نحن نقدم طريقة خالية من المعدلة وراثيا (المعدلة وراثيا خالية) للحصول على الخلايا مع النمط الظاهري العصبية من خلايا الدم الطرفية المبرمجة. تنشيط مسار الإشارات المرتبطة بروتين الإنسان الجديد المرتبطة GPI يكشف عن طريقة فعالة خالية من المعدلة وراثيا للحصول على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الجيل الخالي من المعدلة وراثيا من الخلايا العصبية المشتقة من الدم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحدث العديد من الاضطرابات العصبية البشرية بسبب انحطاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ. بسبب القيود المفروضة في الاستراتيجيات الدوائية وغيرها من الاستراتيجيات العلاجية، لا يوجد حاليا علاج متاح للدماغ المصاب أو المريض. استبدال الخلايا يظهر كاستراتيجية علاجية واعدة للظروف العصبية. حتى يومنا هذا، تم إنشاء الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) بنجاح من أنسجة الجنين أو الخلايا الجنينية البشرية (ES) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). بدأت عملية التمايز عن طريق تفعيل البروتين الجليكوبروتين البشري المرتبط ب GPI ، والذي يؤدي إلى توليد خلايا جذعية متعددة القدرات. هذه الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) تفرق في المختبر إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي كما هو مبين في المجهر الساطع والمناعة. يؤكد التحليل الهيكلي الفائق لهذه الخلايا عن طريق المجهر الإلكتروني بنيتها البدائية وكذلك مورفولوجيا تشبه الخلايا العصبية وخصائص دون الخلوية.
المقدمة
تطوير طرق أبحاث الخلايا الجذعية الأساسية وقبل السريرية يشجع التطبيق السريري للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للأمراض العصبية. يعتمد هذا العلاج المحتمل بشكل حاسم على طريقة توليد الخلايا العصبية البشرية مما يؤدي إلى الانتعاش الوظيفي1.
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) تجديد الذات وتفرق إلى خلايا عصبية جديدة طوال الحياة في عملية تسمى تكوين الأعصاب الكبار. فقط مناطق الدماغ المقيدة جدا تؤوي NSCs المختصة لتوليد الخلايا العصبية حديثي الولادة في مرحلة البلوغ. يمكن أن تؤدي هذه NSCs إلى خلايا عصبية ناضجة ، والتي تشارك في التعلم والذاكرة ، وبالتالي استبدال الخلايا العصبية المفقودة أو التالفة. لسوء الحظ، هذه NSCs موجودة بكميات ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على الموافقات الأخلاقية عند إجراء التجارب.
1. عزل خلايا الدم المحيطي البشري أحادية النوى (PBMNCs)
- التأكد من أن جميع المتبرعين وقعوا على موافقة مستنيرة قبل سحب الدم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- خذ 30 مل من الدم من المتبرعين الأصحاء من قبل الموظفين الطبيين المدربين وفقا للبروتوكول القياسي.
- عزل PBMNCs حسب كثافة التدرج الوسائط. استخدم 10 مل من الوسائط مع 25 مل من الدم المخفف بموجب الفوسفات العازل (PBS)، والطرد المركزي عند 300 × ز لمدة 30 دقيقة.
- عزل الطبقة الفاصلة بين البلازما ووسائط تدرج الكثافة عن طريق الأنابيب. اغسل الخلايا المعزولة ب 5 مل من برنامج تلفزيوني معقم وطارد مركزي عند 3....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تقدم النتائج أدلة على أن هذه الطريقة الجديدة الخالية من جنرال موتورز قادرة على إعادة خلايا سلف الدم إلى حالتها الأكثر بدائية دون العمل مباشرة على الجينوم البشري.
لقد أظهرنا سابقا أن البروتين المرتبط ب GPI يبدأ الربط المتبادل بين الأجسام المضادة المحددة عبر PLCа/IP3K/Akt/mTOR/PTEN من الجينات ذات الصلة بالتنمية المحفوظة للغاية مثل WNT و NOTCH و C-Kit ، وبالتالي بدء عملية dedifferentiation تؤدي إلى الخطوة الأولى إلى جيل من HSCs والثانية والأخيرة لجيل من BD-PSCs6
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تعتمد طريقة إعادة برمجة الخلايا البشرية غير المعدلة وراثيا الموصوفة في هذا العمل على تنشيط الغشاء إلى النواة لآلات الإشارات (الآلات) وراء بروتين الغشاء البشري المرتبط ب GPI الذي يبدأ عملية التمايز مما يؤدي إلى توليد الجسم الحي السابق وتوسيع PSCs ذاتية التجديد التي يتم الحصول عليها من الدم المحيطي البشري غير المتلاعب به. هذه الخلايا عندما مثقف في وسائل الإعلام المناسبة قادرة على إعادة التمايز إلى خلايا تنتمي إلى طبقات جرثومية مختلفة6.
تظهر البيانات المقدمة في هذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلف المقابلة تعلن أنها صاحب براءة اختراع تتعلق رواية الإنسان GPI المرتبطة البروتين فضلا عن أنها شاركت في تأسيس ويعمل في ACA CELL التكنولوجيا الحيوية. ويعلن أصحاب البلاغ الآخرون أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
مكرسة لذكرى الدكتور راينر سافريش.
يشعر المؤلفون بالامتنان بشكل خاص لخوسيه مانويل غارسيا فيردوغو وفيسنتي هيرانز بيريز على إجراء تجارب EM وتحليلها في مختبر البيولوجيا العصبية المقارنة، معهد كافانيليس للتنوع البيولوجي والبيولوجيا التطورية، جامعة فالنسيا، CIBERNED، فالنسيا، إسبانيا، والذي تم دعمه بتمويل بحثي من منحة بروميتيو لمجموعات أبحاث التميز PROMETEO/2019/075. بقية هذا العمل كان مدعوما من قبل ACA CELL التكنولوجيا الحيوية GmbH هايدلبرغ، ألمانيا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الألبومين الكسر V | روث | T8444.4 | |
| مضاد GFAP Cy3 مترافق | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| تم إيقاف مجموعة صلاحية الخلية AO / PI | Biozym | 872045 | Biozym. المنتج الذي تنتجه Logos Biosystems. |
| حمض الأسكوربيك 2-فوسفات سيكيماغنيس | سيجما ألدريتش | A8960-5G | |
| B27 خالية من المصل 50x | فيشر ساينتفيك (جيبكو) | 11530536 | |
| حل FGF الأساسي | فيشر Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | وسائط التدرج الكثافة |
| BSA Frac V 7.5٪ | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | حبات مغناطيسية بحجم نانو |
| شرائح عد الخلايا Luna | Biozym | 872010 | Biozym توقفت. المنتج الذي تنتجه Logos Biosystems. |
| الشرائح مختبر - تيك | فيشر 10234121 | ||
| D-MEM / F12 | ميرك ميليبور | FG4815-BC | |
| دوركوبان | سيجما ألدريتش | 44610 | راتنجات الايبوكسي |
| FBS | ميرك ميليبور | S0115 / 1030B | توقف. متاح تحت: TMS-013-B |
| GDNF المؤتلف البشري | فيشر Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde درجة | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| خلية الصوديوم الهيبارين | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| سيترات | الرصاص Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL عداد الخلايا الآلي | Biozym | 872040 | Biozym توقف. المنتج الذي تنتجه Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trenns & auml ؛ ulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| كاميرا مورادا الرقمية | أوليمبوس | ||
| مولتيبلات نونكلون 4 آبار | فيشر 10507591 | ||
| N2 الملحق 100x | فيشر العلمي (جيبكو) | 11520536 | |
| نيوروقاعدال متوسط | جيبكو | 10888022 | |
| PBS معقم | روث 9143.2 | ||
| بولي إل أورنيثين | سيجما ألدريتش | P4957-50ML | |
| سوبر غرو-3 لوكتايت | هنكل | ||
| TEM FEI Technai G2< / sup> سبيريت | FEI أوروبا | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
المراجع
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neur....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدمتنشيط البروتين السكري المرتبط بـ GPIعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطيالطرد المركزي بتدرج الكثافةالاختيار السلبي لـ CD45وسط التمايز العصبيطلاء اللامينين والأورنيثينمجهر الفلورة المناعيةتحليل المجهر الإلكترونيالعلاج الخلوي غير المسبب للتشوهات المسخية
