تم الإبلاغ هنا عن نظام لتصوير الكالسيوم في التصرف بحرية Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه بشكل جيد. يسمح هذا النظام للباحثين باستحضار الاهتزازات غير الموضعية ذات الخصائص التي يتم التحكم فيها جيدا عند الإزاحة على نطاق النانو وتحديد تيارات الكالسيوم أثناء استجابات C. elegans للاهتزازات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير الكالسيوم في سلوك حر Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه بشكل جيد
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تؤثر القوى الميكانيكية غير الموضعية ، مثل الاهتزازات والموجات الصوتية ، على مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية من التطور إلى التوازن. الحيوانات تتعامل مع هذه المحفزات عن طريق تعديل سلوكها. يتطلب فهم الآليات الكامنة وراء هذا التعديل السلوكي تحديد كمية النشاط العصبي أثناء سلوك الاهتمام. هنا ، نبلغ عن طريقة لتصوير الكالسيوم في التصرف بحرية Caenorhabditis elegans مع اهتزاز غير موضعي بتردد وإزاحة ومدة محددة. تسمح هذه الطريقة بإنتاج اهتزاز غير موضعي يتم التحكم فيه جيدا باستخدام محول طاقة صوتي وتحديد كمية استجابات الكالسيوم المستحثة بدقة خلية واحدة. كدليل على المبدأ ، يتم إثبات استجابة الكالسيوم لخلية عصبية داخلية واحدة ، AVA ، أثناء استجابة هروب C. elegans للاهتزاز. سيسهل هذا النظام فهم الآليات العصبية الكامنة وراء الاستجابات السلوكية للمحفزات الميكانيكية.
المقدمة
غالبا ما تتعرض الحيوانات لمحفزات ميكانيكية غير موضعية مثل الاهتزازات أو الموجات الصوتية 1,2. نظرا لأن هذه المحفزات تؤثر على التوازن والتنمية والتكاثر ، يجب على الحيوانات تعديل سلوكياتها للتعامل معها3،4،5. ومع ذلك ، فإن الدوائر العصبية والآليات الكامنة وراء هذا التعديل السلوكي غير مفهومة بشكل جيد.
السلوك الحسي الميكانيكي في الديدان الخيطية ، Caenorhabditis elegans ، هو نموذج سلوكي بسيط ، حيث عادة ما تغير الديدان السلوك من الحركة الأمامية إلى استجابة الهروب إلى الخلف عندما تواجه اهتز....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. زراعة الديدان حتى تصوير الكالسيوم
- قبل أربعة أيام من تجربة تصوير الكالسيوم، انقل اثنين من ديدان ST12 البالغة إلى صفيحة جديدة متوسطة النمو الخيطية (NGM) (جدول المواد) حيث يتم رسم الإشريكية القولونية OP50 في نمط مربع (حوالي 4 مم × 4 مم) باستخدام موزع الخلايا بحيث تقضي الدودة معظم الوقت في البكتيريا أثناء تصوير الكالسيوم12.
- احتضن لوحة NGM هذه لمدة 4 أيام عند 20 درجة مئوية في حاضنة (جدول المواد).
2. إعداد الأجهزة
- قم بإعداد مجهر مجهز بجهاز كهرضغطي للتحفيز13 ، وعدسة موضوعية 2x ، وكاميرا sCMOS عالية السرعة ، وبصريات تقسي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا ، يتم استخدام دودة تعبر عن كل من GCaMP و TagRFP تحت سيطرة المروج الخاص ب AVA interneuron كمثال على تصوير الكالسيوم في التصرف بحرية C. elegans. تم الحصول على بيانات قناة GCaMP و TagRFP كسلسلة من الصور ، بعضها موضح في الشكل 6 وكفيلم (فيلم تكميلي 1). كما تم تحديد إزاحة صفيحة بتري الناجمة عن نظام الاهتزاز غير الموضعي (الشكل 7). يمكن التحكم في الإزاحة عن طريق تعيين قيمة السعة في برنامج التحكم في الاهتزاز (الشكل 3B
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بشكل عام ، يتطلب التحديد الكمي للنشاط العصبي إدخال مسبار و / أو قيود على حركة جسم الحيوان. ومع ذلك ، بالنسبة لدراسات السلوك الحسي الميكانيكي ، فإن الإدخال الغازي للمسبار والقيود نفسها تشكل محفزات ميكانيكية. يوفر C. elegans نظاما للتحايل على هذه المشاكل ، لأن ميزاته شفافة ولأنه يحتوي على دائرة عصبية بسيطة ومدمجة تضم 302 خلية عصبية فقط. الجمع بين هذه المزايا والطريقة التي تم تطويرها سابقا لإثارة الاهتزازات غير الموضعية للإزاحة النانوية13 ، كما هو موضح هنا طريقة لتصوير الكالسيوم غير الغازي ل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
نشكر مركز Caenorhabditis Genetics Center على توفير السلالات المستخدمة في هذه الدراسة. تم دعم هذا المنشور من قبل JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant No. JP18H02483)، بشأن مشروع "علم الروبوت الناعم" في المجالات المبتكرة (رقم المنحة. JP18H05474)، وPRIME من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (رقم المنحة 19gm6110022h001)، ومؤسسة شيمادزو.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>بيانات anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | المؤلف | لتحليل البيانات المكتسبة | |
| Mathematica12 | Wolfram | لتشغيل برنامج anaysis البيانات DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans سلالات | |||
| الإشريكية القولونية < / م > OP50 | مركز علم الوراثة Caenorhabditis | OP50 | الغذاء ل C. elegans.< / em> Uracil auxotroph. E. القولوني< / em> ب. |
| سلالة lite-1 (ce314) < / em> سلالة | Caenorhabditis Genetics | Center KG1180 | للضوء متحولة |
| lite-1 (ce314) < / em> تعبر عن NLS-GCaMP-NLS و TagRFP تحت سيطرة مؤلف المروج المميز | AVA ST12 | lite-1 (ce314) < / em> متحور يحمل الجينات التي تعبر عن NLS-GCaMP5G-NLS (NLS ؛ إشارة توطين نووية) و TagRFP تحت سيطرة FLP < / EM > -18 المروج كمصفوفات خارج الحمرة | |
| < قوي > مقياس اهتزاز دوبلر ليزر < / قوي > | |||
| Lase Doppler اهتزاز | Polytec Japan | IVS-500 | للقياس الكمي التردد والإزاحة الناتجة عن محول |
| <القوي > نظام ماكرو < / قوي > | |||
| Assay.txt | المؤلف | برنامج نصي للتحكم مؤقتا وبشكل خاص في الماوس في Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | برنامج تنزيل مجاني للتحكم في مؤشر الماوس بناء على برنامج نصي |
| <قوي> نيماتودا لوحة وسائط النمو< / قوي> | |||
| أجار منقى ، مسحوق | ناكاراي تيسك | 01162-15 | ل تحضير ألواح NGM |
| باكتو بيبتون | بيكتون ديكنسون | 211677 | لتحضير ألواح NGM |
| كلوريد الكالسيوم | واكو | 036-00485 | لتحضير ألواح NGM |
| الكوليسترول | واكو | 034-03002 | لتحضير ألواح NGM |
| ثنائي فوتسيوم هيدروجين فوسفات | ناكاراي تيسك | 28727-95 | لتحضير ألواح NGM |
| مرق LB ، Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | لاستزراع E. القولوني< / em> OP50 |
| كبريتات المغنيسيوم اللامائية | TGI | M1890 | لتحضير ألواح NGM |
| ثنائي هيدروجين فوسفات البوتاسيوم | Nakarai tesque | 28720-65 | لتحضير ألواح NGM |
| كلوريد الصوديوم | Nakarai tesque | 31320-05 | لتحضير ألواح NGM |
| أطباق بتري (60 مم) | Nunc | 150270 | لتحضير ألواح NGM |
| < جهاز اهتزاز قوي > غير موضعي < / قوي > | |||
| مكبر للصوت | LEPY | LP-A7USB | للتحفيز مع اهتزاز يمكن التحكم |
| محول الطاقة الصوتي | MinebeaMitsumi | LVC25 | للتحفيز مع اهتزاز يمكن التحكم |
| WaveGene الإصدار 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | تنزيل مجاني لبرنامج التحكم في خاصية الاهتزاز |
| <قوي > غير جراحي تصوير الكالسيوم < / قوي > | |||
| 2 قناة منضدة 3 مراحل بدون فرش DC تحكم مؤازر | Thorlabs | BBD202 | تحكم متوافقة مع MLS203-1 |
| مراحل 479/585 نانومتر مرشح ممر النطاق الترددي المزدوج BrightLine | Semrock | FF01-479 / 585-25 | للحصول على صور قناتين (GCaMP و TagRFP) |
| 505/606 نانومتر BrightLine ثنائي الحافة القياسي ثنائي اللون ثنائي اللون Epi-fluorescence ثنائي | Semrock | FF505 / 606-Di01-25x36 | للحصول على صورتين من قناتين (GCaMP و TagRFP) |
| 512/25 نانومتر مرشح ممر النطاق الترددي أحادي النطاق | BrightLine Semrock | FF01-512 / 25-25 | للحصول على صورتين من قناتين (GCaMP و TagRFP) |
| 630/92 نانومتر BrightLine مرشح ممر النطاق الترددي أحادي | النطاق Semrock | FF01-630 / 92-25 | للحصول على صور قناتين (GCaMP و TagRFP) |
| كمبيوتر | Dell | Precision T7600 | Windows7 مع وحدة المعالجة المركزية Intel Xeon ES-2630 و 8 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي |
| مرحلة XY الآلية عالية السرعة | Thorlabs | MLS203-1 | مرحلة مسح XY السريع |
| لتقسيم الصور | Hamamatsu الضوئيات | A12801-01 | للحصول على صور قناتين (GCaMP و TagRFP) تم إنشاؤها بواسطة W-VIEW GEMINI بصريات تقسيم الصور |
| مصدر ضوء LED | CoolLED | pE-4000 | لتوليد ضوء الإثارة 470 نانومتر و 560 نانومتر |
| مجهر | كاميرا أوليمبوس | MVX10 | |
| sCMOS | كاميرا Andor | Zyla | |
| x 2 عدسة موضوعية | أوليمبوس | MVPLAPO2XC | العمل 20 مم وعددية فتحة 0.5 |
| <قوية>بلازميد | |||
| pKDK66 مؤلف البلازميد | pKDK66 | الحقن المشترك | |
| pTAK83 | المؤلف | pTAK83 | البلازميد للتعبير عن TagRFP تحت سيطرة flp< / em>-18 المروج |
| pTAK144 مؤلف البلازميد | pTAK144 | البلازميد للتعبير عن NLS-GCaMP5G-NLS تحت سيطرة ؛ ال flp< / em>-18 المروج | |
| <قوي>برنامج التتبع< / قوي> | |||
| homingback.vi | المؤلف | ملف SubVi لتتبع بقعة فلوريسنت لدودة من خلال التحكم في التغذية المرتدة لكاميرا sCMOS والمرحلة الآلية | |
| XY | LabVIEW الأدوات | لتشغيل برنامج | |
| التتبع Zyla Control ver.2.6CI.vi | المؤلف | لتتبع بقعة فلوريسين للدودة من خلال التحكم في التغذية الراجعة لكاميرا sCMOS والمرحلة الآلية x-y |
المراجع
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
