مقالة منهجية

تثبيط تكوين بشرة الجرح عن طريق جراحة سديلة الجلد الكاملة أثناء تجديد الأطراف Axolotl

4.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61522

⸱

يونيو 24, 2020

1Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة كيفية إجراء طريقة جراحية لمنع تكوين بشرة الجرح أثناء تجديد الأطراف axolotl عن طريق خياطة الجلد كامل السماكة على الفور فوق مستوى البتر. تسمح هذه الطريقة للباحثين بالتحقيق في الأدوار الوظيفية لبشرة الجرح خلال المراحل المبكرة من تجديد الأطراف.

الملخص

أثبتت التجارب الكلاسيكية في بيولوجيا السمندل التجديدية على مدى القرن الماضي منذ فترة طويلة أن بشرة الجرح هي بنية إشارات حاسمة تتشكل بسرعة بعد البتر وهي مطلوبة لتجديد الأطراف. ومع ذلك ، فإن طرق دراسة وظيفتها الدقيقة على المستوى الجزيئي على مدى العقود الماضية كانت محدودة بسبب ندرة التقنيات الوظيفية الدقيقة والمعلومات الجينومية المتاحة في أنظمة نماذج السمندل. ومن المثير للاهتمام أن الوفرة الأخيرة من تقنيات التسلسل إلى جانب إطلاق جينومات السمندل المختلفة وظهور طرق الاختبار الجيني الوظيفية، بما في ذلك كريسبر، تجعل من الممكن إعادة النظر في هذه التجارب التأسيسية بدقة جزيئية غير مسبوقة. هنا ، أصف كيفية إجراء جراحة رفرف الجلد الكامل (FSF) المطورة بشكل كلاسيكي في axolotls البالغين من أجل منع تكوين بشرة الجرح مباشرة بعد البتر. تتشكل بشرة الجرح عادة عن طريق الهجرة البعيدة للخلايا الظهارية في الجلد القريب من مستوى البتر لعزل الجرح عن البيئة الخارجية. تستلزم الجراحة خياطة الجلد كامل السماكة على الفور (والذي يشمل طبقات البشرة والجلد) فوق مستوى البتر لإعاقة هجرة الخلايا الظهارية والاتصال بالأنسجة الوسيطة التالفة الكامنة. تؤدي العمليات الجراحية الناجحة إلى تثبيط تكوين الأرومة وتجديد الأطراف. من خلال الجمع بين طريقة الجراحة هذه والتحليلات الجزيئية والوظيفية المعاصرة ، يمكن للباحثين البدء في الكشف عن الأسس الجزيئية لوظيفة بشرة الجرح والبيولوجيا أثناء تجديد الأطراف.

المقدمة

منذ أن أبلغ لازارو سبالانزاني عن ذلك في عام 17681 ، كان تجديد أطراف السمندل أحد أكثر الظواهر التجديدية الطبيعية المدروسة جيدا والتي سحرت علماء الأحياء لعدة قرون. يعتمد تجديد الأطراف الناجح على تكوين بنية خلوية غير متمايزة تعرف باسم الأرومة ونموها ونمطها اللاحق. حقق الباحثون خطوات كبيرة في فهم التركيب الخلوي للبلاتيما وكذلك الأنسجة الداعمة وأنواع الخلايا الضرورية لتكوينها2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13 . ومع ذلك ، فإن آليات الإشارات المنسقة بين الأنسجة وأنواع الخلايا المختلفة التي تؤدي إلى بدء تكوين الأرومة لا تزال غير مفهومة بشكل جيد.

أحد المتطلبات الرئيسية لنجاح تكوين الأرومية وتجديدها هو بشرة الجرح، وهي ظهارة عابرة ومتخصصة تغطي مستوى البتر في غضون 12 ساعة بعد البتر10. بعد البتر، تهاجر الخلايا الظهارية من الجلد السليم القريب إلى الإصابة بسرعة فوق مستوى البتر لتشكل ظهارة جرح رقيقة14. مع تشكل الأرومة في الأسابيع التالية، تتطور بشرة الجرح المبكر إلى بنية إشارات ظهارية أكثر سمكا تسمى الغطاء الظهاري القمي (AEC)15. في حين أن الجلد الطبيعي كامل السماكة يحتوي على طبقة ظهارية وجلدية مفصولة بصفيحة قاعدية ، فإن بشرة الجرح / AEC تتكون فقط من طبقة ظهارية وتفتقر إلى صفيحة قاعدية16,17. يسمح غياب الصفيحة القاعدية والأدمة بالاتصال المباشر بين الخلايا الظهارية للجرح والأنسجة الكامنة ، مما يسهل الإشارات ثنائية الاتجاه بين المقصورتين وهو أمر بالغ الأهمية لكل من تكوين الأرومة وصيانتها17,18.

ابتكرت الدراسات التجريبية الكلاسيكية العديد من الطرق الجراحية المبتكرة لفحص وظيفة البشرة / AEC الجرح وضرورته عن طريق تثبيط تكوينه. وشملت هذه الطرق خياطة 19 أو تطعيم الجلد بسمك كامل20,21 فوق مستوى البتر، وخياطة الطرف المبتور على الفور في تجويف الجسم22، والإزالة اليومية المستمرة أو التشعيع لبشرة الجرح المبكر وAEC23,24. وإجمالا، لم تثبت هذه التجارب أهمية بشرة الجرح / AEC فحسب، بل حددت أيضا أدوارها في انحلال الأنسجة المبكر بالإضافة إلى الحفاظ على تكاثر الخلايا السلفية ونمو الأرومات13 طوال فترة التجديد.

ومع ذلك ، اقتصرت هذه الدراسات السابقة إلى حد كبير على التلطيخ النسيجي وكذلك نبضات الثيميدين المثلثة لتتبع انتشار الخلايا. في الواقع ، لم تتم إعادة النظر في هذه التجارب الكلاسيكية باستخدام تقنيات التسلسل الحديثة والتقنيات الوظيفية في السمندل إلا مؤخرا وأدت إلى اكتشاف أدوار إضافية لبشرة الجرح في تعديل الالتهاب وتدهور / ترسب ECM خلال المراحل المبكرة من التجديد25. مع إطلاق مختلف تسلسلات جينوم السمندل والنسخ 26،27،28،29،30،31،32،33،34 ، بالإضافة إلى العدد المتزايد من الطرق الوظيفية المتاحة في أنواع السمندل11،35،36،37،38 ، أصبح الباحثون الآن في وضع جيد للبدء في كشف الآليات الجزيئية التي تقود تكوين بشرة الجرح ووظيفتها وتطوير AEC.

لسوء الحظ ، فإن العديد من هذه الطرق الكلاسيكية المستخدمة لمنع تكوين بشرة الجرح تشكل تحديا تقنيا ، مما يمثل صعوبات في التكاثر بين النسخ المتماثلة البيولوجية في نفس التجربة. على سبيل المثال ، يمكن أن يكون الحفاظ على ترقيع الجلد أمرا صعبا لأن الطعوم قد تسقط في النهاية من الطرف المضيف وإزالة بشرة الجرح / AEC يوميا أمر صعب دون إتلاف الأنسجة الكامنة. علاوة على ذلك ، فإن خياطة الطرف المبتور في تجويف الجسم أمر صعب ويتطلب أيضا إصابة إضافية في موقع الإدخال. من ناحية أخرى ، فإن خياطة الجلد بسمك كامل مباشرة فوق مستوى البتر بسيط نسبيا ، ويمكن استنساخه تقنيا ، ويدخل الحد الأدنى من تلف الأنسجة. تم تطوير هذه الطريقة الجراحية لرفرف الجلد الكامل (FSF) من قبل أنتوني ميشر في عام 1976 في نيوتس البالغين (Notophthalmus viridiscens). وأظهر أن جراحة FSF تمنع تكوين بشرة الجرح ووظيفتها من خلال حظر كل من هجرة الخلايا الظهارية فوق مستوى البتر والاتصال المباشر بين الخلايا الظهارية والأنسجة الكامنة.

هنا ، يتم عرض هذا الإجراء الجراحي خطوة بخطوة باستخدام طرف axolotl. إلى جانب التقنيات الجزيئية والتسلسل الحديثة ، قد تثبت هذه التقنية أنها مفيدة جدا للباحثين لتعميق فهمنا لتكوين بشرة الجرح / AEC ووظيفتها أثناء تجديد الأطراف.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا ل IACUC (البروتوكول رقم: 11-32) والمبادئ التوجيهية AAALAC في جامعة هارفارد.

1. إعداد الحلول والإعداد للتخدير والانتعاش

  1. تحضير محلول تريكاين طازج بنسبة 0.1٪ للتخدير ومحلول ملح الصوديوم سلفاميرازين بنسبة 0.5٪ للتعافي. اجعل الحلول باستخدام المياه مناسبة لتربية axolotl37 وفقا لبروتوكولات IACUC المعتمدة في مؤسسة الأبحاث ذات الصلة (حل Holtfreter المعدل ، على سبيل المثال). تأكد من أن المحاليل مختلطة جيدا وأنه يتم إعداد حجم كاف من أجل غمر axolotl بأكمله.
    1. لإعداد محلول تريكاين 0.1 ٪ ، امزج 1 غرام من التريكاين و 1 غرام من بيكربونات الصوديوم مع 1 لتر من الماء. يمكن توسيع نطاق الحل وفقا لهذه الوصفة.
    2. لإعداد محلول ملح الصوديوم سلفاميرازين 0.5 ٪ ، امزج 5 غرام من ملح الصوديوم سلفاميرازين مع 1 لتر من الماء. يمكن توسيع نطاق الحل وفقا لهذه الوصفة. محلول سلفاميرازين هو مضاد حيوي يمنع العدوى البكتيرية أثناء الشفاء الجراحي.
  2. قم بتعقيم المنطقة الجراحية عن طريق رشها باستخدام Clidox-S أو 70٪ من الإيثانول. تعقيم الأدوات الجراحية (ملقط ، مقص تشريح ، مقص الربيع) عن طريق التعقيم. في حالة إجراء عمليات جراحية متعددة ، تأكد من تعقيم الأدوات الجراحية باستخدام معقم خرز ساخن بين الحيوانات.
  3. لإعداد منطقة الاسترداد ، ضع طبق بتري 15 سم أو أي حاوية تناسب axolotl فوق دلو مملوء بالثلج الرطب. املأ طبق بتري بمستوى منخفض من محلول ملح الصوديوم سلفاميرازين بنسبة 0.5٪ ، وهو ما يكفي بحيث لا يتم غمر axolotl بالكامل. سيؤدي التعافي على الجليد بعد الجراحة إلى إبطاء حركة الحيوان أثناء استيقاظه من التخدير ، مما يسمح للمنطقة المخيطة بالشفاء دون عائق نسبيا.
    ملاحظة: يمكن تخصيص هذا الإعداد من قبل الباحثين اعتمادا على المواد المتوفرة لديهم.

2. إجراء العملية الجراحية الكاملة للسديلة الجلدية

  1. تخدير axolotl عن طريق غمره في وعاء من محلول تريكاين 0.1 ٪. سيستغرق ذلك حوالي 15-20 دقيقة. تأكد من أن axolotl هو في الواقع مخدر بالكامل عن طريق إجراء قرصة الذيل. إذا لم يكن هناك استجابة من axolotl ، فتابع الجراحة.
    ملاحظة: استخدم axolotls أقدم وأكبر لهذه الجراحة (بحجم 15 سم على الأقل). تأكد من أن axolotl يبقى رطبا جيدا طوال الجراحة عن طريق ترطيب الجلد بشكل دوري بماء نظام axolotl باستخدام ماصة بلاستيكية. تأكد من إعداد الموقع الجراحي بشكل معقم عن طريق ري المنطقة ب PBS معقم قبل الجراحة. يجب أيضا وضع الحيوان على ستارة جراحية معقمة لهذا الإجراء.
  2. إجراء بتر الأطراف في الطرف البعيد من عناصر الهيكل العظمي zeugopodial باستخدام مقص تشريح (الشكل 1.1).
  3. باستخدام مقص الزنبرك ، قم بعمل شق صغير (حوالي 2 مم) على الجزء البطني من الجلد (الشكل 1.2).
  4. باستخدام الملقط ، قشر الجلد بعناية إلى خط الوسط تقريبا لعناصر الهيكل العظمي zeugopodial ، مما يعرض أنسجة الأطراف الأساسية (العضلات والعظام ، وما إلى ذلك) (الشكل 1-3). تأكد من عدم إتلاف الجلد. انظر الملاحظة بعد الخطوة 2.8.
  5. بتر أنسجة الأطراف الكامنة المكشوفة عند خط الوسط من زيوغوبود باستخدام مقص جراحي (الشكل 1.4).
  6. دفع الأنسجة العضلية إلى الوراء باستخدام المقص الجراحي وتقليم العظام المكشوفة.
    ملاحظة: هذا ضروري لضمان تحسين الشفاء وأيضا لزيادة نجاح الجراحة حيث يمكن أن تكون العظام البارزة خشنة ضد السديلة المخيطة وتعطل سلامة رفرف الجلد السليم في وقت لاحق.
  7. باستخدام الملقط ، اسحب بعناية الجلد ذو السماكة الكاملة الإضافية فوق مستوى البتر لتغطية الأنسجة الكامنة المكشوفة وخياطة في مكانها عن طريق الاتصال بالجلد البطني كامل السماكة (الشكل 1.5).
  8. قم بخياطة الجانبين الأيمن والأيسر المتبقي من الجلد في الأجزاء البطنية الأساسية من الجلد السليم. يمكن القيام بذلك إما عن طريق خياطة جانبي السديلة بطريقة "متقاطعة" (مستحسن) (الشكل 1.6-1.9) ، أو ببساطة خياطة مباشرة في الجلد البطني. استخدم الملقط والمقص الربيعي المنحني للخياطة. تأكد من عدم رؤية الأنسجة الكامنة المكشوفة وأن الغرز مربوطة بإحكام (معقودة ثلاث مرات على الأقل).
    ملاحظة: من الأهمية بمكان ألا يتلف الجلد السليم في الخطوات 2.4 و 2.7-2.8. لقد وجدنا أن الضرر الذي لحق بالجلد بسمك كامل قد ارتبط بالعمليات الجراحية غير الناجحة ، حيث أن مناطق الضرر قد لا تزال تشكل بشرة جرح صغيرة. إذا كان ذلك ممكنا ، حاول استخدام زوج باهت من الملقط عند تسليم رفرف الجلد بسمك كامل.
  9. قم بإجراء بتر على الطرف المقابل (التحكم الداخلي الاختياري في الحيوان) عن طريق بتره على مستوى منتصف زيوغوبود باستخدام مقص جراحي. ادفع الأنسجة العضلية إلى الخلف باستخدام مقص جراحي وقم بتقليم العظم المكشوف.
    ملاحظة: يمكن إجراء تحكم داخلي في الأطراف المقابلة لتقييم نجاح الجراحة بشكل أفضل خلال الخطوة 4 في نفس الحيوان. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام بتر نفس الطرف في منفصل ليكون بمثابة عنصر تحكم.

3. التعافي والرعاية بعد العملية الجراحية

  1. بمجرد اكتمال الجراحة ، ضع كيمويب أو منشفة ورقية معقمة في الجزء السفلي من الحاوية أو طبق بتري لتبللها. ضع الحيوان في الحاوية على الجليد الرطب ولف بلطف الأطراف المكشوفة من كيمويب أو منشفة ورقية حول الجزء العلوي من الحيوان لإبقائه رطبا جيدا بمحلول السلفاميرازين. اتركيه على الثلج الرطب لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة لضمان الحد الأدنى من الحركة أثناء التعافي من التخدير.
  2. ضع الحيوان في حاوية سكنية ثابتة بمحلول سلفاميرازين بنسبة 0.5٪. يجب أن تبقى Axolotls في هذا الحل لمدة 24 ساعة الأولى من أجل منع العدوى.
  3. ضع axolotl في مياه النظام العادي وراقب الصحة يوميا. تأكد من عدم سقوط أي خيوط كل يوم لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تكوين بشرة جرح صغيرة مما سيؤدي إلى إرباك النتائج.
    ملاحظة: تأكد من أن حاوية السكن لديها مساحة واسعة ل axolotl للتحرك وتقليل فرص أن الطرف المخيط على axolotl يمكن أن يتلامس مع جوانب الحاوية. سيساعد ذلك على ضمان بقاء الغرز في مكانها ، خاصة خلال الأسبوع الأول بعد الجراحة.

4. تقييم نجاح الجراحة تحت المجهر الاستريو

ملاحظة: نوصي بفحص الحيوانات تحت المجهر الاستريو مرة واحدة على الأقل في الأسبوع لتقييم سلامة رفرف الجلد الكامل ونجاح الجراحة.

  1. تخدير axolotl في 0.1٪ tricaine كما هو الحال في الخطوة 2.1. تأكد من وجود مساحة واسعة في الحاوية ل axolotl للتحرك.
  2. في حالة الفحص خلال الأسبوعين الأولين بعد الجراحة ، افحص الطرف المخيط باستخدام المجهر المجسم للتأكد من عدم ظهور خيوط ومن أن بشرة الجرح الرقيقة الواضحة غير مرئية في أي مكان. إذا كنت تفحص في الأسبوع الثالث بعد الجراحة أو في وقت لاحق ، فتأكد من عدم تشكل الأرومة وقارن مع كيفية تقدم الطرف المبتور الطبيعي (إما من نفس الحيوان أو مختلف) أثناء التجديد (أي ما إذا كانت الأرومة قد تشكلت).
  3. عند الانتهاء من ذلك ، أعد axolotl إلى ظروف المياه والتربية الطبيعية في النظام.

النتائج

سيسمح هذا البروتوكول الجراحي بالتثبيط الكامل لتشكيل بشرة الجرح (الشكل 1) وفي النهاية تجديد الأطراف. تؤدي الجراحة الناجحة إلى عدم تكوين الأرومة في حوالي 2-3 أسابيع اعتمادا على حجم الحيوان ، في حين أن الأطراف المجددة للتحكم يجب أن تشكل الأرومة بشكل طبيعي.

يجب على الباحثين فحص الطرف المخيط بالعين المجردة كل 2-3 أيام للتأكد من أن الغرز لم تنبثق وأن الأرومة لا تتشكل. إذا ظهرت واحدة أو أكثر من الغرز ، فلا يزال من الممكن أن تتشكل بشرة الجرح مما يؤدي إما إلى انفجار أرومي صغير أو كبير وجراحة غير ناجحة (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك ، يجب على الباحثين فحص الطرف المخيط مرة واحدة على الأقل كل أسبوع تحت المجهر المجسم للتأكد من أن بشرة الجرح الرقيقة غير واضحة في أي مكان على سطح البتر. للمقارنة ، يجب على الباحثين أيضا فحص الطرف المجدد للتحكم الذي يجب أن يكون له بشرة جرح فوق مستوى البتر وتشكيل أروميما على مدى 2-3 أسابيع. ستظهر بشرة الجرح رقيقة وواضحة ، في حين سيظهر الجلد الطبيعي أكثر غموضا وورديا شاحبا (أبيض تقريبا) أو أصفر فاتح أو أخضر داكن في axolotls leucistic أو albino أو wildtype ، على التوالي.

إذا كان الباحثون يرغبون في جمع الأنسجة قبل مراحل تكوين الورم الأرومي في 2-3 أسابيع ، فيجب عليهم فحص الأطراف المخيطة قبل جمع العينات للتأكد من بقاء الغرز في مكانها وعدم تشكل بشرة جرح صغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التقسيم السهمي من خلال أنسجة الأطراف المخيطة وإجراء التحليلات النسيجية في أي وقت يمكن أن يتحقق أيضا من وجود الأدمة من رفرف الجلد الكامل الذي يحيط بمستوى البتر بأكمله وعدم وجود بشرة جرح (الشكل 3).

figure-results-1
الشكل 1: مخطط لخطوات جراحة سديلة الجلد الكاملة.
يتم ترقيم خطوات البروتوكول ورسمها بيانيا هنا. تشير الخطوط المنقطة إلى مستويات البتر في الخطوتين 1 و 3 من البروتوكول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: أمثلة على جراحات رفرف الجلد الكامل الناجحة وغير الناجحة.
صورة توضيحية لطرف خضع لعملية جراحية ناجحة (يسار) ، وجراحة غير ناجحة (يمين) ، وطرف مجدد للتحكم (بدون جراحة) في 25 يوما بعد البتر (DPA). تحتوي الجراحة الناجحة على مستوى بتر مسطح حيث تم خياطة رفرف الجلد الكامل ، في حين أن الجراحة غير الناجحة لديها بلاستيما صغيرة تتطور. تشير رؤوس الأسهم إلى مستوى البتر والخطوط البيضاء المنقطة موجودة للمساعدة في تصور عدم وجود بلاسيما في الجراحة الناجحة ووجود الأروميات في الجراحة غير الناجحة والتحكم في تجديد الأطراف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تلطيخ نسيجي للأطراف الطبيعية المجددة وخياطة FSF.
(أ-ب) صور سطعة تمثيلية لأقسام بيكرو مالوري ملطخة من التجديد (A-A') وأطراف axolotl المخيطة (B-B') عند 7 ديسيبل في البوصة. تظهر الإدخالات الداخلية في A و B في A و B ، على التوالي. خطوط الطبقة الجلدية الثقيلة بالكولاجين وتغطي مستوى البتر بأكمله في أطراف مخيطة. يشار إلى مستوى البتر برؤوس الأسهم في A-B. تمثل أشرطة المقياس 500 ميكرومتر. وقد اقتبس هذا الرقم من تساي وآخرين.25. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

توضح هذه المقالة بروتوكولا لإجراء جراحات سديلة الجلد الكاملة في أطراف axolotl لمنع تكوين بشرة الجرح. في حين أن هذه الجراحة بسيطة نسبيا وقابلة للتكرار تقنيا مقارنة بالطرق الأخرى لتثبيط تكوين بشرة الجرح ، إلا أن هناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤثر على نجاح الجراحة. أولا ، عند سحب رفرف الجلد الكامل السليم فوق الأنسجة الكامنة المكشوفة ، من الأهمية بمكان ألا يتلف الجلد ذو السماكة الكاملة بأي شكل من الأشكال. لا يزال من الممكن أن يؤدي تلف رفرف الجلد إلى تكوين بشرة جرح صغيرة ، مما قد يؤدي إلى نمو صغير يشبه الأرومة. ثانيا ، تأكد من عدم سقوط الغرز أثناء الرعاية بعد العملية الجراحية لأن هذا يمكن أن يؤدي أيضا إلى تكوين بشرة جرح صغيرة. حتى هذه النقطة ، من المهم تقليل الاتصال المحتمل بين الطرف المخيط وأي أسطح ، خاصة خلال الأسبوع الأول بعد الجراحة. هناك عدة طرق لمنع ذلك تستلزم السكن وتخدير axolotl في حاوية كبيرة بما فيه الكفاية بحيث يكون لدى axolotl مساحة كبيرة للتنقل بعد الجراحة.

هذه الجراحة لديها أيضا العديد من القيود. ولعل أبرزها هو أنه لا يمكن تقييم نجاح العمليات الجراحية إلا بطريقتين: استخدام نطاق التشريح خلال الأسبوعين الأولين من الجراحة للبحث عن عدم وجود بشرة جرح و / أو التحقق مما إذا كانت الأرومة تتشكل في غضون 3 أسابيع. في حين أن هذه الأساليب فعالة ، إلا أنها منخفضة الإنتاجية نسبيا. قد يساعد تطوير محاور المراسل المعدلة وراثيا في المستقبل للعلامات الخاصة ببشرة الجروح في إجراء فحص أسرع للجراحات الناجحة مقابل العمليات الجراحية غير الناجحة. علاوة على ذلك ، يصعب إجراء هذه الجراحة على الحيوانات الأصغر سنا لأن الجلد السليم أكثر هشاشة. وبالتالي يوصى باستخدام axolotls دون البالغين أو البالغين.

في حين تم تطوير هذه الجراحة في الأصل في N. viridiscens19 ، فقد تم تكييفها بسهولة مع axolotls25,39 ويمكن تطبيقها على أنواع السمندل الأخرى أيضا. باختصار ، فإن تطبيق هذه التقنية على الدراسات التجديدية المستقبلية للأطراف سيمكن الباحثين من تطوير المزيد من الأدوات لمعالجة بيولوجيا بشرة الجرح وتحديد الآليات الأساسية التي تقود وظيفتها في بدء تكوين الأرومة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يشكر المؤلف دوغ على تشجيعه المستمر ودعمه الثابت ، وكذلك أعضاء مختبر ميلتون على ملاحظاتهم وتعليقاتهم المفيدة على المخطوطة. يود المؤلف أيضا أن يشكر مكتب هارفارد للموارد الحيوانية (OAR) على رعايته المتفانية للحيوانات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مقص زنبركي منحنيأدوات علمية دقيقة15009-08
إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات (تريكايين)سيجما ألدريتش886-86-2
ملقطأدوات علمية دقيقة11252-40تحتاج إلى زوجين
خيوط خيوط أحادية من النايلون (9-0)RobozSUT-1000-21
بيكربونات الصوديومسيجما ألدريتشS5761
مجهر ستيريوLeicaMZ6
ملح الصوديوم سلفاميرازينSigma-Aldrich127-58-2
مقص جراحيأدوات علمية دقيقة14002-14

المراجع

  1. Spallanzani, L. Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , Nella Stamperia di Giovanni Montanari (1768).
  2. Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. , (2018).
  3. Leigh, N. D., et al. Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution. Nature Communications. 9 (1), 5153(2018).
  4. Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
  5. McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods. Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).
  6. Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. A stepwise model system for limb regeneration. Developmental Biology. 270 (1), 135-145 (2004).
  7. Tsai, S. L. The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis. Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024(2020).
  8. Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. Macrophages are required for adult salamander limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).
  9. Tanaka, E. M. The molecular and cellular choreography of appendage regeneration. Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).
  10. Campbell, L. J., Crews, C. M. Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).
  11. Fei, J. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
  12. Sandoval-Guzman, T., et al. Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species. Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).
  13. Tassava, R. A., Mescher, A. L. The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration. Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).
  14. Hay, E. D., Fischman, D. A. Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration. Developmental Biology. 3, 26-59 (1961).
  15. Christensen, R. N., Tassava, R. A. Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs. Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).
  16. Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens. American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).
  17. Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration. Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).
  18. Singer, M., Saltpeter, M. M. Growth in Living Systems. Zarrow, M. X. , Basic Books. New York. (1961).
  19. Mescher, A. L. Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface. Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).
  20. Tassava, R. A., Garling, D. J. Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface. Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).
  21. Tornier, G. Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion. Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).
  22. Goss, R. J. Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity. Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).
  23. Thornton, C. S. The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae. Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).
  24. Thornton, C. S. The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light. Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).
  25. Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration. Elife. 9, (2020).
  26. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
  27. Elewa, A., et al. Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration. Nature Communications. 8 (1), 2286(2017).
  28. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  29. Looso, M., et al. A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration. Genome Biology. 14 (2), 16(2013).
  30. Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens. Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).
  31. Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis. Elife. 6, (2017).
  32. Nakamura, K., et al. A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster. PLoS One. 9 (10), 109831(2014).
  33. Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).
  34. Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research. BMC Genomics. 19 (704), (2018).
  35. Fei, J. F., et al. Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
  36. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
  37. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
  38. Joven, A., Elewa, A., Simon, A. Model systems for regeneration: salamanders. Development. 146 (14), (2019).
  39. Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl. Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

إجراء بتر الطرفخياطة السديلة الجلديةتثبيط تكوين البلاستيماالتحقق من التحليل النسيجيتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) اللاحقتقنيات الإفراط في التعبير الجينيالمعالجة بمحلول السلفاميرازين
تثبيط تكوين بشرة الجرح عن طريق جراحة سديلة الجلد الكاملة أثناء تجديد الأطراف Axolotl
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.