التنبؤ ببتر باستخدام خلايا السلف أحادية النوى في المرضى الذين يعالجون من الأوعية مع الإقفاريات الحرجة

يتميز مرض الشرايين الطرفية (PAD) بانسداد الأوعية الدموية المزمن والتقدمي مع الحد من إمدادات الدم¹. على نطاق عالمي، يؤثر PAD من الأطراف السفلية على حوالي 10٪ من السكان المسنين، في حين يتم تقديم ما يصل إلى 7٪ من هذه الحالات إلى بتر الأطراف^2،3.

يمثل الإقفاريات الحرجة (CLI) العرض الأكثر خطورة لـ PAD¹. المرضى عادة ما تعاني من الألم في الراحة, قرحة, أو الغرغرينا التي تعزى إلى الشرايين انسداد; في حين أن التشخيص السريري غير مواتية وتتميز بـ 30٪ من خطر بتر الأطراف والوفيات خلال 1 سنة^3,4,5.

رأب الأوعية هو إجراء الأوعية الدموية طفيفة التوغل التي يمكن أن تعيد تدفق الدم إلى الطرف السفلي في المرضى الذين يعانون من CLI; ومع ذلك، فإن بعض المرضى تتطلب حتما بتر الأطراف الرئيسية، حتى بعد العلاج بتر الأوعية^1،5. تحديد مبكر من النتائج غير المواتية بعد رأب الأوعية أمر قيم جدا، وذلك بسبب إمكانية إنفاذ العلاج.

قد توفر عوامل الخطر التقليدية قدرة تنبؤية محدودة لبتر الأطراف الرئيسية في المرضى الذين يخضعون لعملية CLI للرأب الوعائي⁶. تمثل المؤشرات الحيوية الموجهة للفيزياء المرضية طرقًا جديدة ذات تطبيقات سريرية محتملة ، والتي قد تؤدي إلى فائدة خاصة في الأمراض المتعلقة بإصابة الأوعية الدموية⁷. في الوقت الحاضر ، ومشاركة السكان الخلوية التي تملك خصائص إصلاح البطانية ، في موقع البلاك تصلب الشرايين ، وقد اعترف بشكل متزايد^8،9.

وتستمد خلايا السلف أحادية النوى (MPCs) من نخاع العظام والخصائص الهيكلية والوظيفية الخاصة من الخلايا الجذعية مع قدرات تجديد الأوعية الدموية. نظرا لقدرة لجنة السياسة النقدية على التكاثر، والهجرة وإظهار الالتزام الأوعية الدموية; وقد أصبحت هذه الخلايا مرشحين جيدين لتعكس إصلاح endothelial ردا على^10،11،12. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاهتمام المستمر بالآليات الكامنة وراء إصابة الأوعية الدموية قد حفز على استكشاف الدور التنبؤي للعلامات الحيوية المحلية التي تحدث ، حيث أنها تعتبر تعكس تلف الأوعية الدموية وإصلاح^7و13و14.

الغرض من هذه الدراسة هو وصف كيفية تحديد كمية ال MPCs التي تنتشر بالقرب من انسداد الأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من CLI يخضع لعملية رأب الأوعية; وكيفية تقييم العلاقة بين اللجان MPCs مع مؤشرات الخلل البطانية وبتر الأطراف.

بالمقارنة مع التكهن على أساس الأمراض المصاحبة وميزات الأوعية الدموية الجوهرية، فإن كمية ال MPCs المحلية تظهر قدرة محددة على التنبؤ بالنتائج السريرية فيما يتعلق بالخلل البطانية وبتر الأطراف. باستمرار، وقد وصفت بعض الدراسات دور التكهن من المؤشرات الحيوية مماثلة أثناء تقييم المرضى الذين يعانون من PAD^15،16.

استناداً إلى النتائج السابقة⁷، قد تكون الطريقة الموصوفة هنا مفيدة لتحديد مبكر للسكان المعرضين لخطر النتائج الوعائية الضارة في العديد من البيئات السريرية ، مثل الأمعاء السفلية والأوعية الدموية والسكتة الدماغية والتهاب الأوعية الدموية والجلطات الوريدية وغيرها التي تنطوي على إصابة الأوعية الدموية وإصلاحها.

وافقت لجنة أخلاقيات البحوث المؤسسية من Centro Médico Nacional "20 de Noviembre" ISSSTE على هذا البروتوكول المحتمل ، وقدم جميع المرضى المسجلين موافقة خطية مستنيرة.

1- تقييم كتلة الأوعية الدموية في الأطراف السفلية، وأخذ عينات الدم، والبلاستيس الوعائي بالون

ملاحظة: عينة الدراسة المستخدمة في هذه التجربة تتألف من 20 مريضا بالسكري، الذين تتراوح أعمارهم بين 68 سنة و 10 من أصل 20 كانوا من الذكور. وكان نصف العينة من المدخنين وكانت معظم الاعتلالات المشتركة السائدة هي مرض السكري من النوع 2، وارتفاع ضغط الدم الشرياني الجهازي و/أو ديسليبيديميا. وكان القصد من هذه العينة أن تكون موحدة بالنسبة للأمراض العمرية والجنس والمراضة المشتركة. التحيز المحتمل بسبب التأثير السريري الديموغرافي على العلاقة بين MPCs وCLI لا يمكن استبعاده.

1. تقييم شدة سريرية من الإقفاريات الطرف وفقا لتصنيف رذرفورد¹³ (انظر الجدول التكميلي 1).
2. إجراء تصوير الأوعية السفلية للأطراف، وأخذ عينات الدم، والورم بالون.
   1. استخدام مضادات التخثر والأدوية المخدرة قبل الجراحة.
   2. ضع إبرة 18 G في الوعاء الدموي في موقع الفخذ المحدد.
   3. وضع مقدم وتقدم سلك دليل مرنة. ثم، يتم تغيير الدليل الأولي لمزيد من المقدم 6 Fr.
   4. استخدام الحقن الدوري من وسائل الإعلام التباين أو CO₂ تحت دليل الفلورسكوب لتحديد مسار الشريان والأوعية الدموية المواقع المسدودة (الشكل 1).
      ملاحظة: استخدام وسائط التباين 40 سم مكعب، المخفف 1:1 في 0.9٪ ملحي، أو CO₂ في 10 إلى 20 مل لكل طلقة في ضغط من 12 psi.
   5. إدخال اثنين من 0.014 الأسلاك دليل الملاحة Fr واثنين من 0.014 أسلاك دليل دعم الأب في السفينة وتقدم لهم حتى الموقع المحظورة.
      ملاحظة: يتم استخدام اثنين من الأسلاك دليل 0.014 Fr (260 سم طويلة) للملاحة واثنين من 0.014 Fr أسلاك دليل (260 سم طويلة) وتستخدم لدعم، خلال إجراء واحد.
   6. إدخال 5 Fr و 3 Fr القسطرة بالتتابع وجمع 10 مل من الدم من أقرب موقع لعرقلة الأوعية الدموية. الحفاظ على عينات الدم على الجليد.
      ملاحظة: قد تكون أحجام القسطرة 5 Fr و 3 Fr، ويتم تغييرها أثناء الإجراء.
   7. تقدم سلك دليل مرة أخرى. ثم، إدخال قسطرة بالون رأب الأوعية، الذي يحتوي على بالون قابل للنفخ يقع في نهاية القسطرة. تقدم قسطرة بالون رأب الأوعية ووضع الحق في البالون في موقع الآفة. قم بإجراء عملية رأب الأوعية عن طريق نفخ البالون ضد لوحة الحجب الموجودة في جدار الأوعية الدموية. تحقق من استعادة تدفق الدم.
      ملاحظة: قد توضع الدعامة في المنطقة المحجوبة للمساعدة في إبقاء الشريان مفتوحًا بعد الإجراء.
   8. إدخال قسطرة والتقدم حتى أقرب موقع إلى كتلة الأوعية الدموية. جمع 10 مل من الدم في 30 دقيقة الفاصل الزمني بعد رأب الأوعية. الحفاظ على عينات الدم على الجليد.
      ملاحظة: يوصى بجمع عينات الدم قبل وبعد رأب الأوعية لتقييم تأثير رأب الأوعية على عدد الـMPCs.
   9. إزالة جميع الأسلاك تحت التوجيه الفلوري.
   10. توفير إجراءات الرعاية بعد العملية الجراحية، بما في ذلك العلاج المضاد للتخثر باستخدام اليناكسابارين في 1 ملغ/ كغ تحت الجلد كل 12 ساعة، والأسبرين 100 ملغ، الستاتين، والتخويل. ضغط في موقع ثقب الأوعية الدموية خلال 24 ساعة.

2. القياس الكمي ل الخلايا أحادية النوى السلف (MPCs) (الشكل 2)

1. إلى أنبوب مخروطي جديد 15 مل، نقل 6 مل من الدم الذي تم جمعه وتمييع 1:1 (v/v) مع برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: معالجة الدم في غضون 1 ساعة من جمع.
2. الاستعداد لفصل التدرج الكثافة، عن طريق إضافة 2 مل من متوسطة التدرج الكثافة إلى 3 أنابيب الاختبار لكل منهما. ثم، إضافة 3 aliquots حجم متساو من الدم المخفف في كل أنبوب الاختبار.
   ملاحظة: لا تتجاوز ثلاثة أرباع قدرة أنبوب الاختبار القصوى.
3. أجهزة الطرد المركزي عند 1,800 x ز لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية. جمع طبقة واجهة الحاضر كخاتم باستخدام ماصة، ونقلها إلى أنبوب جديد. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني وتدور في 1800 س ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. حفظ بيليه لأن هذا سوف تحتوي على MPCs.
4. اغسل الكريه التي تحتوي على الـ MPCs مع PBS بواسطة الطرد المركزي كما هو موضح في الخطوة 2.3. استخدام برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل وتدور في 1800 س ز لمدة 2 دقيقة في 4 °C. كرر العملية لمدة 6 مرات.
5. بعد الغسيل الأخير، استخدم 1 مل من برنامج تلفزيوني لإعادة تعليق بيليه الخلية. تمييع 20 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 20 ميكرولتر من 0.4٪ trypan الأزرق، 1:1 (v/v). استخدم 10 ميكرولتر من هذا التعليق الخلوي لعد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت والمجهر الخفيف.
6. Aliquot 1 × 10⁶ MPCs في أنابيب 5 ml تدفق سابقا.
   ملاحظة: إعداد الأجسام المضادة المطابقة لـ isotype.
7. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 1800 س ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. التعرق وتجاهل المابير.
8. تخفيف الأجسام المضادة الأولية في 100 ميكرولتر من محلول حضانة الأجسام المضادة [1X PBS، pH 7.4، EDTA 2 mM، BSA 0.05٪] وإضافة إلى الأنبوب. Resuspend لمدة 10 ق واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية، في الظلام.
   ملاحظة: كانت التركيزات النهائية للأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذا البروتوكول CD45 1:50، CD34 1:20، KDR 1:50، CD184 1:20، CD133 1:50. ويمكن وقف البروتوكول في هذه الخطوة عن طريق تحديد الخلايا الليمفاوية في 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني وتخزين عينات تصل إلى 24 ح في 4 درجة مئوية.
9. أجهزة الطرد المركزي في 1800 × ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية والتخلص من الفائق. Resuspend في 500 ميكرولتر من 1X PBS، وhH 7.4، EDTA 2 mM.
10. إجراء تحليل تدفق قياس الثغرات.
    1. إعداد الخلفية مع الأجسام المضادة التحكم المتطابقة مع الأيزوتايب. ثم، في مؤامرة FSC / SSC حدد الخلايا الليمفاوية تنتشر، في محاولة لاستبعاد الحطام الخلوي، الحبيبات المتبقية، والجسيمات الأخرى. ويعتبر هذا التوزيع 100٪.
       ملاحظة: تنتشر الخلايا الليمفاوية عادة في المنطقة اليسرى السفلى من المؤامرة.
    2. استخدام بوابة مع النمط المناعي المشترك الذي يحتوي على عدد كبير من الخلايا CD45⁺ وD34⁺. ثم، حدد للنوعات المناعية الإيجابية المزدوجة باستخدام البوابة التي تم تحديدها سابقا CD45⁺، CD34⁺، وإضافة إما KDR (VEGFR -2)⁺، CD133⁺ أو CD184⁺. تحديد الأسطح الفرعية لـ MPCs بواسطة علامات سطح الخلايا المحددة الخاصة بها. تقرير كنسبة مئوية من الأحداث المسورة.
11. تحديد السكان الفرعيين الرئيسيين للبلدان المُمَكِّلة. في هذه الدراسة كانت النماذج المناعية التي تم تحليلها CD45⁺CD34⁺CD133⁺; CD45⁺CD34⁺CD184⁺؛ CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺؛ CD45⁺CD34⁺KDR⁺؛ CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD133⁺ وDD45⁺CD34⁺KDR⁺CD184^7،17.
    ملاحظة: تم استخدام علامات سطح الخلية هذه للدراسة: CD45 (الخلايا اللمفاوية)، CD34 (الخلايا البطانية و /أو الأوعية الدموية)، KDR (VEGFR-2) (علامة غشاء الخلايا البطانية)، CD133 (خلايا السلف البطانية) وCD184 (الخلايا الجذعية الدموية والخلايا البطانية).

3- علاقة المراكز الميكرفة مع تعديل الوظيفة البطانية واختبار الديناميكا الدموية (FMD)

1. تحديد تمدد بالتدفق (FMD)، قبل وما بعد رأب الأوعية.
   1. استخدم محول خطي في الأوعية الدموية لقياس قطر الشريان العضدي.
   2. ضع الكفة من مقياس ضغط الدم فوق موقع القياس في الساعد و insufflate في 50 مم زئبق فوق ضغط الدم الانقباضي لمدة 5 دقائق وفرغ.
   3. تحديد مرة أخرى قطر الشريان العضدي في غضون 60 ثانية المقبلة. استخدم المعادلة أدناه لتقدير الـ إف إم إند.
      ملاحظة: حساب درجة توسيع نطاق استخدام المعادلة (٪ = (أقصى قطر بعد نقص التروية عابرة - قطر القاعدي) × 100 / قطر القاعدي.
2. ربط عدد الـ MPCs بقيمة الـ FMD الأساسية ودلتا ما بعد رأب الأوعية من الـ FMD.

4- القدرة التنبؤية للبلدان غير الممَرَكَة على بتر الأطراف

1. جدولة مواعيد طبية دورية بعد رأب الأوعية بالون والتفريغ المريض, لتقييم نوعية تدفق الدم إلى الطرف السفلي.
2. تقييم الخطورة السريرية لاقفارية الأطراف في 2 أسابيع بعد رأب الأوعية. تقييم حل آلام الراحة، انخفاض نقص التروية، والحفاظ على القدم الوظيفية، وفقا لتصنيف روثرفورد¹³.
3. قارن الشدة السريرية لاقفوية الأطراف، في خط الأساس مقابل المتابعة. تحديد الحالات التي تتطلب بتر كبير بسبب نتائج غير مواتية.
4. ربط عدد الـMPCs مع نسبة المرضى الذين يحتاجون إلى بتر كبير في الطرف السفلي.

وتم جمع عينات دم من الشرايين المسدودة، في الموقع الذي تم تناوله من أجل رأب الأوعية، من 20 مريضاً بالسكري، يبلغ عمرهم 68 عاماً، و10 من أصل 20 من الذكور. وكان نصف عينة السكان من المدخنين. وكانت الآفات الوعائية أساسا كما سجل روثرفورد الدرجة السادسة; في حين أظهر المرضى ارتفاع معدل انتشار مرض السكري من النوع 2 (100٪)، وارتفاع ضغط الدم (70٪) وعسر الدم (55٪).

30 يوما من المتابعة السريرية بعد أن أجريت عملية رأب الأوعية في الأطراف السفلية. نسبة السكان الفرعية لجنة السياسة النقدية في خط الأساس أو ديناميات بعد رأب الأوعية كانت مرتبطة (تحليل سبيرمان) مع درجة الخلل البطانية، كما تم تقييمها من قبل مرض الوفيات النفاسية; وتمت مقارنة العدد الأساسي لـ MPCs بين المرضى الذين يخضعون، أو لا يخضعون، لبتر الأطراف بعد رأب الأوعية (U-Mann Whitney). وأظهرت الدراسة أن السكان الفرعية MPCs الأساسية CD45+CD34+KDR+ يرتبط سلبا مع الوفيات الواماضية(الشكل 3A، اليسار) ، في حين أن تغيير MPCs CD45+CD34+CD133+CD184+ + بعد رأب الأوعية يرتبط بشكل كبير مع تحسن FMD(الشكل 3B، والحق). وعلاوة على ذلك، لوحظت زيادة في عدد خط الأساس من السكان الفرعية للبلدان المم بي سي CD45+CD34+KDR+ (الشكل 4A, B, اليسار) في المرضى الذين تطوروا إلى بتر الأطراف; فضلا عن الحد بعد قسطرة من MPCs سوبكيشن CD45+CD34+CD133+CD184+ (الشكل 4A, C, حق).

الشكل 1: تصوير الأوعية السفلية للأطراف السفلية وجمع الدم. (أ)مسار الأوعية الدموية التي تشهد عليها وسائل الإعلام على النقيض من ذلك تحت المنظار الفلوري. (ب) انسداد الأوعية الدموية قبل رأب الأوعية. (ج)انسداد الأوعية الدموية بعد رأب الأوعية. (د)يستخدم جراح الأوعية الدموية قسطرة لجمع الدم من أقرب مكان إلى انسداد الأوعية الدموية ولوحة تصلب الشرايين، والباحث مختبر مستعد للحصول على عينة الدم. الأسهم تشير إلى موقع العوائق الوعائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إعداد عينة الدم وتحديد الخلايا السلف أحادية النوى. (A)إعداد التدرج الكثافة. (B) الخلايا الليمفاوية حلقة الفصل بعد الطرد المركزي في الدم. (ج) جمع المرحلة اللمفاوية. (D) الطرد المركزي. (E) تشكيل بيليه في الجزء السفلي من أنبوب الاختبار. (F)عدد تعليق الخلية. (G) إعداد الخلايا الليمفاوية لتدفق الخلايا. (H) تحديد الخلايا الفرعية حسب عملية استئصال الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: علاقة البلدان الجزرية المتعددة المدى بالمؤشرات الديناميكية الدموية. (أ) موقف الموجات فوق الصوتية للحصول على الـ FMD والنتائج التمثيلية. (B) العلاقة بين الاكتظاظ الفرعي ٪MPCs (يسار، CD45+CD34+KDR+؛ يمين، CD45+CD34+CD133+CD184+) وقيم الـ FMD الأساسية؛ فضلا عن العلاقة بين (C) ٪ MPCs بعد رأب الأوعية مع تحسن الـ FMD بعد رأب الأوعية. اختصر: MPCs, خلايا السلف أحادية النوى; FMD، تمدد بوساطة التدفق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الـ MPCs والتكهن ببتر الأطراف السفلية بعد رأب الأوعية. (A) ممثل تدفق الصور العملية الخلايا من القسام MPCs الفرعية. (B)اقتران التجمّع الفرعي ٪MPCs (يسار، CD45+CD34+KDR+؛ يمين، CD45+CD34+CD133+CD184+) ، أو (C) ٪ MPCs بعد رأب الأوعية ، مع بتر الأطراف السفلية بعد رأب الأوعية ، خلال متابعة لمدة 30 يومًا. اختصار: MPCs، خلايا السلف أحادية النوى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: تصنيف روثرفورد لشدة الإقفاريات الطرفية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.