مقالة منهجية

عزل الإكسوسوم بعد العلاج بالموجات الصدمية في المختبر

1.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/61508

⸱

سبتمبر 10, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Medical University Innsbruck, 2Institute of Clinical and Functional Anatomy, Innsbruck Medical University

في هذه المقالة

ملخص

يتم إطلاق الإكسوسومات عند تطبيق موجات الصدمة في المختبر. هنا ، نصف كيفية تطبيق الموجات الصدمية على الخلايا البطانية المستنبتة ثم عزل الإكسوسومات لمزيد من التحقيق.

الملخص

يتم تطبيق العلاج بالموجات الصدمية بشكل روتيني في مؤشرات العظام بما في ذلك اعتلال الأوتار مثل التهاب اللقيمة الجانبي (مرفق التنس) والتهاب وتر العرقوب (نتوءات الكعب) بالإضافة إلى الجروح والعظام غير القابلة للشفاء. على الرغم من الأمراض المختلفة ، فإن الجمع بين التأثير الوعائي والمضاد للالتهابات للعلاج بالموجات الصدمية يؤدي إلى تجديد الأنسجة الرخوة والعظام. في أكثر من 30 سنوات من التطبيق السريري, لم يلاحظ أي آثار جانبية. علاوة على ذلك ، كشفت الأبحاث الأساسية عن تأثيرات متجددة على عضلة القلب الإقفارية.

في عمل سابق ، تمكنا من إظهار أن الحافز الميكانيكي للخلايا المستنبتة يترجم عبر إطلاق الإكسوسوم إلى استجابة بيولوجية. ومع ذلك ، لا يزال يتعين توضيح الآلية الدقيقة. يعد الاقتران الميكانيكي أمرا بالغ الأهمية عند تطبيق العلاج بموجات الصدمة حيث يمكن حتى لفقاعات الهواء الصغيرة امتصاص موجات الصدمة. طريقة الحمام المائي الموصوفة سابقا هي طريقة صالحة لضمان تطبيق موجة الصدمة بشكل مناسب وقابل للتكرار في المختبر.

تمكنا من تطوير بروتوكول ممكن وقابل للتكرار لعزل الإكسوسومات من الخلايا المستنبتة بعد تطبيق موجات الصدمة. وبذلك نظهر إمكانية دراسة الآليات الأساسية للنقل الميكانيكي بالإضافة إلى الإمكانات التجديدية والأوعية الدموية للإكسوسومات التي تطلقها موجة الصدمة.

المقدمة

موجات الصدمة (SW) هي موجات ضغط صوتي تظهر في الطبيعة عندما يتم إطلاق كمية كبيرة من الطاقة في فترة زمنية قصيرة (على سبيل المثال ، الرعد مع البرق). في الروتين السريري ، تستخدم موجات الصدمة في تفتيت الحصوات لتفكيك حصوات الكلى دون آثار جانبية ذات صلة لأكثر من 30 عاما1،2. عن طريق الصدفة ، لوحظ سماكة في العظم الحرقفي في الأشعة السينية بعد تفكك حصوات الكلى. قدمت هذه الملاحظة الأساس للبحث في اضطرابات شفاء العظام وأدت إلى العلاج في الاتحادات غير العظمية الطويلة3،4،5.

تم توسيع مؤشرات العلاج بالموجات الصدمية واليوم هي الطريقة قيد الاستخدام السريري الروتيني في مؤشرات العظام بما في ذلك اعتلال الأوتار مثل التهاب اللقيمة الجانبي (مرفق التنس) والتهاب وتر العرقوب (نتوءات الكعب)6،7. علاوة على ذلك ، أظهرت الأبحاث الأساسية إمكانات عالية لتوليد الأوعية الدموية للعلاج بالموجات الصدمية (SWT). في ذلك ، أظهرت دراسة زيادة في عوامل النمو الوعائية مثل VEGF (عامل النمو البطاني الوعائي ) و PIGF (عامل نمو المشيمة) و FGF (عامل النمو البطاني الوعائي ) على SWT متبوعا بتكوين الأوعيةالدموية 8.

للتحقيق في الدور المفيد المحتمل لتكوين الأوعية الناجمة عن موجات الصدمة في أمراض أخرى ، قمنا بتطبيق علاج SW في نموذج حيواني لمرض القلب الإقفاري9،10. بعد إظهار التأثير التجديدي في عضلة القلب الإقفارية ، يمكننا تحديد الدور الذي لا غنى عنه للمستقبل المناعي الفطري TLR 3 (Toll مثل المستقبل 3) عند العلاج بالموجات الصدمية11،12. أظهرت دراسات أخرى أن الحافز الميكانيكي للعلاج ب SW يترجم إلى إشارة بيولوجية عن طريق إطلاق الإكسوسوم. بالمقارنة مع الإكسوسومات التي يتم إطلاقها من الناحية الفسيولوجية من الخلايا البطانية ، تحتوي الإكسوسومات التي يتم إطلاقها عند SWT على شحنة متزايدة من الحمض النووي الريبي الميكرو المسبب للأوعية. تم حقنه في عضلة القلب الإقفارية ، وأطلق SWT الإكسوسومات المستحثة على التجدد13.

نظرا لأن الهواء يمتص SW ، فإن الاقتران المثالي بين القضيب وقوارير زراعة الخلايا أمر بالغ الأهمية. يمثل الحمام المائي القياسي طريقة مجدية لتطبيق SWT في المختبر وإعداد تجريبي قابل للتكرار. من أجل تجنب انعكاس الأمواج وبالتالي تداخل الأمواج ، يقوم ممتص على شكل إسفين بتدمير الموجات الأولية التي تمتد إلى الجزء الخلفي من الحمام المائي. لهذا السبب ، نوصي بتطبيق موجات الصدمة في المختبر باستخدام الحمام المائي الموصوف فقط.

في هذا البروتوكول ، نصف تطبيق موجات الصدمة في المختبر لإطلاق الإكسوسومات الوعائية في المادة الطافية. يوفر هذا البروتوكول إمكانية التحقيق في دور الإكسوسومات في النقل الميكانيكي وهو الأساس لمزيد من التحقيق في إطلاق الإكسوسوم عند SWT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على الخلايا البطانية للوريد السري البشري من العمليات القيصرية في قسم أمراض النساء. لذلك ، تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى. تم منح الإذن من لجنة الأخلاقيات بجامعة إنسبروك الطبية (لا. UN4435).

ملاحظة: اعمل تحت غطاء تدفق رقائقي معقم لتجنب التلوث.

1. 24 ساعة قبل التجربة

  1. قم بإعداد وسط نمو البطاني الخالي من الإكسوسوم عن طريق مصل بقري الجنين بالطرد المركزي الفائق (FCS) عند 4 درجات مئوية و 120,000 × جم طوال الليل.
  2. قم بتغطية قارورة زراعة الخلايا بمساحة 75 سم مربع باستخدام 10٪ جيلاتين.
  3. بذر الخلايا البطانية البشرية في قارورة زراعة الخلية باستخدام وسط النمو البطاني.
    يوم التجربة:
    ملاحظة: 4 لتر من ddH2O ، FCS خال من الإكسوسوم ، متوسط قاعدي لنمو الخلايا البطانية و PBS إلى 37 درجة مئوية.

2. تحضير تطبيق العلاج بالموجات الصدمية

  1. قم بإعداد وسط نمو البطاني الخالي من الإكسوسوم عن طريق إضافة مكملات غذائية من المجموعة التجارية (على سبيل المثال ، Bullet Kit) وإضافة FCS خالية من الإكسوسوم بالطرد المركزي بدلا من FCS الشائعة إلى وسط النمو البطاني.
  2. املأ حماما مائيا بحوالي 3.5 لتر من 37 درجة مئوية دافئة مسبقا ddH2O.
  3. قم بتوصيل قضيب SW بالحمام المائي.
  4. تحديد معلمات المعالجة (كثافة تدفق الطاقة ، تردد النبض) على جهاز SW. نوصي ب 500 نبضة بكثافة تدفق طاقة تبلغ 0.07 مللي جول / مم² وتردد 5 هرتز.

3. تطبيق موجة الصدمة

  1. مسح قابلية الخلية للحياة من خلال المظهر المورفولوجي وكثافة الخلايا البطانية عبر المجهر باستخدام تكبير إجمالي 100x. استخدم قوارير ذات التقاء مرتفع لزيادة كمية الإكسوزومات فقط.
  2. استبدل وسط الخلية البطانية بعناية بحوالي 250 مل من PBS لملء القارورة بالكامل وقمع كل الهواء المتبقي.
  3. استخدم البارافيلم أو أغطية محكمة الإغلاق لإغلاق القارورة.
  4. أمسك قارورة زراعة الخلية في وضع رأسي داخل حمام مائي مع الجانب المغطى بالخلية مقابل جهاز SW. تأكد من أن مسافة القارورة إلى القضيب تتماشى مع العلامة المشار إليها. بالنسبة لجهاز Orthowave 180c ، استخدم مسافة من 10 سم.
  5. استخدم 250 دفعة من علاج SW إلى النصف السفلي من قارورة زراعة الخلايا.
  6. أدر القارورة 180 درجة واستخدم 250 نبضة إلى النصف العلوي من قارورة زراعة الخلية.
  7. بعد ذلك ، قم بإزالة ختم القارورة واستبدل PBS ب 15 مل من وسط النمو البطاني ب FCS خال من الإكسوسوم.
  8. استزراع الخلايا المثابرة في وسط خال من الإكسوسوم لفترة مناسبة لإعداد التجربة. يمكن جمع أكبر كمية من الإكسوسومات بعد 4 ساعات من العلاج SW (الشكل 1).
    ملاحظة: في المجموعة التي يتم تشغيلها بشكل زائف ، تخضع قوارير زراعة الخلايا لنفس العلاج (انظر القسم أعلاه) دون استخدام علاج SW.

4. عزل الإكسوسومات

  1. انقل المادة الطافية إلى أنبوب تجميع وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و 300 × جم لمدة 10 دقائق. تزيل هذه الخطوة جميع الخلايا الموجودة في المادة الطافية.
  2. لإزالة بقايا الخلية ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و 3,000 × جم لمدة 20 دقيقة.
  3. صفي المادة الطافية من خلال مرشح 200 نانومتر في أنبوب طرد مركزي لإزالة أجسام موت الخلايا المبرمج.
  4. طافي مفلتر بجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية مع 120،000 × جم لمدة 70 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الإكسوسوم مع 300 ميكرولتر من PBS.
    1. نظرا لأن حبيبات الإكسوسومات غير مرئية بعد الطرد المركزي الفائق ، فقم بتدوير أنبوب الطرد المركزي الفائق لمدة 30 ثانية للتأكد من إعادة تعليق حبيبات الإكسوزوم. اضبط حجم PBS للاحتياجات التجريبية والمزيد من التجارب.
  5. قم بتخزين الإكسوزومات المعلقة عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا بعد نقل المادة الطافية إلى أنبوب تجميع أو قبل الطرد المركزي الفائق عن طريق تجميد المادة الطافية عند -80 درجة مئوية.

5. المزالق

  1. تأكد من توصيل قضيب SW بإحكام بالحمام المائي. يمكن أن يؤدي الاتصال غير المكتمل إلى تسرب حمام مائي.
  2. تأكد من وجود مسافة دقيقة من القارورة إلى القضيب للاستفادة من نفس القدر من كثافة تدفق الطاقة إلى قوارير مختلفة.
  3. ضع علامة على قوارير زراعة الخلايا التي خضعت للعلاج SW وقوارير زراعة الخلايا التي كانت عينات التحكم.
  4. قوارير جافة قبل إعادتها إلى الحاضنة لتجنب التلوث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام البروتوكول الموصوف ، قمنا بإخضاع الخلايا البطانية البشرية (HUVECs) وكذلك الخلايا البطانية للشريان التاجي البشري (CAECs; PromoCell) للعلاج بالموجات الصدمية (على سبيل المثال ، Orthowave 180c). تم قياس الحويصلات التي تم إطلاقها عن طريق تحليل تتبع النانو (NTA). وبالتالي ، يمكننا ملاحظة زيادة في إطلاق الحويصلة الدقيقة عند علاج SW (الشكل 1أ ، ب). كشف تصوير HUVECs المنبعثة عن الحويصلات المنبعثة عبر المجهر الإلكتروني للإرسال عن الحجم المميز البالغ 100 نانومتر للإكسوسومات (<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في العديد من الأعمال البحثية الأساسية ، يمكن إثبات التأثير التجديدي للعلاج بالموجات الصدمية ويتم تطبيقه بشكل روتيني في مؤشرات العظام3،4،5. في النماذج الحيوانية المتنوعة ، يمكن إثبات التأثير التجديدي على عضلة القلب الإقفارية ويؤدي إلى بدء تجربة CAST-HF9،10. تهدف هذه التجربة العشوائية ذات الشواهد إلى تقييم فائدة العلاج المباشر بموجات الصدم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

JH و MG مساهمتان في Heart Regeneration Technologies GmbH ، وهي شركة فرعية تابعة لجامعة إنسبروك الطبية تهدف إلى تعزيز العلاج بموجات الصدمة القلبية (www.heart-regeneration.com). جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة بحثية غير مقيدة من AUVA إلى JH و CGT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قوارير زراعة الخلايا  Cellstar  65817075 سم < سوب > 2 < / سوپ >
جمع أنابيب & ndash ؛ فالكون تيوبكورنينج  352070
نمو الخلايا البطانية متوسطة-2 BulletKit  Lonza  CC-3162
الخلايا البطانية الوسط القاعدي  LonzaCC-3121
مصل الأبقار الجنينية  سيجما  F0804
Parafilm  Pechiney  PM996
فوسفات مخزن مالحgibco  14190-904
قضيب الموجات الصدميةMTS Orthowave 180c< / em>
نمو

المراجع

  1. Pearle, M. S., et al. Shock-wave lithotripsy for renal calculi. The New England Journal of Medicine. 367 (1), 50-57 (2012).
  2. Chaussy, C., Brendel, W., Schmiedt, E. Extracorporeally Induced Destruction of Kidney Stones By Shock Waves. Lancet. 316 (8207), 1265-1268 (1980).
  3. Valchanou, V. D., Michailov, P. High energy shock waves in the treatment of delayed and nonunion of fractures. International Orthopedics. 15 (3), 181-184 (1991).
  4. Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39 (6), 529-532 (1992).
  5. Moretti, B., et al. Bone healing induced by ESWT. Clinical Cases in Mineral and Bone Metabolism. 6 (2), 155-158 (2009).
  6. Romeo, P., Lavanga, V., Pagani, D., Sansone, V. Extracorporeal shock wave therapy in musculoskeletal disorders: A review. Medical Principles and Practice. 23 (1), 7-13 (2014).
  7. Schaden, W., et al. Shock Wave Therapy for Acute and Chronic Soft Tissue Wounds: A Feasibility Study. Journal of Surgical Research. 143 (1), 1-12 (2007).
  8. Holfeld, J., et al. Low energy shock wave therapy induces angiogenesis in acute hind-limb ischemia via VEGF receptor 2 phosphorylation. PLoS One. 9 (8), 1-7 (2014).
  9. Zimpfer, D., et al. Direct epicardial shock wave therapy improves ventricular function and induces angiogenesis in ischemic heart failure. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 137 (4), 963-970 (2009).
  10. Holfeld, J., et al. Epicardial shock-wave therapy improves ventricular function in a porcine model of ischemic heart disease. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 1057-1064 (2016).
  11. Holfeld, J., et al. Toll-like receptor 3 signaling mediates angiogenic response upon shock wave treatment of ischemic muscle. Cardiovascular Research. 109 (2), 331-343 (2016).
  12. Tepeköylü, C., et al. Shockwaves prevent from heart failure after acute myocardial ischemia via RNA/protein complexes. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (4), 791-801 (2017).
  13. Gollmann-Tepeköylü, C., et al. miR-19a-3p containing exosomes improve function of ischemic myocardium upon shock wave therapy. Cardiovascular Research. , (2019).
  14. Pölzl, L., et al. Safety and efficacy of direct Cardiac Shockwave Therapy in patients with ischemic cardiomyopathy undergoing coronary artery bypass grafting (the CAST-HF trial), Study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 21 (1), 1-10 (2020).
  15. Holfeld, J., et al. Shock wave application to cell cultures. Journal of Visualized Experiments. (86), e51076(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة