الكشف بالعين المجردة عن الطفرات النقطية النادرة في الحمض النووي

ملخص

يسمح هذا البروتوكول بتحديد الحمض النووي المتحور بالعين المجردة في زيادة 200 ضعف من جزيئات الحمض النووي من النوع البري ، من خلال استغلال جزيئات الذهب النانوية والجسيمات الدقيقة المغناطيسية.

الملخص

يصف البروتوكول اختبارا لونيا بالعين المجردة للكشف عن طفرات النقاط الجسدية في فائض من الحمض النووي من النوع البري. التطبيق المستقبلي المتوقع لهذه الطريقة هو تحديد الطفرات النادرة في الحمض النووي الخالي من الخلايا المنتشرة من الخزعات السائلة ، مع أهمية في تشخيص السرطان والتقسيم الطبقي لمرضى الأورام للعلاج الشخصي. كدليل على المفهوم ، تم تصميم الاختبار للكشف عن طفرة BRAF^V600E في جين BRAF ، وهو أمر مهم لتحديد المجموعة الفرعية لمرضى الورم الميلانيني الذين يمكنهم الاستفادة من العلاجات المستهدفة بمثبطات BRAF. ومع ذلك ، يمكن تعميم هذا الاختبار اللوني بسهولة على الطفرات الجسدية الأخرى ذات الصلة السريرية بسبب استخدام مجسات الكشف الشاملة ، مما يوفر إمكانات قوية في تشخيص الأورام.

يكتشف الاختبار 0.5٪ من BRAF^V600E في فائض من BRAF^WT DNA ، والذي يطابق حساسية بعض فحوصات الأدوات التجارية. هذه الحساسية ذات صلة سريريا لأغراض التشخيص ، مما يسمح بالتعرف المبكر على المرضى الحساسين للأدوية. على عكس المقايسات التجارية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، يتطلب هذا الاختبار الحد الأدنى من الأجهزة والمعالجة ، حيث يمكن إجراؤه على الحمض النووي المضخم باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي (أو تقنيات متساوية الحرارة) ويوفر قراءة بالعين المجردة مع تفاعل أنبوب واحد لبضع خطوات في ساعة واحدة فقط. في الوقت الحاضر ، تم استخدام الاختبار فقط على عينات الحمض النووي الاصطناعية. ومع ذلك ، فقد تم تصميم هذا الأخير لتقليد عينة حقيقية تم تضخيمها من الحمض النووي الخالي من الخلايا المنتشرة ، لصالح ترجمة الاختبار إلى التشخيص السريري.

المقدمة

الغرض من الطريقة هو اكتشاف الطفرات النقطية الممثلة تمثيلا ناقصا في عينة الحمض النووي باستخدام منهجية قليلة الأدوات وقراءة بالعين المجردة. الهدف النهائي هو الحصول على اختبار إثبات المبدأ ، مناسب للتطبيقات المستقبلية في الاختبارات السريعة للكشف عن الطفرات الجسدية في الحمض النووي الخالي من الخلايا المنتشرة (ccf-DNA) (على سبيل المثال ، من عينات خزعة الدم) للتشخيص المبكر ومراقبة السرطان¹. تمثل الطفرات الجسدية المرتبطة بالسرطان مؤشرا حيويا مهما للسرطان² وهي موجودة في جزء بسيط (ولكنه متغير للغاية⁾³ من ccf-DNA ، مما يجعل تحديدها صعبا⁴. اخترنا ، كهدف نموذجي ، الطفرة المسرطنة BRAF^V600E التي تسبب التنشيط التأسيسي ل BRAF kinase. هذه الطفرة موجودة في 80٪ من جميع أنواع BRAF المتحولة⁵ ويتم تمثيلها بشكل عام في <1٪ فقط من الحمض النووي للورم^{المنتشر 6}. يعد تحديد المرضى الذين يحملون هذه الطفرة أمرا مهما لأنه ينبئ بالاستجابة العلاجية لمثبطات BRAF. لذلك ، تم تطوير عدة طرق^7،8،9،10 لتقييم حالة طفرة BRAF ، مع حساسيات تتراوح من 0.01٪ إلى 2٪.

الميزة الرئيسية لهذه الطريقة على أحدث الطرق هي أن اكتشافها خال من الأدوات (بالعين المجردة) ، على عكس الكشف الآلي عن جزيئات الفلورسنت عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. ميزة أخرى هي كفاءته في تمييز جزيء DNA متحور واحد في ما يزيد عن 200 جزيء من الحمض النووي من النوع البري. عامل التمييز هذا البالغ 0.5٪ أعلى^{من 11} أو يطابق¹² معامل بعض المجموعات المختبرية أو المتاحة تجاريا ، بناء على الكشف الآلي ، وبالتالي فهو مناسب لتطبيقات التشخيص السريري. من ناحية أخرى ، كاختبار نموذجي مختبري ، تعتمد الطريقة على التحكم اليدوي في الخطوات الحساسة لدرجة الحرارة. ومع ذلك ، فإن عدد الخطوات والمدة الإجمالية للفحص محدودة ، مما يجعل تنفيذه في المستقبل في أنظمة الموائع الدقيقة الآلية أمرا ممكنا.

تم تطوير طريقة إثبات المفهوم هذه باستخدام جزيئات الحمض النووي الاصطناعية. من أجل ترجمته الفعالة إلى العيادات ، يجب التحقق من صحته باستخدام عينات من العالم الحقيقي تم تضخيمها من خزعات دم المرضى. نلاحظ أن مجال التطبيق المستقبلي للطريقة لا يقصد به أن يكون التحليل المباشر للمصفوفات البيولوجية المعقدة غير المعالجة ، مثل سوائل الجسم. من الأخير ، يجب استخراج الحمض النووي بمنهجيات قياسية ، ثم تضخيمه وتنقيته. وبالتالي ، فإن المادة الأولية للتحليل ستكون دائما منقاة وتضخيم الحمض النووي ، والذي يمكن مقارنته بشكل معقول ، من حيث المواد المسببة للتدخل المحتملة ، بعينة الحمض النووي الاصطناعية ، مثل تلك المستخدمة لتطوير هذه الطريقة.

البروتوكول

1. تخليق مجسات الجسيمات النانوية للذهب

1. قم بتصنيع جزيئات الذهب النانوية المغطاة بالسترات 40 نانومتر ، باستخدام طريقة نمو البذر القياسية المكونة من خطوتين كما هو مفصل أدناه.
   1. قم بتجميع جسيمات الذهب النانوية المغطاة بالسترات 15 نانومتر (بذور AuNPs) باستخدام طريقة Turkevich-Frens الكلاسيكية^13،14.
      1. اغسل جميع الأواني الزجاجية باستخدام أكوا ريجيا (HCl: HNO₃ بنسبة 3: 1 v / v).
      2. سخني 250 مل من 0.25 ملي HAuCl₄ حتى يغلي مع التحريك بشكل موحد.
         تنبيه: HAuCl₄ مادة أكالة وسامة.
      3. أضف على الفور 25 مل من 38.8 ملي Na₃∙citrate.
      4. استمر في الغليان والتقليب لمدة 30 دقيقة ، بينما يتحول المحلول إلى لون الياقوت الأحمر.
      5. ارفعي المحلول عن النار واتركيه يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة مع التحريك.
      6. تصفية باستخدام مرشحات حقنة غشائية PTFE 0.22 ميكرومتر.
      7. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في زجاجة.
         ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا.
   2. قم بتصنيع جسيمات الذهب النانوية المغطاة بالسترات 40 نانومتر (40 نانومتر AuNPs) عن طريق نمو البذر¹⁵.
      1. تحضير المحلول أ: 390 ميكرولتر من كبريتات الهيدروكسي لامين الطازجة 0.1 M مع 13 مل من بذور AuNP بحجم إجمالي 120 مل في H₂O.
         ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية بذور AuNPs اللازمة للحصول على الحجم المطلوب. يجب معايرتها لكل مخزون بذور جديد من AuNPs.
         تنبيه: كبريتات الهيدروكسي لامين مادة أكالة وسامة ومطفرة وخطرة على البيئة. للمناولة: يغسل جيدا بعد المناولة. قم بإزالة الملابس الملوثة وغسلها قبل إعادة استخدامها. استخدم مع تهوية كافية. تقليل توليد الغبار وتراكمه. تجنب ملامسة العينين والجلد والملابس. احتفظ بالحاوية مغلقة بإحكام. تجنب استنشاق الغبار. لا تستخدمه مع ملعقة معدنية أو أشياء معدنية أخرى. للتخزين: يحفظ في وعاء مغلق بإحكام. يحفظ في مكان بارد وجاف وجيد التهوية بعيدا عن المواد غير المتوافقة. الابتعاد عن المعادن.
      2. تحضير المحلول ب: 12.25 مل من H₂O + 0.25 مل من 0.1 M HAuCl₄.
      3. قم بتحميل المحلول B في حقنة وقم بتحميل المحقنة في مضخة حقنة.
      4. اضبط معلمات مضخة الحقنة: قطر المحقنة بالمليمتر ؛ معدل التدفق: 90 مل / ساعة ؛ الحجم الإجمالي: 10.80 مل (منها 0.8 مل هي الفائض اللازم لتحقيق توازن النظام ، أي ملء الأنبوب).
      5. ابدأ تشغيل مضخة الحقنة. بعد أن يملأ المحلول B الأولي 0.8 مل الأنبوب ويسقط في حاوية النفايات ، ضع الأنبوب أعلى قارورة التفاعل التي تحتوي على محلول A (يتم الاحتفاظ بها تحت التحريك المعتدل والموحد) واترك المحلول B يدخل بالتنقيط.
      6. غطيها بإضافة 2.65 مل من 0.1 M Na₃∙citrate المحضرة حديثا ، وقلبي لمدة 5 دقائق.
      7. قم بتركيز 40 نانومتر AuNPs التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي عند 2,460 × جم لمدة 18 دقيقة عند 10 درجات مئوية.
      8. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط برفق. أعد التعليق برفق في الحجم المتبقي.
      9. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
         ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا.
2. وظيفية 40 نانومتر من جزيئات الذهب المغطاة بالسترات بواسطة كيمياء الثيول القياسية¹⁶.
   1. هضم رابطة ثاني كبريتيد عن طريق احتضان قليل النوكليوتيدات المسبار الثيولي (5′ T (30) - (O - CH₂ - CH₂) ₃ - SH 3 ′) مع 10 ملي مولار تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات تحت اهتزاز خفيف (400 دورة في الدقيقة).
   2. احتضان فائض كبير من قليل النوكليوتيدات المهضومة بين عشية وضحاها باستخدام 10 نانومتر AuNPs ، في درجة حرارة الغرفة تحت اهتزاز خفيف (400 دورة في الدقيقة).
   3. ارفع خليط AuNPs-DNA إلى 0.3 M كلوريد الصوديوم في مخزن مؤقت للفوسفات 10 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.4 ، 0.01٪ SDS ، عن طريق إضافة الملح خطوة بخطوة على مدى فترة زمنية مدتها 10 ساعات ، تحت اهتزاز خفيف (400 دورة في الدقيقة).
   4. احتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة تحت اهتزاز خفيف (400 دورة في الدقيقة).
   5. اغسل AuNPs المترافقة بالحمض النووي 3 مرات باستخدام 0.25 M كلوريد الصوديوم في محلول فوسفات 10 ملي مولار بالإضافة إلى 0.01٪ SDS ، لإزالة قليل النوكليوتيدات الزائدة غير المرتبطة.
   6. قم بتخزين المجسات العالمية التي تم الحصول عليها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا.
   7. تحديد كثافة مجسات الحمض النووي على AuNPs باستخدام مقايسة تجارية قائمة على التألق
   8. قياس تركيز AuNPs عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. من أجل اشتقاق تركيز AuNPs من بيانات الامتصاص ، يمكن استخدام قانون لامبرت وبير (A = εbc) ومعاملات الانقراض المنشورة ل 40 نانومتر AuNPs¹⁶ .
   9. توصيف مجسات AuNPs عن طريق تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، والفحص المجهري الإلكتروني للإرسال (TEM).
      ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا.

2. التمييز اللوني للطفرة النادرة BRAF^V600E

1. تحضير العينات المستهدفة للتحليل: مخاليط من الحمض النووي الاصطناعي BRAF^V600E والحمض النووي^بالوزن BRAF بنسب مختلفة (BRAF^V600E:^{BRAF WT} 1:10 ، 1: 100 ، 1: 200 ، BRAF^V600E 100٪ ، BRAF^wt 100٪).
2. قم بموازنة الجسيمات الدقيقة المغناطيسية عن طريق غسلها مرتين باستخدام المخزن المؤقت للتهجين (HB) (1x PBS pH 7.4 ، 5٪ وزن / حجم PEG 600) وإعادة تعليقها في حجم HB يساوي حجم البداية. للغسيل ، ضع كمية من الجسيمات الدقيقة المغناطيسية في أنبوب 1.5 مل (بحد أقصى 50 ميكرولتر / أنبوب) ، أضف 500 ميكرولتر من HB واخلطه ثلاث مرات عن طريق الماصة برفق ، وقم بتطبيق المغناطيس ، وافصل المادة الطافية الشفافة ، وأضف على الفور 500 ميكرولتر من HB وكرر الإجراء لخطوة غسيل ثانية. بعد إزالة المادة الطافية ، أضف HB على الفور لتجنب تجفيف الخرزة ، وفقا لنصيحة الشركة المصنعة.
3. لكل عينة يتم اختبارها ، قم بإعداد أنبوب يحتوي على 2.5 ميكرولتر من الجسيمات الدقيقة المغناطيسية المغسولة في HB.
4. إضفاء الطابع الوظيفي على الجسيمات الدقيقة المغناطيسية عن طريق احتضان 2.5 ميكرولتر من الجسيمات الدقيقة المغناطيسية مع 10 ميكرولتر من محلول 10 ميكرومتر من مسبار تمييز أول بيوتينيل (DP1) ، الذي يؤوي طفرة BRAF^V600E ، لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. افصل الجسيمات الدقيقة مغناطيسيا عن المجسات غير المرتبطة المتداخلة وأعد تعليقها في 12.5 ميكرولتر من HB. لهذا الهدف ، ضع المغناطيس على جانب الأنبوب ، وانتظر حتى يصبح المحلول شفافا. قم بإزالة المحلول عن طريق سحب العينة بعناية ، وأضف HB على الفور والماصة برفق حتى يتم تعليق الخرزات بشكل متجانس.
6. أضف إلى المعلق 10 ميكرولتر من خليط 10 ميكرومتر من عينات الحمض النووي المستهدفة الموضحة في الخطوة 2.1.
7. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
8. أثناء الحضانة ، رج العينات كل 3 دقائق لتجنب ترسيب الجسيمات الدقيقة المغناطيسية.
9. أضف إلى المعلق 10 ميكرولتر من محلول 2 ميكرومتر لمسبار تمييزي ثان (DP2) ، مصمم بحيث يكون له جزء مكمل للهدف وذيل بولي A.
10. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
11. أثناء الحضانة ، رج العينات كل 3 دقائق لتجنب ترسيب الجسيمات الدقيقة المغناطيسية.
12. افصل مغناطيسيا DP2 الزائد بعد الحضانة.
13. أضف على الفور 300 fmol من AuNPs المقترنة بمجسات الكشف واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
14. مادة طافية منفصلة مغناطيسيا تحتوي على AuNPs الزائدة وتنفيذ^{خطوة الغسيل} 1 عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من HB في درجة حرارة الغرفة.
15. افصل المادة الطافية مغناطيسيا وقم بإجراء^{خطوة غسيل} ثانية عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من HB.
16. احتضان عند 52 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
17. طافي منفصل مغناطيسيا عند 52 درجة مئوية.
18. أعد التعليق على الفور في 12.5 ميكرولتر من HB لقراءة نتيجة قياس الألوان.
19. تصوير النتائج وتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

النتائج

تم استخدام هذه الطريقة للكشف عن طفرة BRAF^V600E في فائض من الحمض النووي الاصطناعي BRAF^wt . يوضح الشكل 1 تفاصيل استراتيجية الكشف. يعطي الاختبار نتيجة YES/NO اللونية^17،18 حيث يتوافق اللون الأحمر مع نتيجة موجبة (YES) والأصفر مع النتيجة الإيجابية (NO).

باختصار ، تم طلاء الجسيمات الدقيقة المغناطيسية العقدية بمجسات تمييزية بيوتينيل (DP1) تؤوي طفرة BRAF^V600E . تمت إضافة العينات الم...

المناقشة

الجانب الأساسي للطريقة هو القدرة على تمييز الحمض النووي المستهدف في سياق فائض من الحمض النووي غير المستهدف المتداخل ، حيث يختلف الحمض النووي المستهدف وغير المستهدف فقط بالنسبة لنيوكليوتيد واحد. وبالتالي ، فإن تصميم المجسات وظروف التهجين أمر بالغ الأهمية لتحقيق تمييز حساس. تم تصميم الاختبار لاستخدام مجسات القياس اللوني العالمية لتكييفها مع اكتشاف أي طفرات نقطية ذات أهمية. ومع ذلك ، من الممكن إجراء بعض التحسينات الطفيفة لظروف التفاعل في كل مرة يتم فيها تصميم زوج مسبار جديد لطفرة جديدة.

...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
جهاز طرد مركزي علوي مقعد- Allegra X 30	Beckman Coulter	A99473
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich / Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا	D0632-25G
Dynabeads M-280 ستربتافيدين الجسيمات الدقيقة المغناطيسية	Invitrogen	11205D
كبريتات الهيدروكسيلامين	سيجما ألدريتش / ميرك KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا	379913-25G
KDS 100 مضخة حقنة قديمة	kdScientific	789100
NanoDrop OneC مقياس الطيف	الضوئي Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	Sigma-Aldrich / Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا	806552-500ML
بيرس & تجارة ؛ TCEP-HCl ، لا وزن & تجارة ؛ تنسيق	Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)	A35349
البولي إيثيلين جلايكول 600	Sigma-Aldrich / Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا	202401
PTFE 0،22 & micro ؛ مرشحات م ، فلوروبور	ميليبور	FGLP04700
Quant-iT & trade ؛ أولي جرين & تجارة; مجموعة فحص ssDNA	Thermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)	O11492
سترات الصوديوم ثنائي هيدرات	Sigma-Aldrich / Merck KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا	W302600
قليل النوكليوتيدات الاصطناعية	Integrated DNA Technologies، Inc. (IDT DNA) حمض
رباعي كلورو أوريك (III)	سيجما-ألدريتش / ميرك KGaA ، دارمشتات ، ألمانيا	520918
مجسات الحمض النووي بوليتي الثيوليد	Integrated DNA Technologies، Inc. (IDT DNA)
المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM)	JEOL JEM 1011 مجهر
Zetasizer Nano S - نظام تشتت الضوء الديناميكي	Malvern Panalytical