التحقيق في وظيفة الجين المستهدف في نموذج التهاب القولون الناجم عن الأجسام المضادة الناهضة CD40 باستخدام التقنيات القائمة على CRISPR / Cas9

ملخص

هنا ، نصف منهجية التخلص من الجين ذي الأهمية في الجهاز المناعي باستخدام التقنيات القائمة على التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / CRISPR (Cas9) وتقييم هذه الفئران في مجموعة من نموذج التهاب القولون الناجم عن الأجسام المضادة الناهضة للتمايز 40 (CD40).

الملخص

يعمل الجهاز المناعي للدفاع عن البشر ضد الغزاة الأجانب مثل البكتيريا والفيروسات. ومع ذلك ، قد تؤدي اضطرابات الجهاز المناعي إلى المناعة الذاتية والأمراض الالتهابية والسرطان. أمراض الأمعاء الالتهابية (IBD) - مرض كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC) - هي أمراض مزمنة تتميز بالتهاب الأمعاء الانتكاسي. على الرغم من أن مرض التهاب الأمعاء هو الأكثر انتشارا في البلدان الغربية (1 من كل 1,000) ، إلا أن معدلات الحوادث تتزايد في جميع أنحاء العالم. من خلال دراسات الارتباط ، ربط الباحثون مئات الجينات بأمراض مرض التهاب الأمعاء. ومع ذلك ، فإن علم الأمراض المتقن وراء مرض التهاب الأمعاء والعدد الكبير من الجينات المحتملة يشكلان تحديات كبيرة في العثور على أفضل الأهداف العلاجية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الأدوات اللازمة لتوصيف كل ارتباط جيني وظيفيا تقدم العديد من العوامل التي تحد من المعدل مثل توليد الفئران المعدلة وراثيا لكل جين. للتحقيق في الإمكانات العلاجية للجينات المستهدفة ، تم تطوير نظام نموذجي باستخدام التقنيات القائمة على التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / CRISPR (Cas9) ومجموعة من الأجسام المضادة الناهضة للتمايز 40 (CD40). تظهر الدراسة الحالية أنه يمكن استخدام التحرير بوساطة CRISPR / Cas9 في الجهاز المناعي للتحقيق في تأثير الجينات في الجسم الحي. يقتصر هذا النهج على حجرة المكونة للدم ، ويقوم بتحرير جهاز المناعة المعاد تكوينه الناتج بشكل موثوق. يتم إنشاء الفئران المعدلة بتقنية CRISPR / Cas9 بشكل أسرع وهي أقل تكلفة بكثير من الفئران التقليدية المعدلة وراثيا. علاوة على ذلك ، فإن تحرير CRISPR / Cas9 للفئران له مزايا علمية كبيرة مقارنة بتوليد وتربية الفئران المعدلة وراثيا مثل القدرة على تقييم الأهداف الجنينية المميتة. باستخدام CD40 كهدف نموذجي في نموذج التهاب القولون الناجم عن الأجسام المضادة الناهضة CD40 ، توضح هذه الدراسة جدوى هذا النهج.

المقدمة

تشير أمراض المناعة الذاتية إلى الحالات التي يهاجم فيها الجهاز المناعي للمريض خلاياه وأعضائه ، مما يؤدي إلى التهاب مزمن وتلف الأنسجة. تم وصف ما يقرب من 100 نوع مختلف من أمراض المناعة الذاتية حتى الآن ، والتي تؤثر على 3-5٪ من السكان¹. تفتقر العديد من أمراض المناعة الذاتية ، بما في ذلك الذئبة الحمامية الجهازية ومرض التهاب الأمعاء ، إلى العلاجات الفعالة وتقدم احتياجات طبية كبيرة غير ملباة. يصيب مرض التهاب الأمعاء حاليا حوالي 1.5 مليون شخص في الولايات المتحدة وحدها ، وهو مرض مدمر يتميز بالتهاب معوي تدريجي ومستمر وانتكاسي بدون علاج متاح. هناك حاجة إلى كشف التسبب في المرض الأساسي والفيزيولوجيا المرضية لتقديم استراتيجيات العلاج والوقاية الجديدة التي يحتاجها مرضى مرض التهاب الأمعاء^2،3.

تم تحديد أكثر من 230 موقعا مختلفا لمرض التهاب الأمعاء من خلال تحليلات الارتباط على مستوى الجينوم (GWAS)⁴. على الرغم من أن هذه الارتباطات أوضحت جينات جديدة يحتمل أن تكون لاعبا مهما في الآليات والمسارات الرئيسية لمرض التهاب الأمعاء ، فقد تمت دراسة عدد قليل فقط من الجينات من هذه المواقع. تورطت بعض الجينات في مسارات محددة. على سبيل المثال ، تم ربط مسار استشعار الميكروبات بالبروتين 2 المحتوي على مجال قلة الارتباط بالنيوكليوتيدات (NOD2). تم ربط مسار الالتهام الذاتي ب 16 الالتهام الذاتي المرتبط مثل 1 (ATG16L1) ، وعائلة GTPase المرتبطة بالمناعة M (IRGM) ، وعضو عائلة مجال التوظيف caspase 9 (CARD9) ؛ وقد تم ربط المسار المؤيد للالتهابات باستجابات الخلايا التائية التي تحركها إنترلوكين (IL) -23⁴. تم استخدام نماذج فأر مختلفة في الجسم الحي لتوصيف الجينات التي تم تحديدها وظيفيا من خلال GWAS^5،6.

أحد النماذج الرئيسية المستخدمة لدراسة التسبب في مرض التهاب الأمعاء^7،8 هو نموذج CD40 لالتهاب القولون ، والذي يحفز التهاب الأمعاء المناعي الفطري بعد حقن الجسم المضاد الناهض CD40 في الفئران التي تعاني من نقص المناعة (الخلايا التائية والخلية البائية). تستخدم بشكل أساسي لفحص مساهمة المناعة الفطرية في تطور مرض التهاب الأمعاء ، ومعظمها من البلاعم والخلايا المتغصنة⁹ ، ومن غير الواضح ما إذا كان يمكن إحداث المرض في الفئران البرية ذات المناعة الكاملة (WT). بالإضافة إلى النماذج الحيوانية ، هناك حاجة أيضا إلى أدوات خاصة بالجينات للتوصيف الوظيفي للجين ، بما في ذلك المركبات الكيميائية والبيولوجية. والأهم من ذلك ، أن المعدلة وراثيا ضرورية للكشف عن وظيفة جين معين. ومع ذلك ، فإن الاستراتيجيات المستخدمة عادة لحقن وتكاثر الفئران المعدلة وراثيا - غالبا ما تستغرق أكثر من عام وتتكبد تكلفة مالية كبيرة. تمثل عملية تحديد المعدل هذه تحديا كبيرا في السعي لتوضيح وظائف الجينات المرتبطة بمرض التهاب الأمعاء التي حددتها GWAS.

يوفر البروتوكول المقدم هنا بديلا قابلا للتطبيق لتربية الفئران المعدلة وراثيا. أولا ، كما هو موضح في الشكل 1 ، يتم عزل الخلايا التخطيطية ، السلبية ، الإيجابية لمستضد الخلايا الجذعية 1 ، مستقبلات التيروزين كيناز الإيجابية (النسب-Sca1 + c-Kit + أو LSK) من نخاع العظام لفئران Cas9 knockin (KI) التي تحمل أليلا محددا (CD45.2) للسماح بتتبع الخلايا المناعية للمتبرع. بعد ذلك ، تتعرض هذه الخلايا لفيروسات العدسات التي تحمل RNAs التوجيهية المختلفة (gRNAs) وعلامة الفلورسنت ، والبروتين الفلوري الأخضر المتحمس للبنفسج (VexGFP) ، للسماح بتتبع الخلايا المنقولة. بعد يومين ، يتم فرز خلايا VexGFP + وحقنها في فئران المتلقي المميت Ly5.1 Pep Boy ، وهي فئران C57Bl / 6 تحمل أليل CD45.1 للسماح بتتبع الخلايا المناعية المتلقية. بعد اثني عشر أسبوعا ، يتم إعادة تكوين الجهاز المناعي بالكامل ، ويمكن تسجيل الفئران في نماذج في الجسم الحي.

بالإضافة إلى الاستفادة من توفير التكاليف والوقت الأسرع للتوليد مقارنة بتوليد وتربية المعدلة وراثيا ، فإن هذه المنهجية مثالية للأهداف الجنينية المميتة ، لأنها تستهدف على وجه التحديد الحيز المكونة للدم. علاوة على ذلك ، بالنسبة للأهداف التي لا تتوفر فيها أدوات ، مثل الجسم المضاد ، يوفر هذا النظام نهجا ممكنا. باختصار ، لمواجهة التحديات الموصوفة حتى الآن ، تم تطوير منصة تحرير الجينوم القائمة على CRISPR / Cas9 في الجسم الحي لإنشاء نماذج حيوانية معدلة وراثيا^{بسرعة 10،11،12،13،14}. توضح هذه الدراسة أن التهاب الأمعاء في الفئران WT C57Bl / 6 يمكن أن يحدث عن طريق الجسم المضاد الناهض CD40. CD40 هو منظم رئيسي للمرض في هذا النموذج ، وبالتالي تم استخدامه كهدف نموذجي للتحقق من صحة خروج المغلوب المستند إلى CRISPR / Cas9 وفقدان وظيفة الجينات.

البروتوكول

يجب أن تتم الموافقة على جميع التجارب على التي يتم إجراؤها وفقا لهذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية المعنية لرعاية واستخدامه (IACUC). تمت الموافقة على جميع الإجراءات الموضحة هنا من قبل AbbVie IACUC.

1. توليد فيروسات العدسات المطلوبة وشراء المانحة والمتلقية

ملاحظة: يتضمن جدول المواد تفاصيل رقم المصدر والطلب لجميع والأدوات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. قم ببناء البلازميدات باستخدام ناقل lentiGuide-puro المعدل إلى VexGFP أو mCherry.
   1. استنساخ gRNA غير المستهدف (SgNone) أو gRNA المستهدف CD40 في المتجه المعدل.
      ملاحظة: في هذه الدراسة ، كانت تسلسلات كل gRNA على النحو التالي: SgNone ، CTATGATTGCAACTGTGCAG. SgCD40.1 ، AGCGAATCTCCCTGTTCCAC ؛ SgCD40.2 ، GACAAACAGTACCTCCACGA. و SgCD40.3 ، ACGTAACACACTGCCCTAGA.
   2. إنتاج جزيئات الفيروسات العدسية كما هو موضح^{سابقا 15}.
      1. شارك في نقل البلازميدات المشفرة gRNA إلى خلايا 293T باستخدام بلازميدات التعبئة VSV-G و pLEX.
      2. قم بتغيير وسط المزرعة بعد 18 ساعة من التعدي ، واجمع المواد الطفية التي تحتوي على الفيروس بعد 24-48 ساعة بعد التغيير المتوسط.
      3. لتقييم كفاءة CD40 gRNA ، قم بإنشاء خط خلية CD40 مستقر 293T عن طريق تعداء بلازميد pcDNA3.1 الذي يشفر ل CD40.
   3. قم بنقل الخلايا باستخدام الفيروسات العدسية الموصوفة ، وقم بتقييمها عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) بعد أسبوعين.
      ملاحظة: تم استخدام فئران Cas9 KI كفئران متبرعة. تأكد من أن فئران Cas9 KI موجودة على خلفية C57Bl / 6 (وتعبر عن أليل CD45.2) عند استخدام فئران C57Bl / 6-Ly5.1 Pep Boy (التي تعبر عن أليل CD45.1) كمتلقين ، لذلك يتم تجنب GvHD وتتبع الخلايا المانحة والمتلقية.
2. صمم التجربة. بالنسبة للضربة القاضية للجينات (KO) ، استخدم 3-6 gRNAs لكل جين. لكل gRNA ، قم بإعداد 20٪ من الفئران المتلقية الإضافية لحساب فقدان أثناء الزرع وبعده.
   ملاحظة: يتطلب نموذج التهاب القولون الناجم عن الأجسام المضادة الناهضة CD40 ما لا يقل عن 8 فئران لكل مجموعة للطاقة الإحصائية. ومن ثم ، تم تحضير 10 فئران لكل gRNA في هذه الدراسة. سيختلف عدد الفئران اللازمة لنماذج أخرى في الجسم الحي بناء على النموذج المستخدم.
3. استخدم الفئران المانحة والمتلقية من نفس الجنس التي تتراوح أعمارها بين 8 و 12 أسبوعا.
   ملاحظة: تم القتل الرحيم للفئران بموجب المبادئ التوجيهية المعتمدة من IACUC باستخدام 5٪ على الأقل من الأيزوفلوران وتأكد من خلع عنق الرحم كطريقة ثانوية.

2. حصاد نخاع العظم والتحضير لفرز الخلايا

1. باستخدام الملقط والمقص ، قم بحصاد العظام من كل فأر متبرع (عظم الفخذ ، والساق ، وعظم العضد ، والزند) ، وإزالة أكبر قدر ممكن من العضلات / الأنسجة بعناية.
2. ثقب الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.6 مل بإبرة 23 جم ، وضع الأنبوب داخل أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. اصنع 2 مجموعات لكل.
3. اقطع أحد طرفي العظام لفتحها ، وضع 4-8 عظام داخل أنبوب الطرد المركزي الدقيق مع نهايات مفتوحة متجهة نحو فتحة الإبرة 23 G.
   ملاحظة: يعتمد عدد العظام لكل أنبوب على العظام ، على سبيل المثال ، 8 عظم ظنبوب ، عظم العضد ، وزند أو 4 عظم الفخذ مناسبة.
4. جهاز الطرد المركزي للأنابيب (مع أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.6 مل الذي يحتوي على العظام داخل أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 مل) عند 300 × جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT).
5. تخلص من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.6 مل ، والذي يحتوي الآن على عظام بدون نخاع ، تاركا فقط أنبوب الطرد المركزي سعة 1.5 مل مليئا الآن بالنخاع. أضف 1 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (الذي يحتوي على كلوريد الأمونيوم) إلى كل أنبوب طرد مركزي ، وأعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب العينات. احتضن في RT لمدة 1 دقيقة. كرر خطوة التحلل إذا لزم الأمر.
6. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، وأضف محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (على الأقل ضعف حجم تعليق الخلية) لتحييد المخزن المؤقت للتحلل. خلايا الحبيبات في 300 × جم لمدة 5 دقائق. استنشق المادة الطافية تماما.
7. قم بتحميل مرشح 70 ميكرومتر على أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، وقم بتصفية الخلايا من خلالها ، باستخدام DPBS لغسل الأنبوب والفلتر. تجاهل الفلتر، وعد الخلايا.
   ملاحظة: سيؤدي استخدام 30 فأرا متبرعا (عمرها 12 أسبوعا) إلى إنتاج 200-300 × 10⁶ خلايا في المتوسط.

3. فرز الخلايا لعزل خلايا LSK للنقل

1. أعد تعليق الخلايا التي تم عدها في الخطوة 2.7 في المخزن المؤقت لفرز الخلايا المغناطيسية (MACS) (DPBS ، 2 ملي مولار حمض رباعي الأسيتيك إيثيلين ديامين ، 0.5٪ ألبومين مصل بقري ، 10 ميكروغرام / مل بنسلين ستربتومايسين) بالحجم المطلوب (90 ميكرولتر لكل 10⁷ خلايا).
2. أضف 10 ميكرولتر من حبات CD117 + لكل 10⁷ خلايا. تخلط جيدا ، وتحميها من الضوء ، وتحتضنها عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
3. قم بإعداد عمود MACS LS عن طريق وضع العمود في المجال المغناطيسي وشطفه باستخدام المخزن المؤقت MACS.
4. اغسل الخلايا من الخطوة 3.2 بحجم مناسب من المخزن المؤقت MACS (ضعف مستوى الصوت على الأقل) ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
5. استنشق المادة الطافية تماما. أعد تعليق الحبيبات بحيث يكون التركيز النهائي 10⁸ خلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
6. ضع تعليق الخلية على عمود LS. يغسل ب 3 مرات مع 3 مل من المخزن المؤقت MACS.
   ملاحظة: يمكن أن يستوعب عمود LS واحد ما يصل إلى 10⁸ خلايا مسماة و 2 × 10⁹ خلايا إجمالية.
7. قم بإزالة العمود من الفاصل المغناطيسي ، وضعه في أنبوب تجميع مناسب. أضف 5 مل من المخزن المؤقت MACS ، وقم على الفور بإخراج الخلايا المصنفة مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس بقوة إلى العمود.
8. حبيبات الخلايا في 300 × جم لمدة 10 دقائق. استنشق المادة الطافية تماما.
9. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS لكل 10⁷ خلايا ، وأضف الأجسام المضادة للتلطيخ للنسب (CD3 ، B220 ، Ter119 ، Gr-1 ، CD11b) و Sca-1.
   ملاحظة: سيؤدي استخدام 30 فأرا متبرعا (عمرها 12 أسبوعا) إلى إنتاج 100-180 × 10⁶ خلايا في المتوسط.
10. تخلط جيدا ، وتحميها من الضوء ، وتحتضنها عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
11. اغسل الخلايا بإضافة 5-10 مل من المخزن المؤقت MACS ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق. استنشق المادة الطافية تماما.
12. إعادة تعليقما يصل إلى 10⁸ خلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لأجهزة MACS
13. قم بتصفية الخلايا بمصفاة خلية 70 ميكرومتر ، وقم بإجراء FACS لسكان النسب Sca1 +.
    ملاحظة: يجب أن يكون ما يقرب من 1.8-2.6٪ من السكان من سلالة - Sca1 +.
14. اجمع الخلايا في وسط استزراع LSK (100 ميكرولتر لكل 10,000 خلية): وسط تمدد خال من المصل ، 100 نانوغرام / مل ثرومبوبويتين ، عامل الخلايا الجذعية للفأر ، تيروزين كيناز 3 مرتبط ب FMS ، و IL-7 مع 100 ميكروغرام / مل بنسلين ستربتومايسين.
15. خلايا الحبيبات في 300 × جم لمدة 10 دقائق. استنشق المادة الطافية تماما.

4. نقل LSK والثقافة لتوليد خلايا التحكم والضربة القاضية

1. أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة LSK.
2. قم بزرع 10,000 خلية لكل بئر في ألواح زراعة الأنسجة ذات القاع المسطح (TC) المكونة من 96 بئرا في وسط زراعة LSK.
3. احتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 95٪ رطوبة في ظروف معقمة.
4. قم بإعداد محلول ريترونكتين 50 ميكروغرام / مل في DPBS ، وأضف 300 ميكرولتر إلى كل بئر من صفيحة البوليسترين 24 بئرا غير المعالجة ب TC. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
5. في اليوم التالي ، تخلص من محلول الريترونكتين ، واشطف اللوحة المطلية ب 300 ميكرولتر من DPBS ، وكررها.
6. انقل 50,000 خلية LSK في 500 ميكرولتر من المتوسط (5 آبار من الصفيحة المكونة من 96 بئرا في الخطوة 4.2) إلى كل بئر مطلي بالرجعية من صفيحة البوليسترين المكونة من 24 بئرا من الخطوة 4.4 ، استخدم 100 ميكرولتر إضافي من وسط LSK لكل 5 آبار لشطف وجمع أي خلايا إضافية متبقية في لوحة 96 بئرا. تأكد من أن 600 ميكرولتر هو الحجم لكل بئر في الصفيحة المكونة من 24 بئرا بعد هذه الخطوة (5 × 100 ميكرولتر من الألواح المكونة من 96 بئرا + 100 ميكرولتر المستخدمة لغسل تلك الآبار الخمسة).
   ملاحظة: بعد النقل ، انظر تحت المجهر إلى لوحة 24 بئر الفارغة الآن للتأكد من أن جميع الخلايا قد تم جمعها. استخدم وسيط LSK لجمع الخلايا التي لم يتم نقلها لتقليل فقدان الخلايا من هذه المجموعة الصغيرة.
7. أضف 300 ميكرولتر من المادة الطافية للفيروس إلى كل بئر ، ورج الطبق بقيمة إعداد 500 لمدة 5 دقائق. قم بتدوير الطبق على حرارة 600 × جم و 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. استخدم ما لا يقل عن 5 × 10 6 جزيئات^{فيروسية} لكل مل.
   ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام ناقل معدل من pLentiPuro ، حيث تم تبديل عنصر مقاومة البيورومايسين إلى VexGFP. تمت إضافة الفيروس في تعدد العدوى من 50-100.
8. احتضان لمدة 1 ساعة. أضف 500 ميكرولتر من وسط LSK الدافئ مسبقا.
9. احتضن لمدة يومين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 95٪ رطوبة في ظل ظروف معقمة.

5. تشعيع للتحضير لنقش الخلايا الجذعية للمتبرع

1. بعد يومين من الحضانة ، قم بإشعاع المتلقية ب 475 cGy مرتين بفاصل 4 ساعات. بعد الجولة الثانية من التشعيع ، ضع في أقفاص معقمة ، وعاملها كحيوانات تعاني من نقص المناعة لمدة 12 أسبوعا. تلقت الفئران التخصيب والهيدروجيل ومراقبة جانب القفص لتوفير الرعاية الداعمة والتدخل حسب الحاجة. قد تتلقى الفئران المضادات الحيوية الطعام أو الماء بالإضافة إلى الرعاية الداعمة وطرق التدخل.
   ملاحظه. قد تختلف جرعات التشعيع باختلاف المشعات. قم بإجراء معايرة جرعة من المبرد لتحديد أفضل جرعة. تم العثور على جرعات تتراوح بين 700 و 1300 cGy للفئران C57Bl / 6 لتكون فعالة في أمثلة أدبية مختلفة¹⁷. حدد 3-4 جرعات في هذا النطاق ، وقم بتقييم 5 فئران لكل جرعة للبقاء على قيد الحياة والنقش. إذا لم ينجح النقش أو كانت جرعة الإشعاع عالية جدا ، فلن تعيش الفئران بعد 3 أسابيع من النقش. بعد 4 أسابيع من النقش ، قم بنزيف الفئران الباقية على قيد الحياة لتقييم النقش بواسطة FACS. نقوم بإجراء مجموعات دم رجعية مدارية (RO) ~ 50-100 ميكرولتر لكل فأر لتقييم النقش. كانت الفئران تحت التخدير (2-3٪ إيزوفلوران) أثناء الجمع وتلقت مواد تشحيم العين و 1.0 مل من محلول ملحي تحت الجلد كرعاية داعمة بعد جمع الدم RO.

6. تحضير الخلايا والحقن في المتلقية للإشعاع

1. قم بإخراج الخلايا من كل بئر من الخطوة 4.9 ، مع الحفاظ على المجموعات منفصلة الآن بعد أن تم تحويل الخلايا ب gRNAs مختلفة ، وقم بتكبيلها عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
2. أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت لأجهزة MACS ، وقم بالتصفية باستخدام مصفاة 70 ميكرومتر ، وفرز مجموعة VexGFP +.
   ملاحظة: يجب أن يكون ما يقرب من 10-15٪ من الخلايا VexGFP +.
3. حبيبات الخلايا في 300 × جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليقها في محلول الملح المتوازن من هانك: 5,000 خلية أو أكثر لكل فأر في 200 ميكرولتر.
   ملاحظة: HBSS من الدرجة غير الصيدلانية. يمكنك أيضا التفكير في استخدام محلول ملحي معقم من الدرجة الصيدلانية للحقن.
4. حقن الخلايا عن طريق الوريد بعد 3 ساعات من آخر جرعة من التشعيع.
   ملاحظة: بعد اثني عشر أسبوعا ، سيكون لدى الفئران جهاز مناعي مطعمة بالكامل ويمكن تسجيلها في نماذج في الجسم الحي.

7. نموذج التهاب القولون الناجم عن الأجسام المضادة الناهضة CD40 في الفئران البرية

ملاحظة: قم بوزن وتقييمها يوميا. تقديم الرعاية الداعمة حسب الحاجة: 1.0 مل من محلول كلوريد الصوديوم تحت الجلد عند فقدان الوزن بنسبة 10٪ أو إذا كانوا يعانون من الجفاف. التحكم الإيجابي لهذا النموذج هو مضاد p40 يجرعات داخل الصفاق عند 25 مجم / كجم مرتين في الأسبوع بدءا من اليوم -1.

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تضمنت المجموعات التجريبية مجموعات التحكم الساذجة ، والتحكم في السيارة (السلبية) ، ومجموعات التحكم المضادة ل p40 (الإيجابية). تتحكم هذه المجموعات معا في السلوك الطبيعي لنموذج التهاب القولون الناجم عن الأجسام المضادة CD40. مجموعات Vector و SgNone و SgRNA: عناصر التحكم في النواقل للناقل الفيروسي الشائع ، SgNone عبارة عن عنصر تحكم إرشادي غير مستهدف ، ومجموعات SgRNA هي مجموعات "العلاج" التي تحمل تعبيرا منخفضا عن gRNA المستهدف.

1. اليوم 0: حقن الجسم المضاد الناهض CD40 بمعدل 10 مجم / كجم داخل الصفاق في DPBS في جميع باستثناء التحكم الساذج.
2. اليومان 3 و 6: إجراء التنظير الداخلي بالفيديو لتقييم تطور المرض كما هو موضح^{سابقا 16}.
   1. تخدير الفئران بنسبة 2-3٪ إيزوفلوران. توفير الدعم الحراري عبر آلية آلة التخدير الداخلية و / أو وسادة الحرارة الخارجية أثناء التعافي.
   2. بمجرد أن تخضع الفئران للتخدير ، قم بإعطاء حقنة شرجية DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) لتحضير القولون للتنظير الداخلي.
      ملاحظة: مطلوب ما يقرب من 1-2 مل لإجراء حقنة شرجية.
   3. بعد حقنة شرجية وأثناء التخدير ، حرك الفأر إلى مخروط الأنف في جهاز التخدير.
   4. أدخل المنظار برفق في القولون ، وتقدم ببطء إلى القولون القريب مع إبقاء الكاميرا في المنتصف والقولون منفوخا بالهواء (باستخدام مضخة الهواء المرفقة أو توصيل أنبوب / حقنة للنفخ يدويا) ، ثم اسحب المنظار ببطء واجمع مقطع فيديو وصور على بعد 3 سم و 2 سم و 1 سم من فتحة الشرج.
      ملاحظة: لتقليل تهيج القولون ، يمكن إضافة مواد تشحيم معقمة إلى طرف المنظار.
   5. قم بتسجيل كل صورة على حدة بناء على نمط الأوعية الدموية وسماكة الغشاء المخاطي كما هو موضح في الجدول 1. اجمع الدرجات من 3 صور لكل فأرة لتعيين مجموع نقاط لكل.
3. اليوم 7: القتل الرحيم لجميع الفئران عن طريق جرعة زائدة من الأيزوفلوران أو غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ ، وجمع أكبر قدر ممكن من الدم عن طريق ثقب القلب للمصل. قم بوزن الطحال لقياس تضخم الطحال وجمعه لقياس التدفق الخلوي ، واجمع القولون لعلم الأنسجة المرضية.
   ملاحظة: تم تحضير أقسام الأنسجة الثابتة بالفورمالين والبارافين من القولون الفأر واستخدامها في الكيمياء المناعية (IHC) كما هو موضح سابقا من قبل Wang et al¹⁹.

النتائج

باتباع الإجراء الموضح أعلاه ، تم إنشاء الفئران التي تعبر عن gRNA المستهدف ب CD40. بحلول الأسبوع 2 ، تم تطعيم الخلايا البائية ، والضامة CD11b + ، والخلايا المتغصنة CD11c + (DCs) (الشكل 2). ومع ذلك ، استغرقت الخلايا التائية ، كما هو متوقع بناء على الأدبيات السابقة¹⁸ ، وقتا أطول لتطعيم بالكامل وتطلبت 12 أسبوعا بعد النقش للوصول إلى ~ 90٪ (الشكل 2). كانت الأعضاء المناعية ، مثل الطحال والغدد الليمفاوية ، تضم أبر...

المناقشة

تقدم النتائج المعروضة هنا منصة جديدة لتحرير الجينوم تستند إلى CRISPR / Cas9 قادرة على التحقيق في وظيفة الجينات في نموذج التهاب القولون الناجم عن الأجسام المضادة CD40. أدى فرز الخلايا إلى إثراء مجموعة خلايا LSK المعدلة وراثيا ، مما أدى إلى انخفاض بنسبة تزيد عن 90٪ في تعبير CD40 داخل المعاد تكوينها - في 4 أشهر فقط. علاوة على ذلك ، كان للتعبير المنخفض عن CD40 داخل الجهاز المناعي تأثير عميق داخل نموذج التهاب القولون الناجم عن الأجسام المضادة الناهضة CD40 ، مما قلل بشكل كبير من نقاط نهاية الم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
لوحات زراعة الأنسجة ذات 6 آبار Corning	/ Costar	# 3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 & micro ؛ وحدة التصفية m	Millipore	#SLHV013SL
0.6 مل أنبوب الطرد المركزي	Axygen	MCT-060-CS
1.5 مل أنبوب Eppendorf	Axygen	MCT-150-CS
15 مل مخروطي	VWR	21008-918
23 G إبرة	VWR	# 305145
24 ألواح جيدة غير TC	Falcon	# 351147
24-Well TC Plates	Falcon	# 353047
50 مل أنبوب مخروطي	VWR	21008-951
5 مل حقنة	BD Biosciences	# 309647
70 & micro ؛ m Filter	Miltenyi	# 130-098-462
96 جيدا ألواح القاع المسطحة	Corning	# 3599
96 Well U-Bottom Plates	Corning / Costar	# 3365
آلة التخدير	VetEquip - COMPAC5	# 901812
المضادة ل CD40 الناهض الجسم المضاد أحادي النسيلة	BioXcell	BE-0016
المضاد ل p40 الجسم المضاد أحادي النسيلة	BioXcell	BE-0051
B220 PE الأجسام المضادة	BioLegend	# 103208
ألبومين مصل الأبقار	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Mice	Jackson	Labs # 026179	C57Bl / 6 background
CD117 + الخرز	Miltenyi	# 130-091-224
CD11b PE الأجسام المضادة	BioLegend	# 101208
CD3 PE الأجسام المضادة	BD Biosciences	# 553240
جهاز طرد مركزي	Beckman Coulter	Allegra 6KR أجهزة الطرد
كونترتوب أجهزة الطرد المركزي	Eppendorf	الطرد المركزي 5424
DPBS	ThermoFisher	# 14190136
Dulbecco ' s Modified Eagle Medium	Mediatech	# 10-013-CV
حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين ديامين (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
المنظار	Karl Storz	N / A	الخلوي المخصص Coloview Tower
	BD Biosciences	FACS Aria II
التيروزين كيناز المرتبط ب FMS 3 ligand (Flt-L)	PeproTech	# 250-31L
Gr-1 PE الأجسام المضادة	BD Biosciences	# 553128
محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS)	ThermoFisher	# 14170120
مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	# 217-17
Incubator	Binder	# 9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	# 6679401710
LS Column	Miltenyi	# 130-042-041
Ly5.1 Pepboy Mice	Jackson	Labs # 002014	C57Bl / 6
عامل الخلايا الجذعية للفأر في الخلفية (mSCF)	PeproTech	# 250-03
كلوريد الصوديوم (NaCl)	Hospira	# 00409488850
OPTI-MEM وسائط خالية من المصل	Invitrogen	# 31985-070
البنسلين ستربتومايسين (PenStrep) ThermoFisher		# 15140-122
Plate Shaker	ThermoFisher	# 88880023
pLentiPuro	Addgene	# 52963
Polybrene (10 & micro ؛ ز /& مايكرو ؛ L)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
عازلة تحلل خلايا الدم الحمراء	eBioscience	# 00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Antibody	BioLegend	# 108112
StemSpan	StemStem Cell Technologies	# 09600
Ter119 PE الأجسام المضادة	eBioscience	# 12-5921
ثرومبوبويتين (TPO)	PeproTech	# 315-14
السينية	الدقة الأشعة السينية	X-Rad 320