يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التمييز بين الخلايا المناعية داخل الرئة وخلايا المناعة داخل الأوعية الدموية: النهج داخل الوداجي

1.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61590

⸱

سبتمبر 22, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Children's Hospital of Philadelphia, 2Systems Pharmacology and Translational Therapeutics, University of Pennsylvania, 3Institute of Translational Medicine and Therapeutics (ITMAT), University of Pennsylvania, 4Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

الهدف من الدراسة الحالية هو وصف بروتوكول للتمييز بين الخلايا المناعية داخل الأوعية الدموية وداخل المتني في دراسات التهاب الرئة. نستخدم حقنة داخل الوداج لجسم مضاد يحمل علامة الفلورسنت قبل حصاد الرئة. علاوة على ذلك ، نستخدم عملية هضم الرئة القائمة على التضخم لتحسين محصول الكريات البيض من الرئة.

الملخص

تشير إيقاعات الساعة البيولوجية إلى التذبذبات في العمليات البيولوجية المختلفة التي تحدث مع فترة 24 ساعة. على المستوى الجزيئي ، تتكون هذه الإيقاعات من شبكة من حلقات التغذية الراجعة النسخية الانتقالية (TTFL) لجينات الساعة الأساسية. الأنسجة الفردية وأجهزة الأعضاء ، بما في ذلك الجهاز المناعي ، لها ساعتها الخاصة. في الدورة الدموية النظامية ، يتأرجح العديد من أعضاء CD45 + على مدار اليوم. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الإيقاعات ليست متطابقة أو حتى متشابهة في مجموعة الكريات البيض CD45 + المقيمة. عند دراسة دور تنظيم الساعة البيولوجية لالتهاب الرئة ، قد يحتاج CD45 + داخل الرئة إلى التحقيق. ومع ذلك ، على الرغم من طرق التروية المحسنة ، فإن الكريات البيض المحاصرة من الدورة الدموية تستمر في الرئتين. كان الهدف من تصميم هذا البروتوكول هو التمييز بين الكريات البيض داخل الأوعية الدموية وداخل المتني. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم حقن الفئران بجسم مضاد CD45 الموسوم بالفلورسنت داخل الوداج قبل وقت قصير من حصاد الرئة. بعد ذلك ، يتم هضم الرئة باستخدام تقنية هضم الرئة المخصصة للحصول على تعليق خلية واحدة. العينة ملطخة للوحة الأجسام المضادة العادية للخلايا المناعية داخل المتني (بما في ذلك الجسم المضاد CD45 آخر). تظهر تحليلات قياس التدفق الخلوي توضيحا واضحا للسكان. وبالتالي ، فإن طريقة وضع العلامات على خلايا CD45 + داخل الرئة وتعريفها ستكون مهمة بشكل خاص عندما يكون سلوك الخلايا المناعية داخل الرئة والدورة متميزة عدديا ووظيفيا.

المقدمة

نصف هنا طرقا فعالة وموثوقة للتمييز بين الكريات البيض داخل الأوعية الدموية وبيضاء الرئة. حتى مع أفضل تقنيات التروية ، كشفت الدراسات أن بقايا CD45 + من الدورة الدموية لا تزال موجودة في الرئة. هذا يضعف القدرة على التمييز بين إيقاعات الدورة الدموية والرئة. يتم تضخيم هذا التأثير بشكل أكبر في حالات التهاب الرئة. هذا مهم بشكل خاص لدراسة تنظيم الساعة البيولوجية للالتهاب.

تشير إيقاعات الساعة البيولوجية إلى التذبذبات النهارية في العمليات البيولوجية المختلفة التي تحدث بفترة 24 ساعة. نظام الساعة البيولوجية هو آلية استباقية محفوظة تطوريا تمنح الحماية للمضيف لأنه يواجه تغيرات في بيئته مثل خطر العدوى. على المستوى الخلوي ، يتم تنظيم الساعة في حلقات تغذية مرتدة نسخية انتقالية ذاتية الاستدامة تشتمل على جينات الساعة الأساسية1. الجهاز المناعي له ساعته الخاصة التي تؤثر على استجابته لمسببات الأمراض والإهانات الالتهابية2،3. كعضو يتعرض للبيئة باستمرار ، تعتبر إيقاعات الساعة البيولوجية مهمة بشكل خاص في الرئة4. تخضع العمليات المناعية المختلفة في الرئة للسيطرة على مدار الساعة5،6،7. ومع ذلك ، فإن مرحلة العمليات البيولوجية المختلفة في الرئة والدورة الدموية الجهازية ليست هينفسها 8 ، والتي تشير أيضا إلى أن تذبذبات الكريات البيض في الرئة والدورة الدموية قد لا تكون متطابقة. وبالتالي ، فإن وجود طريقة للتمييز بكفاءة بين الكريات البيض الرئوية وداخل الأوعية الدموية سيكون أمرا بالغ الأهمية في سياق الساعة البيولوجية.

كان الهدف من هذه الدراسة هو ابتكار طريقة يمكنها التمييز بين الكريات البيض داخل الأوعية الدموية وداخل المتني بشكل موثوق. لهذا ، استخدمنا وضع العلامات على الكريات البيض داخل الأوعية الدموية وطريقة هضم الرئة. لوضع العلامات على الكريات البيض داخل الأوعية الدموية ، نستخدم الحقن داخل الوداج ، والذي يستهدف وعاء دموي كبير ويمكن استخدامه بشكل متكرر في الفئران من جميع السلالات والأحجام. استخدمت العديد من الطرق الأخرى حقن وريد الذيل9،10 ، والتي من المعروف أنها أصعب في أداء الفئران Bl611. يتطلب الحقن داخل الوداج استخدام التخدير ومن الأفضل القيام به تحت التصور المباشر باستخدام مجهر تشريح أو مكبرات مكبرة. وبالتالي ، يجب موازنة سهولة وموثوقية الحقن داخل الوداج مقابل الحاجة إلى التخدير والمعدات الخاصة. ومع ذلك ، نظرا للتوافر الجاهز لهذه المعدات في معظم مختبرات الأبحاث ، فإننا لا نعتبر هذا عاملا مقيدا. ومع ذلك ، يبدو من الحكمة النظر في كل حالة على حدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الدراسات التي أجريت على من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة بنسلفانيا واستوفت شروط دليل رعاية واستخدام المختبر.

ملاحظة: يمكن تقسيم العملية الإجمالية إلى 1) وضع العلامات على CD45 في الوريد ، 2) الحصاد ، 3) الهضم ، و 4) تلطيخ وقياس التدفق الخلوي. تم تلخيص هذه الخطوات في الشكل 1.

1. تحضير الحلول / الكاشف

  1. تحضير وسائط التفكك عن طريق إضافة 5 مل من 2 ملي ل-جلوتامين ، و 20 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، و 1 مل من 2-mercaptoethanol ، و 10 مل من Pen / Strep إلى 500 مل من DMEM.
    ملاحظة: تكون وسائط التفكك مستقرة لمدة تصل إلى شهرين عند تخزينها عند 2-4 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) عن طريق إضافة 10 مل من FBS و 500 مجم من أزيد الصوديوم إلى 500 مل من PBS بدون المغنيسيوم أو الكالسيوم.
    ملاحظة: مع إضافة أزيد الصوديوم ، يمكن تخزين FACS Buffer عند 2-4 درجات مئوية لعدة أشهر.
  3. في يوم جمع العينة ، أضف محاليل DNase و Liberase إلى وسائط التفكك عند تخفيف 1: 100 (أي أضف 10 ميكرولتر من DNase و Liberase لكل 1 مل من وسائط التفكك).
    ملاحظة: لكل فأر ، يتطلب هضم الرئة بأكملها 10 مل / فأر ونصف الرئة يتطلب 5 مل / فأر.

2. وضع العلامات على CD45 في الوريد

  1. في هذه التجربة ، استخدم الفئران البالغة C57Bl6 التي تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا.
  2. تخدير الفئران بعوامل من اختيارك. تم استخدام مزيج من الزيلازين والكيتامين لهذا الغرض ، لكن العوامل الأخرى مقبولة أيضا. الهدف هو الحصول على مستوى متوسط إلى عميق من التخدير يستمر حوالي 5-10 دقائق.
    ملاحظة: يتم إعطاء خليط التخدير الزيلازين والكيتامين داخل الصفاق. استخدم 10-15 مجم / كجم من الزيلازين و 120-150 مجم / كجم من الكيتامين.
  3. بمجرد أن يصبح منعكس الدواسة سالبا ، ضع على ظهره وقم بلصق أطرافه برفق للحفاظ على الرأس مركزيا قدر الإمكان.
  4. كشف الوريد الوداجي والعضلة الصدرية عن طريق رفع الجلد بالملقط والقص بمقص جراحي حاد.
  5. حقن 200 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل CD45 (الجسم المضاد من درجة قياس التدفق الخلوي ؛ مخفف 1: 300 في PBS) في الوريد الوداجي باستخدام إبرة 28 G. انتظر 2-4 دقائق حتى يتمكن الجسم المضاد من الدوران في جميع أنحاء الأوعية الدموية.
    ملاحظة: الدخول من خلال العضلة الصدرية إلى الوريد الوداجي من زاوية ضحلة يمنع حدوث نزيف كبير.
  6. بعد ذلك ، قتل عن طريق التعرض لثاني أكسيد الكربون2 لمدة 10 دقائق. انتقل إلى نضح الرئة وحصاد الرئتين والأنسجة الأخرى.
    ملاحظة: أي طريقة أخرى للقتل الرحيم الإنساني تلتزم بإرشادات AVMA للقتل الرحيم للحيوانات مقبولة أيضا.

3. التشريح / الحصاد (الشكل 1)

  1. ضع على ظهره على لوح مسطح وقم بتثبيت الكفوف لأسفل ، مع الحفاظ على الرأس في المركز.
  2. رش الجسم ب 70٪ إيثانول. افتح التجويف الصدري بالملقط والمقص لكشف الرئة والقلب والقصبة الهوائية.
  3. قم بنشر الرئة عن طريق عمل شق صغير في البطين الأيسر للقلب وحقن 10 مل من PBS البارد عبر البطين الأيمن.
  4. قص فتحة في القصبة الهوائية وأدخل قنية في الوريد. بمجرد دخول القنية ، مرر خيطا بطول 6-8 سم تحت القصبة الهوائية واربطه مرتين بالقنية.
  5. دس الخيط الجراحي في القنية وقم بإرفاق حقنة تحتوي على وسائط التفكك (5 مل لنصف رئة أو 10 مل للرئة بأكملها) كما هو موضح في الشكل 1 ب.
  6. اقطع الرئة برفق عن باقي الجسم وضع المحقنة مع الرئة متصلة بأنبوب مخروطي سعة 50 مل.

4. الهضم إلى تعليق خلية واحدة

  1. احتضان الرئة عند 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة ، مع غرس 1 مل (لنصف الرئة) أو 2 مل (للرئة بأكملها) من وسائط التفكك كل 5 دقائق.
  2. بمجرد غرس جميع الوسائط ، قم بإزالة المحقنة والقنية ، وضع الأنبوب المخروطي سعة 50 مل في حمام مائي مهتز عند 180 دورة في الدقيقة لبقية فترة الحضانة للحصول على عائد أفضل.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن هز الأنابيب يدويا كل 5 دقائق.
  3. أضف 10 مل من PBS ورجه بقوة لمدة 1 دقيقة لإيقاف التفاعل.
  4. مرر المحلول عبر مصفاة خلوية (70 ميكرومتر) إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. استخدم سدادة مطاطية من المحقنة سعة 5 مل لتمرير أي كتل من الأنسجة عبر المصفاة. أضف PBS بحيث يكون الحجم النهائي 30 مل.
  5. الطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق عند 1,200 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. Pipet أي حل متبقي.
  6. أضف 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) واخلطه مع حبيبات الخلية عن طريق سحب العينات.
  7. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 60-90 ثانية. أضف PBS بحيث يكون الحجم النهائي 30 مل لإيقاف التفاعل.
    ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة على كمية الدم في حبيبات الخلية. كلما كانت حبيبات الخلية أكثر احمرارا ، كلما طالت مدة الحضانة.
  8. الطرد المركزي للعينات لمدة 10 دقائق عند 1,200 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات. Pipet أي حل متبقي.
  9. أضف 1 مل من المخزن المؤقت ل FACs إلى حبيبات الخلية واخلطها عن طريق سحب العينات.

5. تلطيخ الخلايا لقياس التدفق الخلوي

  1. استخدم عداد الخلايا لتحديد العدد الإجمالي للخلايا في معلق الخلية.
  2. انقل تعليق الخلية إلى كل أنبوب FACS مسمى بحيث يكون هناك 3 × 106 خلايا إجمالا لكل عينة.
  3. أضف Fc Block (مخفف 1: 100) واحتضنه لمدة 15 دقيقة على الثلج.
  4. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1,200 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
  5. قم بتلطيخ العينات بخليط محدد من الأجسام المضادة واحتضانها لمدة 20 دقيقة على ثلج محمي من الضوء (أي عن طريق تغطيتها بورق الألمنيوم). امزج عن طريق أنابيب الأرفف مقابل حامل الأنبوب في منتصف فترة الحضانة.
  6. أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS للغسيل والخلط عن طريق سحب العينات.
  7. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب FACS آخر عن طريق سحب التعليق ببطء من خلال مصفاة 35 ميكرومتر.
  8. الطرد المركزي الأنابيب لمدة 5 دقائق عند 1,200 × جم و 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
  9. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS واخلطه عن طريق سحب العينات.
  10. أضف 10 ميكرولتر من DAPI (1: 100) إلى كل أنبوب مباشرة قبل تشغيل العينات.
    ملاحظة: العينات جاهزة الآن للتشغيل على مقياس التدفق الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام هذه التقنية ، كان إجمالي عدد الخلايا للرئتين الساذجة المنفصلتين (تم استخدام الفص الأيسر فقط للبيانات التمثيلية) بين 27.3 × 106 إلى 71.1 × 106 خلايا / مل. بعد تحديد الحجم وإخراج الثنائيات والخلايا الميتة (مخطط البوابات في الشكل 2) ، تراوحت أعداد الكريات البيض من 6.9 × 106 إلى 13.5 × 106 خلايا / مل. شكلت الكريات البيض المنتشرة التي تظل محاصرة حتى بعد التروية لتنظيف الرئتين ما يقرب من 4٪ إلى 13٪ من الخلايا الحية في التجربة. في حين أن جميع الك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعد الدراسات الدقيقة لالتهاب الرئة والاستجابات المناعية الرئوية ضرورية لفهم العديد من الحالات المرضية. يستخدم قياس التدفق الخلوي بشكل روتيني لتعداد وإسناد الأهمية الوظيفية للكريات البيض الرئوية. تعتمد وظيفة الكريات البيض جزئيا على الأقل على مكان وجودها. على الرغم من وجود أدلة متراكمة تدعم أنه حتى بعد بروتوكولات التروية المثالية ، فإن العديد من الكريات البيض داخل الأوعية الدموية تستمر في الرئتين ، إلا أن معظم الدراسات لا تفرق بين الكريات البيض داخل الرئة وداخل الأوعية الدموية. علاوة على ذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل NHLBI-K08HL132053 (SS). يشكر المؤلفون الدكتور جي إيه فيتزجيرالد على الوصول إلى مجهر تشريح وحمام مائي مهتز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Boekel Scientific Medium Water BathBoekel Grant Scientific290200
10 مل محاقن BD مع BD Luer-Lok TipBD Biosciences309604
5 مل BD مع BD Luer-Lok TipBD Biosciences309646
Anti-CD45- Pac BlueBiolegend103114
Anti-CD45- Pe / Cy7Biolegend103114
مصفاة الخلية 70 & micro; m نايلونفيشر352350
كورنينج أنبوب الطرد المركزي المخروطي القاع 50 ملأفانتور21008-714
أنبوب اختبار كورنينج فالكون مع مصفاة خلية غطاء المفاجئةEMSCOمجهر تشريح 10004637 أوليمبوس
SZX-SDO2
DMEM ، تقنيات حياة الجلوكوز العالية11965084
DnaseRoche10104159001
DPBS بدون Ca++ & Mg++< / sup>14190136
Fc BlockBiolegend101320
HyClone مصل الأبقارالجنينية GE HealthcareSH30071.03
L-Glutamine (200 مل) LifeTechnologies25030-081
Liberase Research GradeSigma5401127001
Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL)Life Technologies15140-122
حمام مائي يهتز دقيقثيرمو فيشرTSSWB15
خلايا الدم الحمراء عازلةسيجماR7757
خياطة الحرير 4-0روبوزSUT-15-2
محلول

المراجع

  1. Partch, C. L., Green, C. B., Takahashi, J. S. Molecular architecture of the mammalian circadian clock. Trends in Cell Biology. 24, 90-99 (2014).
  2. Man, K., Loudon, A., Chawla, A. Immunity around the clock. Science. 354, 999-1003 (2016).
  3. Haspel, J. A., et al. Perfect timing: circadian rhythms, sleep, and immunity - an NIH workshop summary. JCI Insight. 5, (2020).
  4. Nosal, C., Ehlers, A., Haspel, J. A. Why Lungs Keep Time: Circadian Rhythms and Lung Immunity. Annual Review of Physiology. 82, 391-412 (2020).
  5. Gibbs, J., et al. An epithelial circadian clock controls pulmonary inflammation and glucocorticoid action. Nature Medicine. 20, 919-926 (2014).
  6. Ehlers, A., et al. BMAL1 links the circadian clock to viral airway pathology and asthma phenotypes. Mucosal Immunology. 11, 97-111 (2018).
  7. Sengupta, S., et al. Circadian control of lung inflammation in influenza infection. Nature Communications. 10, 4107(2019).
  8. Zhang, R., Lahens, N. F., Ballance, H. I., Hughes, M. E., Hogenesch, J. B. A circadian gene expression atlas in mammals: implications for biology and medicine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 16219-16224 (2014).
  9. Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9, 209-222 (2014).
  10. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and Characterization of Mononuclear Phagocytes in the Mouse Lung and Lymph Nodes. Methods in Molecular Biology. 1809, 33-44 (2018).
  11. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. Journal of Nuclear Medicine Technology. 39, 264-270 (2011).
  12. Tighe, R. M., et al. Improving the Quality and Reproducibility of Flow Cytometry in the Lung. An Official American Thoracic Society Workshop Report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61, 150-161 (2019).
  13. Anderson, K. G., et al. Cutting edge: intravascular staining redefines lung CD8 T cell responses. Journal of Immunology. 189, 2702-2706 (2012).
  14. Gibbings, S. L., et al. Three Unique Interstitial Macrophages in the Murine Lung at Steady State. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57, 66-76 (2017).
  15. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animals (NY). 37, 26-32 (2008).
  16. Ho, D., et al. Heart Rate and Electrocardiography Monitoring in Mice. Current Protocols in Mouse Biology. 1, 123-139 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD45

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.