هنا ، نحن وصف طريقة دقيقة لجمع الخلايا الليمفاوية القناة الصدرية ومراقبة هجرة الأمعاء الاستوائية الليمفاوية في بقع الفئران بير لمدة 3 ساعات باستخدام التصوير الفوتوغرافي الفاصل الزمني. يمكن لهذه التقنية توضيح كيفية تأثر ديناميكيات الخلايا اللمفاوية في ظل الظروف الالتهابية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المراقبة المجهرية لديناميات الخلايا الليمفاوية في بقع الجرذ بير
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الليمفاوية الساذجة إعادة تدوير من الدم إلى الأنسجة اللمفاوية في ظل حالة فسيولوجية ومن المسلم به عادة كظاهرة هامة في مناعة الأمعاء. إن الستروما للأعضاء اللمفاوية الثانوية، مثل بقع بير (PPs) أو الغدد الليمفاوية المتوسطة، هي المكان الذي تشعر فيه الخلايا الليمفاوية الساذجة بمضادات. تنتشر الخلايا الليمفاوية الساذجة عبر مجرى الدم للوصول إلى الغدد الصماء العالية ، وهي بوابة الدخول إلى PPs. وتشير التقديرات إلى أن بعض العوامل المناعية تؤثر على هجرة الخلايا اللمفاوية، ولكن التقييم الدقيق لديناميات دوران الأوعية الدقيقة صعب للغاية، ويمكن أن يساهم إنشاء طريقة لمراقبة هجرة الخلايا اللمفاوية في الجسم الحي في توضيح الآليات الدقيقة. قمنا بتحسين طريقة جمع الخلايا الليمفاوية من القناة الليمفاوية ومراقبة الديناميكيات التفصيلية لللمفيات الأمعاء المدارية في أجهزة فئران الغدد الليمفاوية. اخترنا التصوير المجهري بالليزر confocal لمراقبة الفئران PPs في الجسم الحي وسجلها باستخدام التصوير الفوتوغرافي الفاصل الزمني. يمكننا الآن الحصول على صور واضحة يمكن أن تسهم في تحليل ديناميات الخلايا اللمفاوية.
المقدمة
بقع بير (PPs) تتكون من مئات من بصيلات اللمفية في بروبريا لامينا من الأمعاء الدقيقة. وتنقسم PPs إلى بصيلات، والمنطقة بين الخلايا، ومراكز الجرثومية الموجودة في الجزء السفلي من المسام، حيث يتم تحفيز الخلايا الليمفاوية عن طريق عرض المستضد. لا توجد أوعية اللمفاوية afferent، والمستضدات غزو بروبريا لامينا من تجويف الأمعاء عبر طبقة الخلايا الظهارية. وتسمى المنطقة الظهارية التي تغطي بصيلات اللمفية الظهارة المرتبطة بصيلات، والتي في إطارها تخصص تتخللها الخلايا M امتصاص مستضدات المخاطي. الخلايا M تأخذ في المستضدات من الجانب الإنارة ويتم القبض على المستضدات ثم بواسطة الخلايا التشعبية وتقديم نحو الخلايا الليمفاوية الساذجة التي تتدفق إلى PPs من خلال endothelium من venuhelial عالية (HEVs)1. Pps تلعب دورا هاما في مناعة الأمعاء وترتبط مع مرحلة مبكرة من الالتهاب. العديد من التفاعلات الجزيئية تنطوي على دخول الخلايا الليمفاوية إلى الأجهزة اللمفاوية الثانوية (SLOs), بما في ذلك جزيئات التصاق, chemokines2,3, وsphingosine-1-فوسفات4; وهكذا، هناك العديد من الأهداف العلاجية المتوقعة. لذلك ، فإن مراقبة ديناميكيات الخلايا اللمفاوية داخل PPs تمكننا من إلقاء نظرة على المرحلة المبكرة من الالتهاب وفحص فائدة العديد من الأدوية الواعدة.
تركز الطريقة هنا على هجرة الخلايا الليمفاوية في PPs ، والتي تشمل العديد من الإجراءات (التشبية في القناة الصدرية5 وجمع الخلايا الليمفاوية والمراقبة على المدى الطويل بعد الحقن في الخلايا الليمفاوية التي تم جمعها). وبما أن هذه الإجراءات معقدة وكان من الصعب أن نرى بالضبط كيف تم تنفيذ كل إجراء في التقارير السابقة، فقد ذكرنا هنا بعض النصائح لتحقيق ملاحظة ناجحة. على سبيل المثال، كان تحبيب الأنابيب في القناة الصدرية صعباً للغاية، وكان معدل النجاح الأولي للزباة أقل من 50٪. ومع ذلك، قمنا بتحسين الأسلوب وحققنا نسبة نجاح تتجاوز 80٪. ذكرنا بعض النصائح الأخرى في هذه المخطوطة التي تعتبر ضرورية لمراقبة ناجحة لتمكين التقييم الكمي للهجرة عبر الغدد الليمفاوية في ظل عدة شروط.
في التقارير السابقة ، كان من الصعب فهم التغيرات ثلاثية الأبعاد مع مرور الوقت ، مثل الحقن الوريدي للحبر الهندي لطخة بنية الأوعية الدموية من PPs6، أو المجهر يجري أحادية البؤر7. في السنوات الأخيرة، طريقة الرصد باستخدام بعض الحيوانات المعدلة وراثيا بروتين الفلورانس الفلورية الضوئية مثل الفئران Kaede قد أوضحت الحركات الخلوية المنهجية في الجسم الحي8. وأوضحت الدراسة الأخرى CD69 اغلاق مستقل من خروج الخلايا الليمفاوية من PPs9. استخدمنا التصوير المجهري بالليزر confocal (CLSM) بسبب قدرته التحليلية العالية. الآن يمكننا الحصول بسهولة على صور عالية الدقة واستخدامها لتحليل ديناميكيات الخلايا اللمفاوية.
في هذا التقرير، أظهرنا سلسلة من الطرق لتقييم هجرة الخلايا اللمفاوية في PPs. أولاً، أظهرنا طرقاً محسنة لتكبوس القناة الصدرية لجمع الخلايا الليمفاوية. ثانيا، قمنا بتحسين أساليب الرصد بعدة طرق للحفاظ على الأعضاء الموضوعية كلما أمكن تحت المراقبة المجهرية، مما يمكننا من الحصول على صور عالية الجودة لمدة 3 ساعات. ثالثاً، قمنا بتحديد حجم الحركات الخلوية لهجرة الخلايا اللمفاوية لتقييم آثار بعض الأدوية. وستسهم هذه البروتوكولات المعدلة في تطوير تقييمات المناعة المخاطية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافقت لجنة بحوث الحيوان بكلية الطب للدفاع الوطني على البروتوكول التجريبي (رقم 16058). تم الحفاظ على الحيوانات على الطعام المختبري القياسي (CLEA Japan Inc ، طوكيو ، اليابان). وعولج المختبرات وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة.
1. جمع وفصل الخلايا الليمفاوية
ملاحظة: بما أن الخلايا اللمفاوية يجب أن تكون طازجة ولا يمكن تخزينها، يجب جمعها من الفئران لكل تجربة. بالإضافة إلى ذلك، يجب جمع الخلايا اللمفاوية الأمعاء المدارية مباشرة من القناة الصدرية حيث أنها تدور. ومن المتوقع أن يتم الانتهاء من جميع الإجراءات في غضون 6 ساعات، وجميع الصكوك والقفازات والأسطح نظيفة. من أجل الحفاظ على الحيوانات في حالة مستقرة من الناحية الفسيولوجية ، يجب أن تبقى جميع السوائل المالحة وغيرها المستخدمة في التجربة دافئة.
- تشكيل أنبوب التكبل (1 مم قطر) مثل منحنى الهيبارين (دائرة نصف قطرها حوالي 5 ملم) بعد غمسه في الماء الساخن (حوالي 80-90 درجة مئوية) وإصلاحه إلى لوحة من البلاستيك باستخدام شريط لاصق لبضع ساعات مقدما.
- تخدير فأر Wistar ذكر (8-12 أسبوعا) مع حقن داخل الصفاق من خليط من ميدازولام (2mg /kg), Domitor (0.15mg/kg), و Betulphar (2.5mg/kg) وقطع شعر الجسم من البطن باستخدام مقص الشعر. إزالة الشعر بحزم بعد الحلاقة بحيث لا يدخل الشعر تجويف البطن.
- بعد التأكد من أن يتم الحصول على عمق مستقر من التخدير المطلوبة لهذا الإجراء عن طريق قرصة إصبع، وجعل شق مع مقص جراحي أفقيا من خط الوسط إلى المنطقة الفرعية اليسرى. يجب الحرص على عدم تلف الأوعية الدموية في الصفاق الجداري من خلال مشاهدة الأوعية تحت الضوء.
- التفاف المعدة مع الشاش الرطب ونقل المعدة بلطف إلى اليمين خارج الجسم للكشف عن أعضاء الرجعية. إدراج درجة بين عضلات الانتصاب من العمود الفقري والأنسجة الدهنية باستخدام مقص الجراحية وفصلها بصراحة مع الأصابع.
- تعري بعناية من النسيج الضام حول القناة الصدرية. يزيد النسيج الضام الزائد مع التقدم في العمر. فضح القناة الصدرية من أسفل صلب الأيسر من الحجاب الحاجز caudally حتى طول 20 مم من القناة الصدرية كانت مرئية. الالتصاقات فصل بلطف بين القناة الصدرية والأبهرية باستخدام ملاقط الدقة أو مسحات القطن الرطب.
- تنفيذ هذه العملية بعناية لأن بعض الفئران لديها الشرايين المتفرعة من عبور الشريان البطني عبر القناة الصدرية أو القناة الصدرية قصيرة بسبب موقف أعلى من الضفيرة الليمفاوية (القنوات الصدرية الصغيرة تنتشر مثل شبكات العنكبوت). تجنب الاتصال غير الضرورية إلى القناة الصدرية لتجنب الوذمة المسببة.
- تطبيق رباط بواسطة سلسلة (3-0 الحرير) على القناة الصدرية فقط تحت الصلب الأيسر من الحجاب الحاجز. يصبح القناة الصدرية السدية مُتذلة.
- جعل ثقب (5 مم قطر) في جدار البطن عن طريق طعن حافة القطع من مقص الجراحية، وتمرير أنبوب التكبل دبوس منحنى، وligate الأنبوب على العضلات iliopsoas عند نقطة واحدة. ملء أنبوب التكبيل مع المالحة العادية التي تحتوي على 10 U/mL الهيبارين.
- بعد وضع سلسلة (3-0 الحرير) تحت القناة الصدرية المكدّبة، طعن القناة الصدرية مع حافة قطع حاد من أنبوب التكبيل، التنفير نحو الذيل حوالي 5 ملم، ligate القناة الصدرية مع أنبوب التكبوس لل التثبيت.
- لتوريد المالحة لمنع الجفاف، وخلق ثقب (3 مم قطر) على الجدار الأمامي من antrum من المعدة باستخدام ملاقط الدقة وتمرير أنبوب السيليكون (2 مم في القطر) إلى الاثني عشر من خلال حلقة البواب. بعد خياطة حتى الجرح والحفاظ على الحيوانات في أقفاص بولمان، والبدء في ضخ المالحة المحملة بالسكر في الاثني عشر كل الفئران من أنبوب السيليكون بمعدل تدفق 3 مل / ساعة. غطي القفص بأكمله بمنشفة ورقية لتحافظ على الدفء.
- إصلاح أنبوب التكبيل إلى ثقب في وسط غطاء أنبوب مخروطي 50 مل على الجليد يحتوي على 6 U / مل الهيبارين، 10٪ مصل الأبقار الجنينية، و RPMI 1640 المتوسطة (pH 7.4؛ انظر جدول المواد)، وجمع الخلايا الليمفاوية القناة الصدرية (TDLs) على الجليد. يجب الحرص على عدم الاتصال بطرف الأنبوب إلى جدار الأنبوب المخروطي لمنع انسداد الأنبوب المُعمّن بسبب تكوين الجلطات الفيبرين داخل الأنبوب. يمكن الحصول على السائل الليمفاوي (حوالي 20 مل) بما في ذلك حوالي 1.0 × 108~ 109 الخلايا الليمفاوية في 6 ساعات. للحصول على الخلايا الليمفاوية تحت التخدير الكامل ، يتم مراقبة مستوى التخدير ويتم ملاحظة تدفق الليمفاوية بشكل مناسب. يتم إضافة نفس التخدير في نفس الجرعة بعد حوالي 3 ساعات من وضع الفئران في قفص بالمان للحصول على التخدير العميق بشكل مستمر لمدة 6 ساعات.
2. اللمفاوية وضع العلامات مع carboxyfluorescein diacetate succinimidyl إستر (CFDSE)
- حل CFDSE(جدول المواد)في ثنائيات الكبريت (DMSO) إلى 15.6 mM (500 ميكروغرام من CFDSE الذائب في 60 ميكرولتر من DMSO).
- احتضان الخلايا الليمفاوية (1 × 108~ 109) في 50 مل من 1640 RPMI مع 50 ميكرولتر من حل CFDSE لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية كما هو موضح سابقا10.
3. الإعداد التجريبي للدراسات الأوعية الدموية الدقيقة
- تخدير الفئران المتلقية (8-12 أسابيع) مع الحقن داخل الصفاق من خليط من ميدازولام (2mg /kg), Domitor (0.15mg/kg), و Betulphar (2.5mg/kg) وتأكيد عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع قدم. الرطب في البطن قبل الاستمالة الفراء للحد من تلوث الشعر. ثم افتح بطن فأر ويستر المتلقي عن طريق شق خط الوسط.
- وضع الجرذ على لوحة محمولة من الفولاذ المقاوم للصدأ (حوالي 120 × 300 مم) مع ثقب مستطيل حول المركز مغطاة بشريحة زجاجية (24 × 50 ملم). اختر حوالي 10 سم من الجزء العلّي بما في ذلك PPS للمراقبة.
- الحفاظ على الأمعاء دافئة قدر الإمكان ورطبة مع الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) الدفء إلى 37 درجة مئوية. نقع الشاش الذي يستخدم لتغطية الأمعاء الدقيقة مع برنامج تلفزيوني.
- بينما يعطي تخدير مستمرّة مع 2 ٪ [إيسفلورين] (رأيت جدول المواد), يضع الشريحة على المرحلة من المجهر واختر مناطق مناسبة لمراقبة من الدوران دقيقة في [ببس] حيث بعض [هيفس] يركض من خلال ال [سروسا]. PPs في حجم؛ أكبر منها هي مناسبة لمراقبة دوران الدقيقة باستخدام CLSM. الأمعاء الدقيقة ليست مباشرة في الأماكن. قطعة مستقيمة لا يقل طولها عن 2 سم دون أي توتر مناسب للمراقبة.
- تغطية الجزء المعوي المجاورة والمينentery مع القطن الماص غارقة مع برنامج تلفزيوني. ضع الجزء الأمعاء بين اثنين من كرات القطن المدرفلة ووضعها إلى أقصى حد ممكن من جسم الجرذ لمنعه من الاهتزاز من قبل ضربات قلب الفئران والتنفس.
- باستخدام حقنة 1 مل، حقن ببطء (أكثر من 1 دقيقة) TDLs المسمى CFSE (1 × 108 خلايا) في الوريد الوداجي للفئران المتلقي. قد تؤثر الحقن الوريدي السريع على الدورة الدموية الجهازية.
4. دوران الأوعية الدقيقة لللمفيات
- مراقبة باستمرار TDLs في microvasculature من PPs باستخدام CLSM وتسجيل على جهاز كمبيوتر لمدة 3 ساعات باستخدام التصوير الفاصل الزمني في فترات 30 s. العمق من سيروزا إلى HEV من PPS حوالي 25 ميكرومتر، مما يتيح مراقبة الأوعية اللمفاوية السترمية والشعيلية إلى عمق 30 ميكرومتر.
- حقن تكساس ريد ديكستران (25 ملغ / كغ) في الوريد الوداجي لكل فأر المتلقي لطخة مجرى الدم وهويشت 33342 (5 ملغ / كجم) لطخة نواة الخلية.
- (اختياري) لتحديد ديناميات الخلايا الليمفاوية، تعريف الخلايا الليمفاوية التمسك HEVs أكثر من 30 ثانية بأنها "الخلايا الليمفاوية لاصقة" والخلايا الليمفاوية المهاجرة من HEVs إلى ستروما كما ''هجرة الخلايا الليمفاوية". ثم حساب متوسط النسبة المئوية للهجرة (هاجر الخلايا الليمفاوية / الخلايا الليمفاوية لاصقة + الخلايا الليمفاوية المهاجرة) لكل مجال الرؤية (ما يقرب من 0.3 مم2).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
جمع الخلايا الليمفاوية من اللمف
لإعداد الفئران لتكبيب القناة الصدرية، وجعل شق في القناة الصدرية المتوترة كما هو مبين في الشكل 1 ومن ثم الحفاظ على الفئران في قفص بولمان كما هو مبين في الشكل 2.
عندما يتم جمع الخلايا الليمفاوية بشكل جيد، يمكننا الحصول على حوالي 20 مل/6 ه السائل الليمفاوي يحتوي على حوالي 107~ 108/ مل الخلايا الليمفاوية. من TDLs، 70٪ أعرب CD4، من بينها حوالي 90٪ من الخلايا التعبير ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا وصفنا بروتوكول لجمع الغدد الليمفاوية الأمعاء الاستوائية الساذجة ومراقبة هجرتهم في الفئران PPs. هذه الإجراءات يمكن أن تكشف عن كيفية تحرك الخلايا الليمفاوية في microvasculature من PPs وجعل من الممكن مقارنة بصريا دينامياتها في ظل حالة طبيعية أو العلاج. الملاحظة المباشرة لهذه الديناميات لها ميزة كبيرة للحصول على دليل على التعديل المناعي من قبل بعض الأدوية ، على الرغم من أن فترة المراقبة تقتصر على بضع ساعات فقط.
ذكرنا بعض النصائح في الأساليب. من بينها، واحدة من الإجراءات الأكثر حساسية هو أن الم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا البحث من خلال منح من كلية الطب الدفاع الوطني ومنحة البحوث الصحية والعمالية للبحوث المتعلقة بالأمراض المستعصية من وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية، اليابان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| A1R + | نيكون | المسح الضوئي بالليزر Comfocal المجهر | |
| الكربوكسي فلوريسسين ثنائي الأسيتات السكسينيمديل إستر | ثيرمو فيشر Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 متوسط | GIBCO | 11875093 | |
| تكساس ريد & - - دش ؛ ديكستران | ثيرمو فيشر العلمي | D1863 |
المراجع
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
