يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الجيل الخالي من المعدلة وراثيا من الخلايا العصبية المشتقة من الدم

2.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/61634

⸱

فبراير 13, 2021

 ,  ,  , 
1ACA CELL Biotech GmbH, 2Departmento Ciencias Biomedicas, Universidad Cardenal Herrera-CEU

في هذه المقالة

ملخص

نحن نقدم طريقة خالية من المعدلة وراثيا (المعدلة وراثيا خالية) للحصول على الخلايا مع النمط الظاهري العصبية من خلايا الدم الطرفية المبرمجة. تنشيط مسار الإشارات المرتبطة بروتين الإنسان الجديد المرتبطة GPI يكشف عن طريقة فعالة خالية من المعدلة وراثيا للحصول على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

الملخص

تحدث العديد من الاضطرابات العصبية البشرية بسبب انحطاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ. بسبب القيود المفروضة في الاستراتيجيات الدوائية وغيرها من الاستراتيجيات العلاجية، لا يوجد حاليا علاج متاح للدماغ المصاب أو المريض. استبدال الخلايا يظهر كاستراتيجية علاجية واعدة للظروف العصبية. حتى يومنا هذا، تم إنشاء الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) بنجاح من أنسجة الجنين أو الخلايا الجنينية البشرية (ES) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). بدأت عملية التمايز عن طريق تفعيل البروتين الجليكوبروتين البشري المرتبط ب GPI ، والذي يؤدي إلى توليد خلايا جذعية متعددة القدرات. هذه الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) تفرق في المختبر إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي كما هو مبين في المجهر الساطع والمناعة. يؤكد التحليل الهيكلي الفائق لهذه الخلايا عن طريق المجهر الإلكتروني بنيتها البدائية وكذلك مورفولوجيا تشبه الخلايا العصبية وخصائص دون الخلوية.

المقدمة

تطوير طرق أبحاث الخلايا الجذعية الأساسية وقبل السريرية يشجع التطبيق السريري للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للأمراض العصبية. يعتمد هذا العلاج المحتمل بشكل حاسم على طريقة توليد الخلايا العصبية البشرية مما يؤدي إلى الانتعاش الوظيفي1.

الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) تجديد الذات وتفرق إلى خلايا عصبية جديدة طوال الحياة في عملية تسمى تكوين الأعصاب الكبار. فقط مناطق الدماغ المقيدة جدا تؤوي NSCs المختصة لتوليد الخلايا العصبية حديثي الولادة في مرحلة البلوغ. يمكن أن تؤدي هذه NSCs إلى خلايا عصبية ناضجة ، والتي تشارك في التعلم والذاكرة ، وبالتالي استبدال الخلايا العصبية المفقودة أو التالفة. لسوء الحظ، هذه NSCs موجودة بكميات محدودة وهذا التكوين العصبي المحدود ينخفض بسرعة خلال نمو الأحداث2. لذلك ، يجب النظر في مصادر أخرى للخلايا العصبية في هدف العلاج الخلوي.

من الصعب علاج الأمراض العصبية التنكسية باستخدام النهج الدوائية القياسية. وتستند استراتيجيات علاجية جديدة لاحتضان العديد من الاضطرابات العصبية التي لا يمكن عصبها على علاجات استبدال الخلايا من الأنسجة المريضة والمصابة. زرع NSC يمكن أن تحل محل الخلايا التالفة وتوفير آثار مفيدة. وتشمل المصادر الأخرى لاستبدال الخلايا العصبية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC)، والتي تستمد من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الأريمية الثديية3، وكذلك iPSCs4، والتي لديها قدرة واسعة على التجديد الذاتي مثل ESCs وقادرة على التفريق إلى أنساب الخلايا المختلفة. ويمكن أيضا أن تنشأ NSCs عن طريق إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية البشرية تجنب الدولة متعددة القدرات5.

العلاج ببدائل الخلايا لا يزال يمثل مشكلة صعبة. على الرغم من أن ESC أو الجنين أو iPS يمكن أن يكون مصدرا لتوليد الخلايا العصبية لعلاج العديد من الأمراض العصبية غير القابلة للشفاء ، فإن استبدال خلايا SCs البالغة الذاتية للأنسجة التالفة هو بديل أفضل يتحايل على المخاوف المناعية والأخلاقية والسلامة.

تفعيل البروتين البشري المرتبط ب GPI عن طريق ربط الأجسام المضادة عبر الفوسفور من PLCа/PI3K/Akt/mTor/PTEN يبدأ متمايزة خلايا سلف الدم وتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs)6. هذه الخلايا تفرق في المختبر نحو الخلايا العصبية كما أكد عن طريق التحليل المجهري للإلكترون برايتفيلد والمناعة وانتقال الإلكترون (TEM).

في هذا العمل نقوم بوصف الجيل الخالي من المعدلات وراثيا من BD-PSCs وإعادة تمايزها بنجاح إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على الموافقات الأخلاقية عند إجراء التجارب.

1. عزل خلايا الدم المحيطي البشري أحادية النوى (PBMNCs)

  1. التأكد من أن جميع المتبرعين وقعوا على موافقة مستنيرة قبل سحب الدم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  2. خذ 30 مل من الدم من المتبرعين الأصحاء من قبل الموظفين الطبيين المدربين وفقا للبروتوكول القياسي.
  3. عزل PBMNCs حسب كثافة التدرج الوسائط. استخدم 10 مل من الوسائط مع 25 مل من الدم المخفف بموجب الفوسفات العازل (PBS)، والطرد المركزي عند 300 × ز لمدة 30 دقيقة.
  4. عزل الطبقة الفاصلة بين البلازما ووسائط تدرج الكثافة عن طريق الأنابيب. اغسل الخلايا المعزولة ب 5 مل من برنامج تلفزيوني معقم وطارد مركزي عند 300 × ز لمدة 10 دقائق.
  5. عد عدد الخلايا بالطرق القياسية باستخدام غرفة العد.

2. تفعيل البروتين الجليكوبروتين البشري المرتكز على GPI بواسطة الأجسام المضادة التي تتشابك على سطح PBMNCs

  1. ضع الخلايا أحادية النووية 6 ×10 6 (MNCs) في أنابيب 15 مل وأد ربط الأجسام المضادة عن طريق احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الخاصة ببروتين الغشاء المرتبط ب GPI البشري (30 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة في PBS مع 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA) عند 37 درجة مئوية.
  2. استبدال وسيط الحضانة مع المتوسطة Dulbecco المعدلة من إيسكوف تستكمل مع مصل البقر الجنين 10٪ (FBS).
  3. تنمو الخلايا في 15 مل أنابيب البوليسترين، ووضع الأنابيب في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 8-10 أيام (دون اهتزاز). على D5، إضافة إضافية 1-2 مل من المتوسطة إيسكوف تكملها مع 10٪ FBS إلى كل أنبوب 15 مل.

3. فرز الخلايا المتمايزة التي تم إنشاؤها حديثا

  1. عد الخلايا مع عداد الخلية الآلي (18 μL تعليق الخلية + 2 ميكرولتر صبغة مضان) أو في غرفة العد.
  2. الطرد المركزي تعليق الخلية المستزرعة (5-7 × 106) في 300 × ز لمدة 10 دقيقة ونسبر الناسخ الناتج مع ماصة باستور معقمة.
  3. إعادة تعليق بيليه الخلية في 90 ميكرولتر من درجة الحموضة برنامج تلفزيوني المبردة مسبقا 7.2، 0.5٪ BSA و 2 M M EDTA.
  4. أضف CD45 حبات مغناطيسية إيجابية بحجم نانو (80 ميكرولتر) إلى تعليق الخلية واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
  5. غسل الخلايا بإضافة 2 مل من المخزن المؤقت PBS والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة.
  6. إعادة تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS.
  7. غسل العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة برنامج تلفزيوني المبردة مسبقا ووضعه في المجال المغناطيسي.
  8. ضع تعليق الخلية على العمود واغسله ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني (مرتين) وتدفق الطرد المركزي الذي يحتوي على خلايا سلبية CD45. جمعها في المتوسطة إيسكوف تكملها مع 1٪ BSA.
  9. عد الخلايا في غرفة العد.

4. إعداد أطباق زراعة الخلايا للتمايز العصبي للخلايا الجذعية التي تم إنشاؤها حديثا

  1. معطف الأوعية الثقافة مع بولي-L-ornithine واللامينين لنمو الخلايا العصبية.
  2. ضع الأغطية الزجاجية في لوحات 4-جيدا ومعطف مع 1:5 المخفف بولي-L-ornithine (0.1 ملغ/مل في ddH2O) في DDH2O. وضع الأغطية في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ثم يغسل مع DDH2O.
  3. تذوب ببطء صفح (0.5-2.0 ملغ / مل) وإضافة إلى الجزء العلوي من coverlips. احتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  4. إعداد الحث العصبي متوسط N2 تتكون من 49 مل من D-MEM/F12, 500 ميكرولتر من N2 الملحق, 400 ميكرولتر من الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA), الحل الأساسي FGF في 20 نانوغرام / مل التركيز النهائي (أعدت من 100 ميكروغرام / مل محلول الأسهم), وهيبارين في 2 نانوغرام / مل التركيز النهائي.
  5. إزالة صفح الزائدة عن طريق pipetting وإضافة N2 الخلايا العصبية المتوسطة إلى أطباق الثقافة.

5. زراعة خلايا الدم المتمايزة العصبية

  1. الثقافة BD المشتقة CD45 الخلايا السلبية على الأغطية الزجاجية المغلفة بالنعناع / ornithine لمدة 2 أيام في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في N2 المتوسطة لبدء التمايز العصبي للخلايا التي ولدتها BD حديثا.
  2. خلايا الثقافة كذلك في الوسط التمايز العصبي تتكون من 48 مل من المتوسط العصبي, 500 ميكرولتر من L-الجلوتامين, 1 مل من الملحق B27, 500 ميكرولتر من NEAA, 50 ميكرولتر من العامل العصبي المشتق من الدبقية البشرية المؤتلفة (GDNF) عند 5 ميكروغرام/250 ميكرولتر في PBS/0.1٪ BSA، و50 ميكرولتر من الدماغ البشري المؤتلف عامل الضوائية العصبية المشتقة (BDNF) في 5 ميكروغرام/200 ميكرولتر في PBS/0.1٪ BSA و 50 ميكرولتر من محلول حمض الأسكوربيك 2.9 غرام/50 مل في برنامج تلفزيوني. ضع لوحات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.

6. تحليل المجهر المناعي للخلايا العصبية المشتقة من الدم

  1. ثقافة الخلايا كما هو موضح أعلاه لمدة 16 يوما وإزالة وسائل الإعلام.
    1. احتضان مع مثبت قبل الحارة تتكون من 75 مل من الماء العقيم، 4 غرام من بارافورمالديهايد. إضافة 10 N NaOH حسب الحاجة ويحرك حتى ينجلي الحل. ثم أضف 10 مل من 10x PBS، 0.5 مل من MgCl2، 2 مل من 0.5 M EGTA، و 4 غرام من السكروز. تيترات إلى درجة الحموضة 7.4 مع 6 N HCl، وجلب إلى 100 مل من المياه العقيمة لمدة 15 دقيقة، وفقا لمارسينكووآخرون.
    2. تجاهل المثبت وغسل الخلايا 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة. إضافة على الفور الطازجة 0.3٪ تريتون X-الحل و permeabilize الخلايا لمدة 5 دقائق. غسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة حل حظر التي أدلى بها برنامج تلفزيوني و 5٪ BSA.
    3. منع الخلايا في درجة حرارة الغرفة على لوحة الروك لمدة 1 ساعة.
    4. إعداد التخفيف المناسب من الأجسام المضادة في 1٪ BSA / PBS واحتضان الخلايا مع تخفيف الأجسام المضادة على لوحة الروك لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منهما، واحتضان الخلايا مع DAPI وجبل coverlips مع وسائل الإعلام المتصاعدة للتصور على المجهر.
      ملاحظة: يتم سرد الأجسام المضادة المسماة مباشرة المستخدمة في هذه التجربة في جدول المواد.

7. تحليل المجهر الإلكتروني انتقال الخلايا التي تم إنشاؤها حديثا

  1. بذور الخلايا لTEM في الشرائح غرفة 8-جيدا.
  2. إصلاح الخلايا في 3.5٪ الجلوتارالدهيد لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية، بعد الإصلاح في 2٪ OsO4 لمدة ساعة إضافية في درجة حرارة الغرفة ووصمة عار في خلات أورانيل 2٪ في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة 30 دقيقة.
  3. وأخيرا، شطف الخلايا في الماء المقطر، وتجفيفه في الإيثانول وتضمينها في راتنج الايبوكسي بين عشية وضحاها. في اليوم التالي نقل العينات إلى فرن 70 درجة مئوية لمدة 72 ساعة لتصلب الراتنج.
  4. فصل ثقافات الخلايا المضمنة من الشريحة غرفة والغراء لكتل araldite.
  5. قطع أقسام شبه رقيقة المسلسل (1.5 ميكرومتر) مع آلة، جبل على الزجاج الشرائح وصمة عار طفيفة مع الأزرق toluidine 1٪.
  6. الغراء المقاطع المحددة شبه رقيقة لكتل araldite وفصلها عن الشريحة الزجاجية عن طريق تجميد المتكررة (في النيتروجين السائل) وذوبان الجليد.
  7. إعداد أقسام ultrathin (0.06-0.08 ميكرومتر) مع آلة ومزيد من التباين مع سترات الرصاص.
  8. الحصول على ميكروجراف باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي مع الكاميرا الرقمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تقدم النتائج أدلة على أن هذه الطريقة الجديدة الخالية من جنرال موتورز قادرة على إعادة خلايا سلف الدم إلى حالتها الأكثر بدائية دون العمل مباشرة على الجينوم البشري.

لقد أظهرنا سابقا أن البروتين المرتبط ب GPI يبدأ الربط المتبادل بين الأجسام المضادة المحددة عبر PLCа/IP3K/Akt/mTOR/PTEN من الجينات ذات الصلة بالتنمية المحفوظة للغاية مثل WNT و NOTCH و C-Kit ، وبالتالي بدء عملية dedifferentiation تؤدي إلى الخطوة الأولى إلى جيل من HSCs والثانية والأخيرة لجيل من BD-PSCs6

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعتمد طريقة إعادة برمجة الخلايا البشرية غير المعدلة وراثيا الموصوفة في هذا العمل على تنشيط الغشاء إلى النواة لآلات الإشارات (الآلات) وراء بروتين الغشاء البشري المرتبط ب GPI الذي يبدأ عملية التمايز مما يؤدي إلى توليد الجسم الحي السابق وتوسيع PSCs ذاتية التجديد التي يتم الحصول عليها من الدم المحيطي البشري غير المتلاعب به. هذه الخلايا عندما مثقف في وسائل الإعلام المناسبة قادرة على إعادة التمايز إلى خلايا تنتمي إلى طبقات جرثومية مختلفة6.

تظهر البيانات المقدمة في هذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلف المقابلة تعلن أنها صاحب براءة اختراع تتعلق رواية الإنسان GPI المرتبطة البروتين فضلا عن أنها شاركت في تأسيس ويعمل في ACA CELL التكنولوجيا الحيوية. ويعلن أصحاب البلاغ الآخرون أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

مكرسة لذكرى الدكتور راينر سافريش.

يشعر المؤلفون بالامتنان بشكل خاص لخوسيه مانويل غارسيا فيردوغو وفيسنتي هيرانز بيريز على إجراء تجارب EM وتحليلها في مختبر البيولوجيا العصبية المقارنة، معهد كافانيليس للتنوع البيولوجي والبيولوجيا التطورية، جامعة فالنسيا، CIBERNED، فالنسيا، إسبانيا، والذي تم دعمه بتمويل بحثي من منحة بروميتيو لمجموعات أبحاث التميز PROMETEO/2019/075. بقية هذا العمل كان مدعوما من قبل ACA CELL التكنولوجيا الحيوية GmbH هايدلبرغ، ألمانيا.
 

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الألبومين الكسر VروثT8444.4
مضاد GFAP Cy3 مترافقMerck MilliporeMAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555Merck MilliporeMAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488Merck MilliporeMAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488BD Pharmingen560381
تم إيقاف مجموعة صلاحية الخلية AO / PIBiozym872045Biozym. المنتج الذي تنتجه Logos Biosystems.
حمض الأسكوربيك 2-فوسفات سيكيماغنيسسيجما ألدريتشA8960-5G
B27 خالية من المصل 50xفيشر ساينتفيك (جيبكو)11530536
حل FGF الأساسيفيشر Scientific (Gibco)10647225
BiocollMerck MilliporeL6115-BCوسائط التدرج الكثافة
BSA Frac V 7.5٪Gibco15260037
CD45 MicroBeadsMiltenyi130-045-801حبات مغناطيسية بحجم نانو
شرائح عد الخلايا LunaBiozym872010Biozym توقفت. المنتج الذي تنتجه Logos Biosystems.
الشرائح مختبر - تيكفيشر 10234121
D-MEM / F12ميرك ميليبورFG4815-BC
دوركوبانسيجما ألدريتش44610راتنجات الايبوكسي
FBSميرك ميليبورS0115 / 1030Bتوقف. متاح تحت: TMS-013-B
GDNF المؤتلف البشريفيشر Scientific (Gibco)10679963
GlutaMax 100xGibco35050038L-glutamine
Glutaraldehyde درجةSigma-AldrichG5882-50ML
خلية الصوديوم الهيبارينSigma-AldrichH3149-50KU
Human BDNFFisher Scientific (Gibco)11588836
Iscove (IMDM)BiochromFG0465
Laminin mouseFisher Scientific (Gibco)10267092
سيتراتالرصاص Sigma-Aldrich15326-25G
Luna FL عداد الخلايا الآليBiozym872040Biozym توقف. المنتج الذي تنتجه Logos Biosystems.
MACS BufferMiltenyi130-091-221
MEM NEAA 100xGibco11140035
MiniMACS Trenns & auml ؛ ulenMiltenyi130-042-201
كاميرا مورادا الرقميةأوليمبوس
مولتيبلات نونكلون 4 آبارفيشر 10507591
N2 الملحق 100xفيشر العلمي (جيبكو)11520536
نيوروقاعدال متوسطجيبكو10888022
PBS معقمروث 9143.2
بولي إل أورنيثينسيجما ألدريتشP4957-50ML
سوبر غرو-3 لوكتايتهنكل
TEM FEI Technai G2< / sup> سبيريتFEI أوروبا
Ultracut UC-6Leica
Uranyl acetate CEMS22400
غرفة العلمية

المراجع

  1. Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).
  2. Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
  6. Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
  7. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).
  8. Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
  9. Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
  10. Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105(2019).
  11. Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
  12. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدمتنشيط البروتين السكري المرتبط بـ GPIعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطيالطرد المركزي بتدرج الكثافةالاختيار السلبي لـ CD45وسط التمايز العصبيطلاء اللامينين والأورنيثينمجهر الفلورة المناعيةتحليل المجهر الإلكترونيالعلاج الخلوي غير المسبب للتشوهات المسخية
الجيل الخالي من المعدلة وراثيا من الخلايا العصبية المشتقة من الدم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.