحق للبلاستيس في decidua الأم، هو حدث البيولوجية الحرجة ولكن ملغز التي كانت تاريخيا صعوبة في الدراسة بسبب القيود التقنية والأخلاقية. يتم البدء في عملية الزرع عن طريق تطوير التروبكتوميرم إلى الأرومية المبكرة والتمايز اللاحق إلى خطوط فرعية متمايزة. قد يؤدي التمايز التروبيبلاستي المبكر المُنحرف إلى فشل الزرع وأمراض المشيمة وتشوهات الجنين والإجهاض. وقد تم مؤخراً تطوير طرق تسمح للأجنة البشرية بالنمو حتى اليوم الثالث عشر بعد الإخصاب في المختبر في غياب أنسجة الأمومة، وهي فترة زمنية تشمل فترة الزرع في البشر. وقد أعطى هذا الباحثين الفرصة للتحقيق في زرع الإنسان واختصار ديناميات التمايز trophoblast خلال هذه الفترة الحرجة دون الخلط بين التأثيرات الأم وتجنب العقبات الكامنة في دراسة الأحداث المبكرة لتمايز الأجنة في الجسم الحي. لتوصيف مختلف الطانيف الفرعية trophoblast أثناء الزرع، اعتمدنا القائمة ثنائية الأبعاد (2D) أساليب الثقافة الموسعة ووضعنا إجراء لهضم وعزل الأنزيمية أنواع مختلفة من الخلايا trophoblast لمقايسات المصب. الأجنة المستزرعة في ظروف ثنائية الأبعاد لديها مورفولوجيا مسطّحة نسبيًا وقد تكون دون المستوى الأمثل في النمذجة في العمارات الجنينية ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. ومع ذلك، يبدو أن التمايز الأرومية أقل تأثرا كما يتضح من التغيرات المتوقعة في المورفولوجيا والتعبير الجيني على مدى الثقافة الممتدة. يمكن فصل مختلف التوروفوبلاست sublineageages، بما في ذلك cytotrophoblast، syncytiotrophoblast وتوروفوبلاست المهاجرة حسب الحجم، والموقع، والظهور الزمني، واستخدامها لمزيد من التوصيف أو التجريب. قد يكون فحص هذه الخلايا الأرومية المبكرة مفيدًا في فهم زرع الإنسان ، وعلاج أمراض المشيمة الشائعة ، وتخفيف حدوث فقدان الحمل.
المقدمة
من الصعب تاريخياً التحقيق في زرع الإنسان وظهور المشيمة المبكرة ولا يزالان مجهولين إلى حد كبير لأن الأنسجة البشرية لا يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التي لا يمكن فيها اكتشاف الحمل سريرياً. النماذج الحيوانية غير كافية، حيث أن المشيمة البشرية لها ميزاتها الفريدة مقارنة بالثدييات الأوروبية الأخرى. على سبيل المثال ، تغزو المشيمة البشرية بعمق في decidua مع بعض الخلايا الأرومية التي تصل على الأقل إلى الثلث الداخلي من ميوميتوميوم الرحم بينما تعيد الخلايا الأخرى تشكيل الشرايين الحلزونية الرحمية. حتى أسلافنا التطورية الأقرب، الرئيسيات غير البشرية، تظهر الاختلافات في مورفولوجيا المشيمة والتفاعلات الأرومية مع الأنسجة الوَرَقِية الأمومية1،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تم التبرع بجميع الأجنة البشرية بموافقة لاستخدامها في البحوث. وقد وافق المجلس الغربي لمراجعة المؤسسات (دراسة رقم 1179872) على بروتوكولات لثقافة الأجنة البشرية الموسعة، وتتبع المبادئ التوجيهية الدولية. يجب مراجعة أي استخدام للأجنة البشرية من قبل الأخلاقيات المناسبة ومجالس الإدارة المرتبطة بالمؤسسة البحثية التي تستخدم هذا البروتوكول.
1- الإعداد
- إعداد وسائل الإعلام ولوحات الاسترداد يوم واحد قبل احترار الجنين في غطاء تدفق معقم.
- إعداد 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة الكيسات (BM) مع 10٪ v / v المصل البروتين بديل (SPS).
ملاحظة: وسائط ثقافة Blastocyst قد أو قد لا تحتوي على بروتين المضافة. هنا، استخدمنا وسيلة التي يجب أن تستكمل م....
- إعداد 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة الكيسات (BM) مع 10٪ v / v المصل البروتين بديل (SPS).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أظهرت الأجنة السليمة استمرار انتشارها على مدى انتشارها(الشكل 2B). بدأت الأجنة غير الطبيعية في التراجع عن حوافها الخارجية وتتفكك (الشكل 2C). من تجربتنا، تم إرفاق ما يقرب من 75٪ من الأجنة إلى الجزء السفلي من طبق ليفي المغلفة في 48 ساعة، وزاد المرفق إلى ما يقرب من 90٪ من 72 ح في الثقافة. قد يتأثر نجاح مرفق الجنين إلى حد كبير بالجودة الأولية للبلاستوسيست. الأجنة غير المرفقة من قبل 72 ساعة من المرجح أن لا البقاء على قيد الحياة.
في D8 بعد ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد سمح تطوير بروتوكول لزراعة الأجنة البشرية من خلال زرع العلماء لاستكشاف وقت مجهول سابقا في التنمية8,9. هنا، نستخدم نظام ثقافة ممتد لثقافة الأجنة البشرية وندرس التمايز الأرومية المبكر قبل تشكيل المشيمة الزهية. تسمح لنا الطرق الموصوفة هنا بجمع خطوط فرعية مختلفة من السل لاستخدامها في تحليل الخلايا المفردة في المصب. هذا العمل يتيح للمجتمع العلمي فرصة لفهم هذه الفترة الحرجة والغموض في التنمية البشرية، وقد يفتح فرصا جديدة للعلاجات العلاجية للإجهاض أو أمراض المشيمة ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نعترف بالعديد من المرضى في مركز كولورادو للطب التناسلي (CCRM) الذين تبرعوا بكرم أجنةهم للأبحاث. نود أيضا أن نشكر كارين Maruniak والمختبر السريري في CCRM لمساعدتهم في معالجة عينات hCG، وكذلك سو ماكورميك وفريقها السريري IVF علم الأجنة في CCRM لمساعدتهم في جمع الأجنة، وتخزين، وتتبع، وتبرع. وقد قدم التمويل داخلياً من جانب اللجنة المعنية باتفاقية مكافحة التصحر.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| NORM JECT Luer Lock حقنة معقمة | VWR | 53548-019 | عبوة من 100 |
| 3130 أو 3110 حاضنة CO2 مغلفة بالماء | Thermo Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| 35 مم طبق زراعة الأنسجة Corning Primaria | VWR | 62406-038 | علبة 500 |
| مل أنبوب غطاء المفاجئة | VWR | 60819-295 | عبوة من مناديل Corning Primaria مقاس 25 |
| 60 مم طبق ثقافة | VWR | 25382-687 | حالة 200 |
| طبق 6 آبار | Agtech Inc. | عبوة D18 | من محلول التيرود الحمضي 1 أو 10 أو 50 |
| حمضية | Millipore Sigma | T1788 | 100 مل |
| Biotix 1250 & micro ؛ L نصائح الماصة | VWR | 76322-156 | عبوة من 960 |
| انفجار ، وسائط ثقافة الكيسة الأريمية | Origio | 83060010 | 10 مل |
| محلول التخفيف | Kitazato | VT802 | 1 × 4 مل |
| يمكن التخلص منها زجاج البورسليكات باستور Pipets | Thermo Fisher Scientific | 1367820D | 5.75 بوصة. (146 ملم) ؛ 720 / Cs |
| فوسفات Dulbecco المحلول الملحي | المخزن Millipore Sigma | D8537 | |
| زيت البارافين لزراعة الأجنة OvOil | Vitrolife | 10029 | 100 مل |
| أنابيب Eppendorf PCR 0.2 مل | VWR | 47730-598 | عبوة من 1,000 |
| أنبوب Eppendorf PCR 0.5 مل | VWR | 89130-980 | حالة من 500 |
| فيبرونيكتين من البلازما البشرية. محلول سائل .1٪ | Millipore Sigma | F0895 | 1 مجم |
| جيلسون 1 مل Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 200-1000 & micro ؛ L |
| Gilson 20 & micro; L Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 2-20 & micro ؛ L |
| Gilson 200 & micro; L Pipetteman | Thermo Fisher Scientific | F123602G | 1 Pipetteman 50-200 & micro ؛ L |
| G-MOPS مناولة وسائل | الإعلام Vitrolife | 10129 | 125 مل |
| مناولة الوسائط | Origio | 83100060 | 60 مل |
| Ibidi 8 غطاء بغرفة جيدة | Ibidi | 80826 | 15 شريحة لكل صندوق |
| IVC1 / IVC2 | أنظمة توجيه الخلايا | M11-25 / M12-25 | 5-5 مل Aliquots |
| K System T47 لوحة الاحترار | كوبر الجراحية | 23054 | |
| MilliporeSigma Millex مرشحات حقنة معقمة مع غشاء Durapore PVFD | فيشر SLGVR33RS العلمي | عبوة من 50 | |
| قطعة من | الفم التلقيح الاصطناعي Store | MP-001-Y | 100 قطعة |
| طبق بئر مركز Oosafe | OOPW-CW05-1 | حالة من 500 | |
| ميزة Quinn's SPS | Origio | ART-3010 | 12x 12 مل |
| أنابيب مطاطية مطاطية لقطع الفم | متجر أطفال | الأنابيب IVFS-NRL-B-5 | 5 قدم. |
| مجهر مجسم | نيكون | SMZ1270 | |
| نصائح متجرد | كوبر جراحية | MXL3-275 | 20 / عبورة 275 & مايكرو ؛ م |
| محلول الذوبان | Kitazato | VT802 | 2 × 4 مل |
| The Stripper Micropipetter | Cooper Surgical | MXL3-STR | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) ، بدون فينول أحمر | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | 1 × 100 مل |
| Tween20 | Millipore Sigma | P1379-25ML | زجاجة 25 مل |
| VWR 1-20 & micro ؛ أطراف ماصة L | VWR | 76322-134 | عبوة من 960 |
| VWR 1-200 & micro ؛ أطراف ماصة L | VWR | 89174-526 | عبوة من محلول الغسيل 960 |
| Kitazato | VT802 | 1 × 4 مل |
المراجع
- Carter, A. M. Animal models of human placentation--a review. Placenta. , Suppl A 41-47 (2007).
- Carter, A. M., et al. Comparative placentation and animal models: patterns of trophoblast invasion -- a workshop report. Placenta. 27, 30-33 (2006).
- Pijnen....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
