مقالة منهجية

تحليل شبكة α أكتينين في الخلايا القلبية المشتقة من iPSC باستخدام المجهر توطين جزيء واحد

DOI:

10.3791/61605

⸱

نوفمبر 3, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Rostock University Medical Center, 2Faculty of Interdisciplinary Research, Department Life, Light & Matter, University Rostock, 3Department of Cardiology, Rostock University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكيل شبكة ساركومير المناسبة مهم لنضوج القلب المشتق من iPSC. نقدم نهجًا فائقًا قائمًا على القرار يسمح بالتقييم الكمي للنضج الهيكلي للخلايا الجذعية المشتقة من خلايا القلب، لتحسين ظروف الثقافة التي تعزز تطور القلب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نضوج القلب المشتق من iPSC هو قضية حاسمة لتطبيقها في العلاج التجديدي واختبار الأدوية وطراز الأمراض. على الرغم من تطوير بروتوكولات التمايز المتعددة ، فإن توليد عضلة القلب iPSC تشبه النمط الظاهري الشبيه بالراشد لا يزال صعبًا. أحد الجوانب الرئيسية لنضوج القلب و القلب ينطوي على تشكيل شبكة ساركومير منظمة تنظيما جيدا لضمان قدرة انكماش عالية. هنا، نقدم نهج فائقة القرار القائم على التحليل شبه الكمي لشبكة α actinin في cardiomyocytes. باستخدام المجهر التعريب photoactivated مقارنة طول السارومير وسمك القرص z من خلايا القلب المشتقة من iPSC والخلايا القلبية المعزولة عن أنسجة حديثي الولادة تم تنفيذها. في الوقت نفسه، نبرهن على أهمية ظروف التصوير المناسبة للحصول على بيانات موثوقة. تظهر نتائجنا أن هذه الطريقة مناسبة لمراقبة كمية النضج الهيكلي للخلايا القلبية ذات الدقة المكانية العالية ، مما يتيح الكشف عن التغيرات الدقيقة في تنظيم الساركومير.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) مثل احتشاء عضلة القلب أو اعتلال عضلة القلب لا تزال السبب الرئيسي للوفاة في العالم الغربي1. وبما أن قلب الإنسان لا يملك سوى ضعف القدرة التجديدية، هناك حاجة إلى استراتيجيات لتعزيز التعافي من الأمراض القلبية الوعائية. وهذا يشمل العلاجات استبدال الخلايا لتجديد خلايا القلب المفقودة (CM)، فضلا عن تطوير أدوية جديدة لمكافحة عدم انتظام النشاط التدخل الدوائي آمنة وفعالة. وقد تبين أن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) مصدر خلية واعدة للجيل غير محدود من CM الإنسان في المختبر، ومناسبة للعلاجات التجديدية، ونمذجة المرض، وتطوير فحص المخدرات المقايسات2،3،4.

على الرغم من وجود العديد من بروتوكولات تمايز القلب المختلفة ، لا يزال يوجد CM مشتق من iPSC بعض الجوانب الظاهرية والوظيفية التي تعوق المختبر وفي تطبيق vivo5،6. بجانب التغيرات الكهربية ، الأيضية ، والجزيئية ، تتضمن عملية نضوج القلب التنظيم الهيكلي للساركوميريات ، وهي الوحدات الأساسية المطلوبة لتوليد القوة وانكماش الخلايا7. في حين أن كبار CMs المعرض جهاز التعاقد منظمة تنظيما جيدا، وCMs المشتقة من iPSC عادة ما تظهر خيوط ساركومير غير مرتبة، المرتبطة انخفاض القدرة على الانكماش وتغيير ديناميات الانكماش8،9. على النقيض من درجة الحرارة الناضجة التي تظهر نمط انكماش uniaxial ، والهياكل مشوشة في نتائج CM غير ناضجة في تقلص شعاعي للخلية بأكملها أو تعزيز ظهور نقاط التركيز انكماش9،10.

لتحسين نضوج القلب، وقد تم تطبيق نهج متعددة، بما في ذلك 3D وسائل زراعة الخلايا، والتحفيز الكهربائي والميكانيكية، فضلا عن استخدام مصفوفات خارج الخلية محاكاة في ظروف الجسم الحي11،12،13. لتقييم نجاح وكفاءة هذه الظروف الثقافية المختلفة ، هناك حاجة إلى تقنيات لرصد وتقدير درجة النضج الهيكلي لـ iPSC CM ، على سبيل المثال ، عن طريق التقنيات المجهرية. على النقيض من التصوير confocal التقليدية، دقة في حالة المجهر تعريب مبطل ضوئي (بالم) هو ما يقرب من 10x أعلى. هذه التقنية بدورها تسمح لتحليل أكثر دقة، والكشف عن التعديلات حتى خفية من الهياكل الخلوية14. وبالنظر إلى الدقة العالية للتصوير القائم على النخلة، كان الهدف العام من هذه الطريقة هو التقييم المجهري لنضج الساروميري في CMS المشتقة من iPSC عن طريق التحديد الدقيق لسمك القرص z وطول الساركومير. في الدراسات السابقة، وقد تبين أن هذه السمات الهيكلية لتكون المعلمات المناسبة لتقييم نضج القلب15. على سبيل المثال، المرضى iPSC-CM تفتقر كامل طول ديستروفين معرض انخفاض طول الساركومير وعرض z-الفرقة بالمقارنة مع خلايا نوع البرية16. وبالمثل، تم قياس طول الساركوميريات الفردية للتحقيق في تأثير الإشارات الطبوغرافية على تطوير القلب16. ومن ثم، قمنا بتطبيق هذا النهج لتقييم النضج الهيكلي لشبكة ساركومير في iPSC-CM عن طريق قياس كمية طول الساركومير وسمك القرص z.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تنفيذ جميع الخطوات الواردة في هذا البروتوكول التي تشمل فئران حديثي الولادة والبالغين وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لرعاية الحيوانات من المركز الطبي جامعة روستوك.

1. زراعة وتفكك من iPSC المشتقة من القلب

  1. تمييز hiPSC-CMs لمدة 25 يوما باستخدام أسلوب أحادية 2D كما هو موضح سابقا17.
  2. قبل الدفء تفكك المتوسطة إلى 37 درجة مئوية ودعم متوسطة لدرجة حرارة الغرفة.
  3. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
  4. إضافة ما قبل الدفء تفكك المتوسطة إلى الخلايا واحتضان لمدة 12 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  5. إضافة دعم المتوسطة للخلايا.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم الوسائط دعم المضافة ضعف حجم الوسيطة الانفصام المستخدمة في الخطوة 1.4.
  6. طرد الخلايا باستخدام ماصات المصلية 5 مل.
  7. خلايا الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق و resuspend بيليه في 3 مل من hiPSC-CM ثقافة متوسطة17.
  8. خلايا البذور في 8 غرف القاع الزجاج جيدا في كثافة الخلية من 75،000 الخلايا / جيدا والثقافة لمدة 3 أيام.

2. عزل الكبار cardiomyocyte

  1. تم إجراء عزل وزراعة أمراض القلب البالغة من فئران NMRI كما تم الإبلاغ عنها سابقًا18.
  2. بذور الخلايا في 8 الزجاج جيدا شريحة الغرفة والثقافة ليوم واحد.

3. عزل وزراعة أمراض القلب الوليدية

  1. تم إجراء إجراء عزل أمراض القلب الوليدية، التي تم الحصول عليها من فئران NMRI، كما هو موضحسابقاً 19.
  2. بذور الخلية المعزولة في 8 8 زلقة غرفة زجاجية جيدا في كثافة الخلية من 75،000 خلية / جيدا والثقافة لمدة 3 أيام في ثقافة CM الوليدية المتوسطة19.

4. immunofluorescence وضع العلامات من شبكة α أكتينين

ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، يتم استزراع الخلايا في 8 غرف قاع الزجاج. يجب أن يتم وضع العلامات قبل يوم واحد من التصوير.

  1. Prewarm 4٪ PFA في 37 درجة مئوية.
  2. إصلاح iPSC-CM عن طريق إضافة 4٪ شبهformaldehyde مباشرة في وسائل الإعلام الثقافة (1:1 تخفيف) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. التركيز النهائي ل PFA لل التثبيت هو 2٪.
  3. احتضان الخلايا الثابتة في 0.2٪ تريتون-X، المخفف في برنامج تلفزيوني، لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل من.
  5. إضافة 1٪ BSA الحل (المخفف في برنامج تلفزيوني) واحتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. إعداد 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة α actinin 1:100 في 1٪ BSA، التي تحتوي على 0.05٪ تريتون-X. إضافة إلى الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
  7. غسل الخلايا مرتين مع 0.2% BSA الحل, 5 دقيقة لكل من.
  8. إعداد 150 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيف الماعز المضادة للماوس Alexa647 الأجسام المضادة 1:100 في 1٪ BSA، التي تحتوي على 0.05٪ تريتون-X. إضافة إلى الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة.
  9. غسل الخلايا مرتين مع 0.2% BSA الحل, 5 دقيقة لكل من.
  10. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني، 5 دقائق لكل من. إبقاء الخلايا المسمى في الظلام في 4 درجة مئوية حتى تصوير بالم.

5. إعداد المخزن المؤقت للتصوير بالم

ملاحظة: من الضروري إعداد المخزن المؤقت لتصوير PALM حديثاً لكل تجربة.

  1. إعداد 50% محلول الجلوكوز عن طريق حل 25 غرام من الجلوكوز في 50 مل من الماء المقطر.
  2. إعداد العازلة الأساسية التي تحتوي على 50 M تريس-HCl، 10٪ الجلوكوز و 10 mM كلوريد الصوديوم.
    1. ضبط مستوى درجة الحموضة إلى ~ 8.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
  3. إعداد حل الأكسيداز بيروانز عن طريق حل 0.6 ملغ بيروانز أوكسيداز في 316 μL من العازلة الأساسية.
  4. تحضير حل كاتالز عن طريق حل 7 ملغ من كاتالوز في 500 ميكرولتر من العازلة الأساسية. تخلط جيدا والطرد المركزي في 10،000 س ز لمدة 3 دقائق. الحفاظ على سوبرناتل لاستخدامها. يمكن الاحتفاظ بحل Catalase عند 4 درجة مئوية لعدة أيام.
  5. إعداد 500 ميكرولتر من بالم العازلة التصوير عن طريق خلط 316 ميكرولتر من حل أوكسيديز بيروانز، 25 ميكرولتر من حل كاتالاز، 100 ميكرولتر من 50٪ حل الجلوكوز، 50 ميكرولتر من السيستينمين، 5 ميكرولتر من cyclooctatetraene و 3.5 ميكرولتر من β-Mercaptoethanol. النشاط الحفاز النهائي من الأكسيداز البيرانوز و catalase تحتاج إلى أن تكون 7.5 U، 35،00U على التوالي.
    ملاحظة: يوفر المخزن المؤقت للتصوير بالم ظروف تصوير مثالية لـ 3-5 ساعات. إذا انخفضت قدرة الوميض للصبغة الفلورية، قم بإعداد aliquot العازلة الجديدة.

6. الحصول على صورة بالم

  1. قم بتشغيل المجهر على الأقل 3 ساعات قبل الاستخدام وجلب العينة إلى درجة حرارة الغرفة قبل التصوير للسماح بالتكرار الحراري. إذا تم تجهيز المجهر مع غرفة الحضانة، وضبط درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية.
  2. تنظيف الهدف والجزء السفلي من الشريحة غرفة باستخدام المذيبات التنظيف المناسب.
  3. إضافة 300 μL من بالم العازلة التصوير في بئر واحد من الخلايا المسماة وإدراج الشريحة الغرفة في حامل المرحلة من المجهر.
  4. تعيين معلمات الحصول على صورة PALM.
    1. اختر 1.57 N.A. 100x هدف النفط لاقتناء.
    2. حدد وضع PALM ثم قم بتنشيط إعدادات TIRF.
    3. ضبط عدد الإطارات التي سيتم الحصول عليها. عادة 5، 000-10، 000 إطارات كافية للحصول على أفضل النتائج. ومع ذلك، فإن عدد الإطارات المكتسبة يعتمد بشدة على كفاءة وضع العلامات والقدرة على الوميض للصبغة الفلورية ويمكن تعديلها من قبل المستخدم.
    4. تعيين الأشعة فوق البنفسجية الليزر السلطة إلى 0.1٪ و 647 ليزر إلى 0.2٪.
    5. تعيين مستوى الربح إلى 50-100.
    6. قم بالتبديل على إضاءة الليزر وحدد خلية الهدف. ويمكن زيادة مستوى الكسب إذا كانت كثافة الإشارة منخفضة (اعتماداً على وضع علامة الفلوريس).
    7. إيقاف إضاءة الليزر
  5. الحصول على صورة بالم
    1. خفض مكاسب إلى 0 وزيادة قوة الليزر (647 السابق) إلى 100٪.
    2. تبييض الخلية المستهدفة ل ~ 5 s.
    3. زيادة كسب إلى 50 وبدء الحصول على صورة بالم.
      ملاحظة: يجب ضبط الكسب للحصول على كثافة إشارة كافية بينما يجب تجنب وحدات البكسل المشبعة. إذا قلّت كثافة الإشارة، فزيد مستوى الكسب.
  6. اختياريا، تعزيز باطراد قوة الليزر الأشعة فوق البنفسجية (0.1٪-10٪) لزيادة كثافة الإشارة وتعزيز وامض من الفلوروفور.

7. إعادة بناء بيانات PALM

  1. افتح برنامج Image J ثم قم باستيراد بيانات PALM.
  2. فتح البرنامج المساعد العاصفة الرعدية و "تشغيل التحليل"
    1. في "إعداد الكاميرا" القائمة أدخل حجم بكسل وم م gain.
      ملاحظة: عند استخدام أهداف 100x وعدسة تكبير 1.6x، يكون حجم البكسل 100 نانومتر مناسبًا. ومع ذلك، حيث يعتمد حجم البكسل على ميزات الأجهزة الخاصة بالمجهر والكاميرا المستخدمة في تصوير PALM، يحتاج المستخدمون إلى التحقق بعناية من هذه المعلمة وتكييفها. يمكن الحصول على قيم كسب EM من بيانات التعريف.
    2. في "تشغيل قائمة التحليل" مجموعة المعلمات على النحو التالي: B-spline الترتيب: 3، مقياس B-spline: 2.0، ذروة كثافة عتبة: stf(Wave.F1)، نصف قطرها المناسب: 3، سيغما الأولي: 1.6، التكبير: 5.0، تحديث التردد: 50، التحولات الجانبي: 2. تأكيد عن طريق النقر على زر "Ok" .
  3. مرحلة ما بعد معالجة صورة PALM المعاد بناؤها
    1. في "رسم الرسم البياني" القائمة حدد"سيغما"المعلمة.
    2. استخدم أداة"Rectangle"لتحديد عائد الاستثمار، مع استبعاد القطع الأثرية المحتملة وتطبيق عائد الاستثمار على المرشح. ستظهر قيم عائد الاستثمار في مربع أمر التصفية.
    3. إضافة"& عدم اليقين <25" إلى قيم عائد الاستثمار. سوف تبدو الأمر مرشح ممكن مثل هذا: "(سيغما > 48.6821 & سيغما < 1117.40) & عدم اليقين & 25". تطبيق قيم سيجما المحددة.
    4. في"إزالة التكرارات"القائمة، أدخل عتبة مسافة "10 نانومتر" وتطبيق.
    5. في "دمج القائمة"، تعيين أقصى مسافة إلى "20"، الحد الأقصى للإطارات لكل جزيء إلى "0" والحد الأقصى قبالة الإطارات إلى "1". تطبيق الإعدادات.
    6. في"قائمة تصحيح الانجراف""، حدد تبادل الارتباط وتعيين "عدد من صناديق" إلى "5" و "التكبير" إلى "5.0". تطبيق إعدادات تصحيح الانجراف.
    7. حفظ صورة PALM النهائي وتصدير آخر البيانات المعالجة إذا رغبت في ذلك.

8. تحليل خيوط السارومير

  1. تحليل طول الساركومير
    1. افتح برنامج Image J ثم قم باستيراد صورة PALM التي تم إعادة بنائها.
    2. رسم خط بين الهياكل الساركومير المحددة عمودي على القرص z لقياس أقصر مسافة بين خيوط actinin.
    3. حدد "ملف تعريف المؤامرة" في "تحليل" القائمة والحصول على طول بين اثنين من القمم. كما طول ساركومير قد تختلف داخل خلية واحدة، ينبغي قياس ما لا يقل عن 20 ساركوميري في مناطق مختلفة من الخلية المستهدفة.
  2. تحليل سمك القرص z
    1. افتح برنامج Image J ثم قم باستيراد صورة PALM التي تم إعادة بنائها.
    2. تحويل صورة PALM التي تم إعادة بنائها إلى صورة وضع 8 بت.
    3. فتح البرنامج المساعد الكشف عن التلال وأدخل المعلمات التالية: عرض الخط: 20، التباين العالي: 230، التباين المنخفض: 10، سيغما: 0.79، عتبة أقل: 25.84، الحد الأدنى طول الخط: 20.
    4. تعيين "عرض التقدير"،"تمديد الخط"و "عرض النتائج".
    5. انقر فوق "موافق" واستخدم "متوسط عرض الخط" من جدول النتائج لمزيد من التحليلات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقدير درجة النضج الهيكلي ل CM، حديثي الولادة، بالغ ناضجة تماما، و iPSC CM وصفت في البداية CM مع الأجسام المضادة α actinin لتصور شبكة ساركومير. بعد الاستحواذ على PALM ، تم إعادة بناء الصور ، وتم قياس سمك القرص z باستخدام برنامج معالجة الصور المستند إلى البرنامج الإضافي للكشف التلقائي عن عرض خيوط فردية. تم حساب طول الساركومير عن طريق قياس المسافة بين قمتي شدة متجاورتين، تقابل خيوط مجاورة. ويبين الشكل 1 تقييم منظمة ساركومير في CM المشتق من iPSCs.

كما هو معروض في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن توليد CM المشتق من iPSC الوظيفي في المختبر مهم للعلاجات التجديدية ، والنمذجة المرض وتطوير منصات فحص المخدرات. ومع ذلك، النضج غير الكافي لهذه CM عقبة رئيسية في أبحاث القلب والأوعية الدموية20. وفي هذا الصدد، هناك حاجة إلى تقنيات تصوير عالية الدقة تمكن من رصد حالة النضج الهيكلي لـ CM المشتقة من iPSC. في الوقت نفسه، يمكن أن يكون المجهر فائق القرار أداة قيمة لتحليل وظيفة بروتينات محددة بدقة، المطلوبة لتشكيل ساركومير السليم كما هو موضح مؤخرا لالتين والتروبونين10،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذه الدراسة الصندوق الهيكلي للاتحاد الأوروبي (ESF/14-BM-A55-0024/18). بالإضافة إلى ذلك، يتم دعم H.L. من قبل برنامج FORUN من المركز الطبي لجامعة روستوك (889001 و 889003) ومؤسسة جوزيف وكاثي كلينز (T319/29737/2017). ويدعم C.I.L. من قبل برنامج العلماء السريرية للمركز الطبي جامعة روستوك. ويدعم R.D من قبل DFG (DA1296/6-1)، ومؤسسة دامب، ومؤسسة القلب الألمانية (F/01/12) وBMBF (VIP+ 00240).

نشكر مادلين بارتش على دعمها الفني في ثقافة خلايا iPSC وتمايز القلب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خط خلية iPSC البشريTakaraY00325
& micro - Slide 8 Well Glass Bottomibidi80827
0.5 مل أنبوب eppendorfEppendorf30121023
ألبومين مصل الأبقارSigma AldrichA906
طقم تفكك خلايا عضلة القلبتقنيات الخلايا الجذعية05025
كاتالازسيجما ألدريتشC40-1G
سيكلوكتاتيترينسيجما ألدريتش138924-1G
سيستيمينسيجما ألدريتش30070-10 جم
محلول ملحي مخزن بالفوسفات من دولبيكو بدون Ca2 + و Mg2 +ثيرمو فيشر14190169
F (ab') 2-Goat المضاد للفأر IgG Alexa Fluor 647Thermo FisherA-21237
برنامج معالجة الصور في فيجي (الصورة J)
الجلوكوزكارل روثX997.2
حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتشH1758
LSM 780 نظام ELYRA PS.1نظام زايس
بارافورمالدهايدميرك8187150100
بيرانوز أوكسيديزسيجما ألدريتشP4234-250UN
الجسم المضاد الساركميري ألفا الأكتينين [EA-53]Abcamab9465
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشS7653
ماء معقمكارل روث3255.1
تريتون X-100سيجما ألدريتشX100
قاعدة تريزماسيجما ألدريتشT1503
& بيتا ؛ ميركابتو إيثانولسيجما ألدريتش63689

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McAloon, C. J., et al. The changing face of cardiovascular disease 2000-2012: An analysis of the world health organisation global health estimates data. International Journal of Cardiology. 224, 256-264 (2016).
  2. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived Cardiac Cells for Drug and Toxicity Screening and Disease Modeling: What Micro- Electrode-Array Analyses Can Tell Us. Cells. 8 (11), 1331(2019).
  3. Ylä-Herttuala, S. iPSC-Derived Cardiomyocytes Taken to Rescue Infarcted Heart Muscle in Coronary Heart Disease Patients. Molecular Therapy. 26 (9), 2077(2018).
  4. Kadota, S., Shiba, Y. Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Transplantation for Heart Disease Treatment. Current Cardiology Reports. 21 (8), 73(2019).
  5. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  6. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Advanced Drug Delivery Reviews. 96, 110-134 (2016).
  7. Ali, H., Braga, L., Giacca, M. Cardiac regeneration and remodelling of the cardiomyocyte cytoarchitecture. The FEBS Journal. 287 (3), 417-438 (2020).
  8. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  9. Bedada, F. B., Wheelwright, M., Metzger, J. M. Maturation status of sarcomere structure and function in human iPSC-derived cardiac myocytes. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (7), 1829-1838 (2016).
  10. Dai, Y., et al. Troponin destabilization impairs sarcomere-cytoskeleton interactions in iPSC-derived cardiomyocytes from dilated cardiomyopathy patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-15 (2020).
  11. Huang, C. Y., et al. Enhancement of human iPSC-derived cardiomyocyte maturation by chemical conditioning in a 3D environment. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 138, 1-11 (2020).
  12. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  13. Lee, S., et al. Contractile force generation by 3D hiPSC-derived cardiac tissues is enhanced by rapid establishment of cellular interconnection in matrix with muscle-mimicking stiffness. Biomaterials. 131, 111-120 (2017).
  14. Baddeley, D., Bewersdorf, J. Biological Insight from Super-Resolution Microscopy: What We Can Learn from Localization-Based Images. Annual Review of Biochemistry. 87 (1), 965-989 (2018).
  15. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: A comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  16. Mahadev, K., Wu, X., Donnelly, S., Ouedraogo, R., Eckhart, A. D., Goldstein, B. J. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endothelial cells. Cardiovascular Research. 78 (2), 376-384 (2008).
  17. Lemcke, H., Skorska, A., Lang, C. I., Johann, L., David, R. Quantitative evaluation of the sarcomere network of human hiPSC-derived cardiomyocytes using single-molecule localization microscopy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2819(2020).
  18. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, langendorff-Free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  19. Lemcke, H., et al. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 117-127 (2016).
  20. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  21. Krysiak, J., et al. Protein phosphatase 5 regulates titin phosphorylation and function at a sarcomere-associated mechanosensor complex in cardiomyocytes. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  22. Zaunbrecher, R. J., et al. Cronos Titin Is Expressed in Human Cardiomyocytes and Necessary for Normal Sarcomere Function. Circulation. 140 (20), 1647-1660 (2019).
  23. Fornasiero, E. F., Opazo, F. Super-resolution imaging for cell biologists. BioEssays. Fornasiero, E. F., Opazo, F. , Wiley Online Library. (2015).
  24. Jeziorowska, D., et al. Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1173(2017).
  25. Kroll, K., et al. Electro-mechanical conditioning of human iPSC-derived cardiomyocytes for translational research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130, 212-222 (2017).
  26. Zuppinger, C., et al. Characterization of cytoskeleton features and maturation status of cultured human iPSC-derived cardiomyocytes. European Journal of Histochemistry. 61 (2), 145-153 (2017).
  27. Jradi, F. M., Lavis, L. D. Chemistry of Photosensitive Fluorophores for Single-Molecule Localization Microscopy. ACS Chemical Biology. 14 (6), 1077-1090 (2019).
  28. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  29. Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
  30. Chamma, I., Levet, F., Sibarita, J. B., Sainlos, M., Thoumine, O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single-molecule localization microscopy. Neurophotonics. 3 (4), 041810(2016).
  31. Ma, H., Fu, R., Xu, J., Liu, Y. A simple and cost-effective setup for super-resolution localization microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  32. Olivier, N., Keller, D., Gönczy, P., Manley, S. Resolution Doubling in 3D-STORM Imaging through Improved Buffers. PLoS One. 8 (7), 0069004(2013).
  33. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  34. Mikhaylova, M., et al. Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  35. Venkataramani, V., et al. Enhanced labeling density and whole-cell 3D dSTORM imaging by repetitive labeling of target proteins. Scientific Reports. 8 (1), 1-7 (2018).
  36. Erdélyi, M., et al. Origin and compensation of imaging artefacts in localization-based super-resolution microscopy. Methods. 88, 122-132 (2015).
  37. McGorty, R., Schnitzbauer, J., Zhang, W., Huang, B. Correction of depth-dependent aberrations in 3D single-molecule localization and super-resolution microscopy. Optics Letters. 39 (2), 275(2014).
  38. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  39. Pioner, J. M., et al. Isolation and mechanical measurements of myofibrils from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 6 (6), 885-896 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Alpha Actinin NetworkPhotoactivated Localization MicroscopySarcomere Length AnalysisZ Disc Thickness MeasurementCardiomyocyte Maturation AssessmentSuper Resolution ImagingPALM Image ReconstructionFluorescent Molecule Localization

مقالات ذات صلة