مقالة منهجية

اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء

DOI:

10.3791/61648

⸱

سبتمبر 15, 2020

 ,  , 
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح تتبع أحداث الترجمة الفردية إجراء دراسات حركية عالية الدقة لآليات الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى. هنا نظهر في المختبر اختبار جزيء واحد على أساس التفاعلات التصوير بين الأجسام المضادة وصفت الفلورسنت والببتيدات الناشئة الموسومة epitope. تمكن هذه الطريقة من توصيف جزيء واحد للبدء وحركية استطالة الببتيد أثناء الترجمة النشطة في المختبر المعتمدة على الغطاء.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخليق البروتين المعتمد على الغطاء هو مسار الترجمة السائد في الخلايا النواة. وفي حين سمحت مختلف النهج الكيميائية الحيوية والجينية بإجراء دراسات مستفيضة للترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وتنظيمها، لا يزال هناك نقص في التوصيف الحركي عالي الدقة لمسار الترجمة هذا. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير اختبار في المختبر لقياس الحركية الترجمة المعتمدة على الغطاء مع قرار جزيء واحد. ويستند المقايسة على الأجسام المضادة المسمى fluorescently ملزمة لepiptide epitope الموسومة الوليدة. من خلال تصوير ربط وتفكك الأجسام المضادة من وإلى مجمعات الببتيد-ريبوسوم-ميرنا الوليدة، يمكن تتبع تطور الترجمة على الحمض النووي الريبي الفردي. هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء هذا المقايسة، بما في ذلك الاستعدادات الشريحة ميرنا وPEGylated، والتصوير في الوقت الحقيقي للترجمة، وتحليل مسارات جزيء واحد. يتيح هذا الفحص تتبع أحداث الترجمة الفردية المعتمدة على الحد الأقصى ويحل الحركية الرئيسية للترجمة، مثل معدلات البدء والإطالة. يمكن تطبيق المقايسة على نطاق واسع على أنظمة الترجمة المتميزة وينبغي أن تستفيد بشكل عام في الدراسات المختبرية حركية الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وآليات التحكم في الترجمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الترجمة في أنظمة eukaryotic يحدث في الغالب من خلال 7-ميثيلguanosine (م7G) مسارات تعتمد على الغطاء1. تشير الدراسات إلى أن الخطوة الأولى للترجمة eukaryotic هو الحد من معدل وهدف مشترك للائحة2،3،4. وقد درست آليات الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى على نطاق واسع باستخدامالوراثية 5، البيوكيميائية6،7،8،الهيكلية 9، والجينومية10 النهج السائبة. وعلى الرغم من أن هذه الأساليب قد حددت آليات متنوعة تنظم البدء المعتمد على الحد الأقصى، فإن حلها يقصرها على مجموعة متوسط الإشارات من أحداث البدء غير المتجانسة وغير المتزامنة. في الآونة الأخيرة ، تم تصور الفردية في أحداث الترجمة في الجسم الحي من خلال الأساليب التي تقيس الأجسام المضادة الفلورية ملزمة لepitopes على polypeptidesالوليدة 11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن هذه النهج الجديدة محدودة أيضا في قدرتها على حل أحداث البدء الفردية لأن الأجسام المضادة الفلورية المتعددة يجب أن تربط الببتيد الوليد للسماح بحل أحداث الترجمة الفردية من خلفية مفلورة عالية داخل الخلايا. في العديد من التفاعلات البيولوجية، قدمت الأحداث الحركية الفردية التي تم حلها رؤى حاسمة لفهم العمليات البيولوجية المعقدة متعددة الخطوات والمتكررة التي لا يمكن مزامنتها على المستوى الجزيئي. هناك حاجة إلى أساليب جديدة يمكنها تتبع ديناميكيات أحداث الترجمة الفردية من أجل فهم أفضل للبدء والتنظيم المعتمدين على الحد الأقصى.

قمنا مؤخرا بتطوير اختبار في المختبر يقيس الحركية بدء تعتمد على الغطاء مع قرار جزيء واحد15. وبالنظر إلى العدد الكبير من عوامل البروتين المعروفة وغير المعروفة المشاركة في مسار البدء هذا3،16، تم تطوير المقايسة أحادية الجزيء لتكون متوافقة مع أنظمة الترجمة الخالية من الخلايا المختبرية الحالية للاستفادة من الحفاظ على العوامل الخلوية ونشاط الترجمة القوي17و18و19و20و21و22و23و24و25. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام نظم الترجمة الخالية من الخلايا يتيح إجراء مقارنات أكثر توافقا بين الملاحظات أحادية الجزيء والنتائج السائبة السابقة. يوفر هذا النهج تكاملا مباشرا بين الرؤى الحركية الجديدة أحادية الجزيء في الإطار الآلي الحالي للبدء المعتمد على الغطاء. لإنشاء المقايسة أحادية الجزيء، يتم تعديل نظام الترجمة التقليدية الخالية من الخلايا بثلاث طرق: يتم إدخال تسلسل ترميز الظهارة في بداية إطار القراءة المفتوح (ORF) لمراسل مرنا. 3' نهاية مراسل مرنا هو البيوتينيلات لتسهيل مرنا نهاية الربط إلى سطح الكشف عن جزيء واحد; ويتم استكمال الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لمخرج الترجمة. تتطلب هذه التعديلات فقط تقنيات البيولوجيا الجزيئية الأساسية والكواشف المتاحة عادة. وعلاوة على ذلك، تحافظ هذه التعديلات وظروف التصوير أحادية الجزيء على الحركية التحريرية لتفاعلات الترجمة السائبة الخالية من الخلايا15.

في هذا المقايسة (الشكل 1), 5′-نهاية توج و 3′-end مراسل biotinylated مرنا هو شلت إلى سطح الكشف streptavidin المغلفة في غرفة تدفق. ثم تمتلئ غرفة التدفق بخليط ترجمة خال من الخلايا تكمله أجسام مضادة تحمل علامة fluorescently. بعد ترجمة مرنا قد حدث لحوالي 30-40 codons المصب من تسلسل epitope26،27، وepitope يخرج من نفق الخروج ريبوسوم ويصبح من السهل الوصول إليها للتفاعل مع الأجسام المضادة المسمى fluorescently. هذا التفاعل سريع والكشف عنه عن طريق تقنيات التصوير الفلوري أحادي الجزيء يتيح تتبع حركية الترجمة بدقة جزيء واحد أثناء الترجمة النشطة الخالية من الخلايا. وينبغي أن يفيد هذا المقايسة على نطاق واسع في الدراسات المختبرية حركية الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى وتنظيمها، ولا سيما بالنسبة للأنظمة التي تعمل بكميات كبيرة في الفحص المختبري.

شرط أساسي لإنشاء هذا المقايسة جزيء واحد هو العمل السائبة الخلية خالية من ترجمة المقايسة، والتي يمكن تحقيقها باستخدام استخراج الترجمة التي هي إما متاحة تجاريا أو أعدت باتباع الأساليب الموصوفة سابقا28. يمكن الحصول على استخراج الترجمة Eukaryotic من خلايا متنوعة، بما في ذلك الفطرية والثدييات والنبات28. للتصوير، يتطلب هذا الفحص مجهر TIRF مجهز بكثافة الليزر غير القادرة وزاوية الحادث، ومرحلة عينة مزودة بمحرك، ونظام سوائل آلي، وجهاز التحكم في درجة الحرارة العينة. هذه المتطلبات هي عامة للتجارب الحديثة في المختبر TIRF جزيء واحد ويمكن تحقيقها بشكل مختلف. تستخدم التجربة المعروضة هنا نظام TIRF من النوع الموضوعي يتكون من المجهر والبرامج والملحقات المتاحة تجاريا والمدرجة جميعها في جدول المواد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جيل مراسل مرنا

  1. تعديل قالب نسخ الحمض النووي الذي يشفر "untagged" مراسل mRNA السائبة عن طريق إدراج تسلسل ترميز العلامة N-terminus لإنشاء قالب نسخ الحمض النووي لمراسل "الموسومة" مرنا (الشكل 2A).
    ملاحظة: يوصى بتفاعل 3xFLAG/anti-FLAG لهذا المقايسة نظرا لحساسية الفائقة وطول العلامة 3xFLAG القصير. ومع ذلك ، فإن المقايسة متوافقة مع أزواج epitope / الأجسام المضادة الأخرى.
  2. توليف RNAs غير الموسومة والموسومة باستخدام قوالب الحمض النووي الخطية ومجموعة النسخ في المختبر (انظر جدول المواد). عادة، 10-20 pmol من الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر كافية لمعالجة الحمض النووي الريبي اللاحقة للسماح لدراسة منهجية جزيء واحد.
  3. كاب RNA 5′ نهاية (الشكل 2B) مع M7G توج عدة (انظر جدول المواد) بعد توصية الشركة المصنعة.
  4. Biotinylate RNA 3' نهاية (الشكل 2B) باستخدام مجموعة البيوتينيليشن (انظر جدول المواد)وفقا للبروتوكول المقدمة مع عدة. تنقية RNAs بواسطة استخراج الفينول الكلوروفورم تليها تنقية مع عمود تدور. إلوت الجيش الملكي النيبالي في 10-20 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase. يتم استرداد ما يقرب من 40-50٪ من الحمض النووي الريبي المدخلات غير المغطاة.
  5. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي والتركيز عن طريق إزالة الكهروفلوريس هلام الأكريلاميد وتلطيخ الحمض النووي الريبي، كما هو موضح سابقا29.
  6. تنفيذ ترجمة بالجملة خالية من الخلايا30 مع 3′نهاية البيوتينية الموسومة مراسل مرنا لتأكيد أن مرنا المعدلة يحافظ على خصائص الترجمة التي هي ذات أهمية. وكمثال على ذلك، يمكن تأكيد الترجمة المعتمدة على الحد الأقصى من خلال قياس ومقارنة أنشطة المراسلين في ردود الفعل بالجملة للترجمة الخالية من الخلايا مع mRNAs المراسل غير المقيد والم توج (انظر النتائج التمثيلية).

2. تدفق غرفة إعداد

  1. حدد سمك غطاء مناسب، كما هو محدد في ورقة المواصفات الموضوعية للمجهر. حدد شريحة زجاجية أو كوارتز لأنظمة التصوير ذات الإضاءة الداخلية الكلية (TIRF) من النوع الموضوعي أو المنشوري31على التوالي.
  2. قم بالتنظيف والتملح وال PEGylation وتجميع غرفة الأغطية والشرائح وفقا للبروتوكول الذي وصفه Chandradoss et al.32 مع التعديلات التالية.
    1. اغسل الشرائح التي تحتوي على ثقوب محفورة في المنظفات السائلة القلوية بنسبة 10٪ (v/v) لمدة 20 دقيقة مع سونيكيشن. اجمع الشرائح والأغطية لجميع خطوات التنظيف المتبقية.
    2. تخطي خطوة غسل الأسيتون. تمديد فترة حضانة البيرانا من 20 دقيقة إلى ساعة واحدة. احتضان PEGylation الجولة الأولى لمدة 3 ساعة. احتضان PEGylation الجولة الثانية مع MS (PEG)4 لمدة 3 ساعة.

3. إعداد المعدات

  1. على الأقل 3 ساعة قبل إجراء تجربة جزيء واحد، قم بتشغيل حاضنة المجهر وتقليل تدفق الهواء إلى معدل منخفض لتجنب الاضطرابات الصوتية المفرطة للتجارب. قم بتعيين درجة حرارة الحاضنة إلى درجة الحرارة المثلى لنظام الترجمة الخالي من الخلايا.
    ملاحظة: الترجمة حساسة للغاية لدرجة الحرارة. درجة حرارة رد الفعل الأمثل محددة لكل نظام استخراج الخلية. يعد توصيف درجة حرارة التفاعل خطوة حيوية في تطوير نظام ترجمة بالجملة خال من الخلايا. وينبغي إجراء هذا المقايسة جزيء واحد تحت نفس درجة الحرارة المثلى كشرط الترجمة السائبة المقابلة.
  2. 1 ساعة على الأقل قبل إجراء تجربة جزيء واحد تشغيل الليزر عن طريق الضغط على زر طاقة الليزر وراء مربع الليزر، وتحويل مفتاح السلامة الليزر، واضغط على زر البدء. قم بتشغيل المجهر واضغط على لوحة التحكم بشاشة اللمس لتحديد وضع التصوير، والهدف، ومجموعة الفلتر.
  3. قم بتشغيل كاميرا EMCCD ووحدة تحكم المرحلة السابقة ومضخة الحقنة عن طريق الضغط على أزرار الطاقة الخاصة بهم. بدوره على الكمبيوتر والبرمجيات المفتوحة أندور سوليس (البرمجيات 1) للسيطرة على كاميرا EMCCD، TirfCtrl (البرمجيات 2) للسيطرة على الليزر، PriorTest (البرنامج 3) للسيطرة على المرحلة الآلية، وكولترم للسيطرة على مضخة حقنة. السماح للكاميرا بالتبريد والاستقرار في درجة حرارة العمل المعينة قبل بدء اكتساب البيانات.
  4. في البرنامج 2، تأكد من أن المعلمات الصحيحة يتم تعيينها للطول الموجي بالليزر، ونوع الهدف، ومؤشر الانكسار للزجاج والعينة. انقر فوق الزر الاتصال. لضبط كثافة الليزر، انقر فوق زر التحكم بجوار الطول الموجي بالليزر، ثم اسحب شريط الشرائح الكثافة في إطار التحكم بالليزر. تعيين الليزر إلى الزاوية المطلوبة عن طريق سحب شريط الشريحة موقف الألياف أو إدخال عمق الاختراق المقابلة. تأكد من تحديد مربع الغالق للحفاظ على الليزر في وضع إيقاف التشغيل عند عدم التصوير.
    ملاحظة: افتح مصراع الليزر وأغلقه عن طريق التحقق من مربع الغالق. عند إنشاء المقايسة في البداية ، يجب اختبار كثافة الليزر المختلفة وزوايا الحوادث للكشف الأمثل عن جزيء واحد. توازن كثافة الليزر المثلى بين الفلورسينس الساطع أحادي الجزيء والbleaching الضوئية السريعة للفلوروفوريس. وينبغي زيادة زاوية الحادث إلى ما وراء الزاوية الحرجة للحد من الخلفية الفلورية العالية من الأجسام المضادة المسماة الانتشار حتى يتم حل الأجسام المضادة المرتبطة بالمرنا بوضوح. كمرجع، تم تعيين ليزر 532 نانومتر إلى 10 ميكروواط عند الهدف مع تعيين زاوية حادث الليزر إلى 71.5 درجة في دراسة15 باستخدام Cy3 المسمى المضادة FLAG مع نسبة وضع العلامات من 2-7 الأصباغ لكل الأجسام المضادة.
  5. في البرنامج 1 ، اختر الحركية تحت وضع الاستحواذ، وإدخال المعلمات لوقت التعرض ، وطول سلسلة الحركية ، وEM كسب القيمة. اختيار الدليل وتعيين أسماء الملفات لحفظ ملف صورة البيانات.
  6. تعيين مضخة حقنة إلى معدل تدفق متواضعة وسريعة لخطوة غسل الأنابيب اللاحقة.
    Pipette a aliquot من الإيثانول 70٪ في أنبوب microfuge، إدراج أنبوب مضخة حقنة نهاية في محلول الإيثانول، واستخدام Coolterm لتبديل مضخة حقنة بين سحب وصرف وسائط ثلاث مرات لغسل الأنابيب. كرر استخدام المياه الخالية من RNase.
    ملاحظة: يجب أن يكون طول الأنابيب طويلا بما يكفي للسماح بالاستغناء عن مزيج الترجمة في الخطوة 5 للاتصال فقط بالأنابيب ، وليس المحقنة. يجب أن يكون حجم الشطف هنا أكبر من حجم مزيج الترجمة الموزع لضمان بقاء مزيج الترجمة في الخطوة 5 على اتصال بالأنابيب المطهرة.
  7. بعد أن يتم الاستغناء عن شطف الماء النهائي ، قم بإزالة المياه المتبقية من داخل الأنابيب عن طريق غمس نهاية الأنبوب على مسح الأنسجة النظيفة. الحفاظ على نهاية الأنابيب الجافة عن طريق وضعه في أنبوب microfuge نظيفة.

4. تعطيل 3′-نهاية البيوتينلاتED مرنا

  1. الحفاظ على استخراج الخلية ومزيج الترجمة المجمدة على الجليد الجاف حتى قبل استخدامها مباشرة. إذابة الكواشف المجمدة المتبقية والحفاظ عليها على الجليد.
  2. ضع غرفة التدفق في حامل عينة المجهر مع الجانب coverslip التي تواجه لأسفل وتأمينه في مكانه مع الشريط. استخدم الشريط لتغطية مداخل ومنافذ قنوات التدفق غير المستخدمة.
  3. ماصة حجم 1.5x (نسبة إلى حجم القناة; ينطبق أيضا على خطوات أخرى في الخطوة 4 والخطوة 5) من 0.2 ملغ / مل streptavidin في قناة تدفق واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. لإزالة streptavidin غير المنضمة، اغسل القناة ثلاث مرات عن طريق الأنابيب في حجم 3x من المخزن المؤقت لغسل T50 (20 mM Tris HCl، درجة الحموضة 7.0، 50 mM NaCl، 0.2 U/μL RNase كاشف تثبيط) لكل غسل.
    ملاحظة: من المهم منع تدفق النفايات السائلة مرة أخرى إلى القناة. إذا لم يكن منفذ قناة التدفق متصلا بأنبوب لجمع النفايات، ضع ورقة نسيج مطوية بالقرب من المنفذ لامتصاص السائل الذي يتدفق من القناة.
  5. نقل استخراج الترجمة ومزيج من الجليد الجاف إلى الجليد والسماح لهم ذوبان الجليد.
  6. وضع قطرة من زيت الغمر على الهدف. ضع حامل عينة المجهر مع غرفة التدفق في مرحلة المجهر. جعل الهدف على مقربة من coverlip حتى الغمر النفط على الاتصالات الهدف coverslip. حرك مرحلة العينة بحيث يكون موضع قناة التدفق فوق العدسة الهدف مباشرة.
  7. في البرنامج 2، افتح مصراع الليزر وضبط مستوى كثافة الليزر.
  8. على شاشة اللمس للتحكم بالمجهر، حدد علامة التبويب التركيز وانقر فوق الزر بحث التركيز والبدء. يتم سماع صوت تنبيه عندما يتم تحقيق طائرة التركيز بنجاح.
  9. صورة سطح قناة التدفق في الوضع المباشر في البرنامج 1. تحسين التركيز لصورة أكثر وضوحا عن طريق ضبط الموقف الهدف مع عنصر تحكم خطوة غرامة على الشاشة التي تعمل باللمس.
  10. في البرنامج 3، قم بتحريك المرحلة لتقييم مستوى الخلفية الفلورية في مناطق مختلفة من سطح الكشف عن قناة التدفق. إذا كان الفلورسينس منخفضا، فاستمر في التجربة. إذا كانت الخلفية الفلورية مرتفعة بشكل مفرط ، ففكر في التخلص من قناة التدفق.
  11. في البرنامج 2، أغلق مصراع الليزر.
  12. ماصة خارج المخزن المؤقت غسل T50 من قناة تدفق وماصة على الفور في حجم 2x من محلول مرنا البيوتينيلات إلى قناة التدفق. حضانة لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: لكل دفعة من إعداد مرنا، ينبغي اختبار تركيزات مرنا وأوقات الحضانة لتحقيق كثافة سطح مرنا اللازمة للكشف عن جزيء واحد. تتوسط كثافة سطح مرنا المناسبة ربط الأجسام المضادة التي تظهر بقع الفلورسنت مع ما لا يزيد عن ~ 5٪ متداخلة (انظر النتائج التمثيلية). كنقطة انطلاق، ينصح ميرنا البيوتينية في تركيز 2-20 nM.
  13. اغسل القناة ثلاث مرات عن طريق توجيه وحدة تخزين مؤقتة متوافقة مع الترجمة بمقدار 3 أضعاف لكل مغسلة.

5. تجميع مزيج الترجمة وتسليمها إلى قناة تدفق للكشف عن جزيء واحد

  1. على الجليد، تجميع 3x مجلدات من مزيج الترجمة30 في أنبوب الطرد المركزي الدقيق بعد بروتوكول الترجمة السائبة من الخطوة 1.7، باستثناء حذف مرنا وتكملة مع تركيز الأمثل من الأجسام المضادة وصفت الفلورسنت. تدور لفترة وجيزة أنبوب الطرد الدقيق لجمع مزيج الترجمة في الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة: عند تحديد المقايسة، يتم اختبار تركيزات الأجسام المضادة المختلفة. يظهر التركيز الأمثل كميات منخفضة من الأجسام المضادة غير المحددة الملزمة لسطح الكشف والأجسام المضادة السريعة الملزمة للببتيد الوليد (انظر الخطوتين 7.1. و 7.2.، على التوالي، للحصول على تفاصيل معايرة المقايسة).
  2. نقل مزيج الترجمة إلى الداخل من غطاء أنبوب microfuge 0.7 مل. تعيين مضخة حقنة إلى وضع الانسحاب. أدخل نهاية أنابيب المضخة في مزيج الترجمة. بدء سحب حقنة لجمع مزيج الترجمة في أنابيب مضخة. عكس إعداد مضخة حقنة لوضع الاستغناء وتعيين تدفق إلى معدل الأمثل لتسليم مزيج الترجمة.
    ملاحظة: تجنب توليد فقاعات في مزيج الترجمة عند نقله إلى أنابيب المضخة. تجنب سحب مزيج الترجمة عميقا جدا في جزء من الأنابيب التي لم يتم تطهيرها وشطفها في الخطوة 3.6. عند تحديد المقايسة، يتم اختبار معدلات تدفق تسليم مختلفة لتحديد المعدل الأمثل (انظر الخطوة 6.2. للحصول على تفاصيل حول معايرة المقايسة).
  3. إذا كان هناك فجوة بين نهاية الأنابيب وخليط الترجمة، بدء مضخة حقنة والسماح للخليط الترجمة للوصول إلى نهاية الأنابيب، ثم وقف مضخة حقنة.
  4. أدخل نهاية أنابيب المضخة في مدخل قناة التدفق. تجنب إدخال فقاعات الهواء في مزيج الترجمة عند إجراء الاتصال. استقرار الاتصال عن طريق الشد قوس معدني حسب الطلب على لوحة حامل عينة المجهر. تقييم تركيز المجهر وفلورسينس منطقة التصوير.
    ملاحظة: يمكن أن تكون فرضت أنابيب إلى غرفة التدفق مع جزء مخصص كما هو موضح سابقا33. ويمكن أيضا أن تستخدم أنواع أخرى من أنظمة fluidics لهذا المقايسة34. يجب أن يظهر مجال الرؤية مشابها قبل وبعد توصيل الأنابيب. إذا ظهرت المزيد من البقع الفلورية بعد الاتصال، فمن المرجح أن يتسرب مزيج الترجمة من أنابيب التسليم. اعتمادا على التطبيق، قد تحتاج القناة التي بها مزيج ترجمة مسرب إلى التخلص منها.
  5. تأكد من صحة معلمات الحصول على الفيلم وأنه تم إدخال اسم الملف المناسب والدليل لحفظ الملفات.
  6. حرك المرحلة لتصوير منطقة في وسط سطح الكشف عن قناة التدفق. على شاشة اللمس للتحكم بالمجهر، حدد علامة التبويب "التركيز البؤري البؤري المستمر" وانقر على زر البحث البؤري والبدء للحفاظ على الموضع البؤري أثناء التجربة. يتم سماع صوت تنبيه عندما يتم تحقيق طائرة التركيز بنجاح.
  7. في البرنامج 2، افتح مصراع الليزر. في البرنامج 1، انقر فوق الزر "أخذ إشارة" لبدء التسجيل. بعد ما يقرب من 5 ق من تسجيل، أدخل الأمر تشغيل في Coolterm لتقديم مزيج الترجمة في قناة تدفق. سجل لمدة تصل إلى 2 ساعة مع دقة زمنية من 0.5-2 ثانية / إطار.
    ملاحظة: يعتمد الحد الأقصى لمدى الحصول على البيانات على مدى سرعة فقدان استخراج الترجمة للنشاط بمرور الوقت ، والتي يمكن أن تتميز بشكل ملائم بإجراء ترجمة بالجملة خالية من الخلايا مع مراسل luciferase mRNA وقياس نشاط لوسيفيراز في ردود فعل الترجمة في نقاط زمنية مختلفة35.
  8. عند اكتمال عملية الحصول على البيانات، قم بإيقاف تشغيل الليزر وإيقاف تشغيل شاشة التحكم المستمر AF على شاشة اللمس للتحكم بالمجهر، ثم قم بتفكيك الأنابيب من غرفة التدفق.
  9. ماصة من خليط الترجمة من مدخل قناة تدفق، ونقله إلى أنبوب microfuge، والمفاجئة تجميد الحل عن طريق وضع أنبوب في النيتروجين السائل. مخزن في وقت لاحق في -80 درجة مئوية.
  10. غسل أنابيب مضخة حقنة ثلاث مرات مع المياه الخالية من RNase، ثم ثلاث مرات مع الإيثانول 70٪. سحب الإيثانول 70٪ في أنابيب مضخة حقنة للتخزين.
  11. قم بإيقاف تشغيل المجهر وجميع الملحقات. تنظيف.

6. تحليل البيانات

ملاحظة: تحليل البيانات لهذا المقايسة يتطلب أساليب شائعة في الدراسات الفيزيائية الحيوية جزيء واحد. يمكن تحقيق جميع الخطوات المكثفة حسابيا باستخدام الخوارزميات والبرامج الموجودة (يتم تضمين المراجع أدناه في خطواتها المقابلة).

  1. اختياري: إذا كان ذلك ممكنا، قم بتحويل ملف سلسلة الصور المكتسبة إلى تنسيق متوافق مع برنامج معالجة الصور المختار أو لغة البرمجة.
  2. تحديد نقطة بداية رد فعل الترجمة ووقت تبادل الكاشف.
    ملاحظة: نظرا للأجسام المضادة الفلورية المنتشرة في مزيج الترجمة، ستزداد كثافة الإضاءة الخلفية لمنطقة مصورة أثناء تبادل الكاشف داخل القناة من المخزن المؤقت المتوافق مع الترجمة إلى مزيج الترجمة. يتم تعيين نقطة بداية رد فعل الترجمة كنقطة زمنية عند اكتمال تبادل الكاشف. تم العثور على نقطة الإكمال هذه من خلال قياس كثافة مضان الخلفية أثناء تسليم مزيج الترجمة وتحديد النقطة الزمنية عندما هضاب كثافة الفلورية المتزايدة15، كما هو موضح أدناه.
    1. احسب إجمالي عدد الفلورسينس لكل إطار صورة ورسم ملف تعريف الوقت المقابل. تحديد الزيادة المفاجئة في الفلورسينس الكلي في مؤامرة الملف الشخصي الوقت.
      ملاحظة: تعزى الزيادة الإجمالية في الإضاءة الفلورية إلى التركيز المتزايد للأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت أثناء تبادل الكاشفات.
    2. حدد نقطة النهاية لمرحلة زيادة الفلورسينس الإجمالية وحدد هذه النقطة الزمنية كنقطة بداية (أي الوقت 0) لرد فعل الترجمة. تحديد كل من نقطة البداية والنهاية لمرحلة زيادة الفلورسينس الكلي وتعيين الفرق الزمني ككاشف وقت الصرف.
      ملاحظة: يعتمد إجمالي الفترة الزمنية للكواشف على أبعاد قناة التدفق ومعدل التدفق المحدد. فمن الممكن أن بعض عوامل الترجمة يمكن أن تبدأ ملزمة لرنا قبل اكتمال تبادل كاشف، والتي يمكن أن تقلل من قرار تحديد وقت بدء الجولة الأولى. لذلك يوصى باختبار معدلات تدفق مختلفة عند إعداد المقايسة وتحديد معدلات التدفق التي تسمح بإكمال الصرف الكاشف في غضون 3-4 ثانية لسرعات اكتساب البيانات من 0.5-2 ثانية / إطار.
  3. اختياري: تنفيذ تصحيح الانجراف الفيلم.
    ملاحظة: قد تتغير مواقع الأجسام المضادة المقيدة في صورة البيانات بمرور الوقت بسبب انجراف أجزاء المجهر والملحقات. الانجراف الذي هو ملحوظ بصريا في فيلم يتطلب تصحيح قبل المضي قدما في تحليل البيانات. تتوفر عدة خوارزميات التصحيح الانجراف المكاني والنصوص36،37،38.
    1. في كل صورة، ابحث عن الحد الأقصى المحلي في عدد البكسل لتحديد مواقع الأجسام المضادة المنضمة في كل إطار بدقة على مستوى البكسل. تعيين عتبة لعدد البكسل بحيث يتم تحديد المواقع التي تكون بوضوح فوق ضجيج الخلفية.
    2. احسب التغييرات في أوضاع الأجسام المضادة الفردية في كل اتجاه بين إطارين متتاليين للصور.
    3. رسم الرسم البياني للتغيرات الموضعية للأجسام المضادة بين إطارين متتاليين والقيام بذلك بشكل منفصل لكل اتجاه. الغاوسية تناسب كل رسم بياني وتعيين موقف مركز القمم والانجراف الاتجاهي بين إطارين متتاليين.
    4. لمواجهة الانجراف الملاحظ، حول كل إطار صورة في الاتجاه المعاكس بمقدار الانجراف المحسوب.
  4. بناء مسارات جزيء واحد.
    ملاحظة: الكشف / تتبع البرمجيات متاحة لتحديد النقاط المضيئة واستخراج كثافتها من سلسلة صورة البيانات39،40.
    1. تحديد مواقع الأجسام المضادة كما هو موضح في الخطوة 6.3.1.
      ملاحظة: يوصى بالتفتيش البصري للتأكد من أن العتبة المختارة لا تؤدي إلى الإفراط في قطف الجسيمات أو نقصها. يمكن تحقيق الفحص البصري من خلال تراكب مواقع المائد المحددة فوق كل إطار صورة وتقييم اتفاقها بصريا (انظر النتائج التمثيلية).
    2. الجمع بين الجسيمات التي تم انتقاؤها من جميع الإطارات وإزالة مواقف الجسيمات زائدة عن الحاجة.
    3. فحص بصريا صور الأجسام المضادة ملزمة وحدد منطقة مربعة مرفقة بكسل مع التهم التي هي بوضوح فوق الخلفية وممثل للأجسام المضادة ملزمة بشكل فردي.
      ملاحظة: يتم تحديد وظيفة انتشار النقطة (أي حجم المربع لجزيء واحد) من خلال الإعداد البصري وحجم بكسل الكاشف.
    4. لكل موضع جسيم، قم ببناء مسار جزيء واحد عن طريق حساب الكثافة الإجمالية لجميع وحدات البكسل في المنطقة المربعة حول موضع الجسيمات. يتم إنشاء مسارات لكل موقف، الإطار حسب الإطار، وبالنسبة للفيلم البيانات بأكملها.
  5. اختياري: تطبيق مرشح غير خطي إلى الأمام إلى الخلف41 للحد من الضوضاء الخلفية في مسارات جزيء واحد.
  6. اختياري: رقمنة المسارات مع خوارزميات الكشف عن الخطوة الموجودة42،43،44،45.
    ملاحظة: يعتمد اختيار خوارزمية الكشف خطوة على تعقيد ديناميات جزيء واحد. بالنسبة لأبسط سيناريو للترجمة الريبوسومية المعزولة فقط (أي عدم وجود تشكيل متعدد الأضلاع) ونسبة الإشارة الجيدة إلى الضوضاء ، فإن تطبيق العتبة على عدد الفلورسينس يكفي لتحديد توقيت أحداث ربط الأجسام المضادة وتفككها في مسارات جزيء واحد. يوصى بإجراء فحص مرئي لما لا يقل عن 100 مسار لكل حالة لضمان اختيار خطوات المسار بشكل مناسب من خلال استراتيجية الكشف عن الخطوات.
  7. تحديد وقت أول حدث ملزم للأجسام المضادة لكل مسار (أي وقت الوصول الأول، t1)،إما باستخدام مسارات رقمية أو تطبيق عتبة على المسارات غير الرقمية.
    ملاحظة: يمكن مقارنة القيمة الوسيطة لتوزيع وقت الوصول الأول بين شروط الترجمة المختلفة. بدلا من ذلك، يمكن تركيب توزيع وقت الوصول الأول إلى وظيفة سجل طبيعي متغيرة (3 معلمات) لتحديد متوسط القيمة15 <t1>. نظرا لأن توزيع وقت الوصول الأول عادة ما يكون منحرفا وذيله طويلا ، فلا تحسب المتوسط عن طريق المتوسط المباشر خلال أوقات الوصول الأولى الملاحظة.
  8. اختياري: يسكن تحليل الوقت وحساب متوسط معدل تخليق الببتيد.
    1. استخدم المسارات الرقمية لتحديد أحداث الترجمة أحادية (الريبوسوم الواحد) في كل مسار وحساب أوقات سكن الحدث الملزم الوحيد كفرق زمني بين أحداث ربط الأجسام المضادة المقابلة وأحداث الانفصال.
      ملاحظة: تكون خوارزميات الكشف عن الخطوات لرقمنة المسارات أقل موثوقية بشكل عام عندما تتداخل أحداث جزيئية متعددة في الوقت المناسب. ولذلك يوصى باستبعاد الأحداث المتعددة من تحليل الوقت المستفيض. بالنسبة لأنظمة الترجمة النشطة للغاية التي يتم إثراءها بالأحداث المتعددة ونادرا ما تعرض أحداثا أحادية ، يمكن استخدام مزيج من الأجسام المضادة المسماة وغير المسماة لزيادة فرصة مراقبة أحداث الترجمة المعزولة في مسارات جزيء واحد.
    2. تناسب التوزيع إلى وظيفة السجل الطبيعي واستخدام الدالة المجهزة لحساب متوسط وقت الإقامة.
      ملاحظة: لا ينصح بحساب المتوسط مباشرة عن طريق متوسط أوقات الإسهاب الملاحظة لأن توزيعات وقت الإسهاب عادة ما تكون منحرفة مع ذيول طويلة.
    3. تحديد عدد الأحماض الأمينية التي تترجم خلال وقت الربط الأجسام المضادة يسكن عن طريق طرح مجموع طول الأحماض الأمينية epitope و 35 (متوسط طول الأحماض الأمينية من الببتيد الوليدة داخل نفق الخروج ريبوسوم) من العدد الإجمالي لل codons ORF.
    4. لتحديد متوسط معدل تخليق الببتيد، قم بتقسيم عدد الأحماض الأمينية المترجمة على متوسط وقت الإقامة.
  9. اختياري: حساب متوسط وقت بدء الجولة الأولى (<t1_I>).
    ملاحظة: شروط البدء والإطالة، مثل سياق تسلسل موقع البدء وتسلسل الترميز، يتم الحفاظ عليها بشكل عام عن عمد لدراسات الحركية الاستهلالية. لذلك، متوسط وقت الوصول الأول <t1> من الخطوة 6.7. يمكن استخدامها مباشرة لحساب التغيير في حركية بدء الجولة الأولى بين ظروف مختلفة. التصحيح التالي ضروري فقط لتحديد القيمة الفعلية لوقت البدء في الجولة الأولى.
    1. تقسيم مجموع طول epitope و 35 (متوسط طول الأحماض الأمينية من الببتيد الوليدة داخل نفق الخروج ريبوسوم) على متوسط معدل توليف الببتيد (من الخطوة 6.8.4.) لحساب متوسط وقت استطالة الببتيد من هذه المنطقة N-المحطة الطرفية (<ر1_tag>).
    2. بما أن وقت الوصول الأول هو مجموع وقت بدء الجولة الأولى و t1_tag، طرح <t1_tag> من متوسط وقت الوصول الأول <t1> لحساب متوسط وقت بدء الجولة الأولى <t1_I>: <t1_I> = <t1> - <t1_tag>

7. معايرة المقايسة

ملاحظة: تنفيذ خطوات المعايرة التالية عند تأسيس المقايسة في البداية.

  1. لفحص خصوصية ربط الأجسام المضادة، قم بتنفيذ خطوات البروتوكول في القسمين 4 و5 بشكل منفصل ل mRNAs غير الموسومة والموسومة (الشكل 2). تمثل مستويات ربط الأجسام المضادة في القنوات مع هذه الرنانات المعنية مدى ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة بسطح الكشف والأجسام المضادة المحددة الملزمة للببتيد الوليد.
    ملاحظة: يوصى بأن تكون نسبة الربط المحددة إلى غير المحددة >10 ويمكن زيادتها مع استراتيجيات مختلفة لتخميل السطح أو تركيز أقل للأجسام المضادة أو كثافة سطح مرنا أعلى.
  2. لقياس معدل ربط الأجسام المضادة، نفذ البروتوكول بخطوة إضافية بين الخطوة 4 والخطوة 5.
    1. بعد الخطوة 4، احتضان القناة مع خليط الترجمة التي تفتقر إلى الأجسام المضادة لتوليد ما قبل مرنا / ريبوسوم / مجمعات الببتيد.
    2. ثم انتقل إلى الخطوة 5 وتدفق خليط الترجمة المكمل للأجسام المضادة إلى القناة.
    3. قياس متوسط معدل ربط الأجسام المضادة للببتيد الوليدة التي تم إنشاؤها مسبقا مع تركيب الأسي لأول مرة وصول الرسم البياني.
      ملاحظة: يجب أن يكون ربط الأجسام المضادة بالببتيد الذي تم إنشاؤه مسبقا سريعا ، حسب ترتيب الثواني ، ويجب أن يكون أسرع من حركية الترجمة. يمكن استخدام تركيز أعلى للأجسام المضادة لزيادة معدل ربط الأجسام المضادة.
  3. قابلية التصوير الضوئي للأجسام المضادة المسماة بالفلوروفور.
    1. إعداد شريحة وفقا للبروتوكول في الخطوة 2 ولكن تخطي خطوة PEGylation. تجميع غرفة التدفق بعد خطوة الملوحة. طلاء السيلان يسمح كفاءة الأجسام المضادة غير محدد ملزمة لسطح الكشف.
    2. أضف الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية إلى القناة لتحقيق كثافة جزيء واحد من الأجسام المضادة غير المحددة الملزمة لسطح الكشف. ابدأ بإضافة الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية المخففة للغاية في مخزن غسيل T50 وزيادة تركيز الأجسام المضادة تدريجيا حتى يتم تحقيق كثافة جزيء واحد المطلوبة.
    3. صورة سطح الكشف حتى معظم مضان الأجسام المضادة لم يعد يمكن الكشف عنها.
    4. رسم العدد الإجمالي للأجسام المضادة المرئية مع مرور الوقت لتقييم معدل فقدان مضان الأجسام المضادة بسبب التوهج الضوئي.
      ملاحظة: عادة ما ينتج عن وضع العلامات على الأجسام المضادة فلوروفوريس متعددة لكل الأجسام المضادة. تبقى الأجسام المضادة الفردية قابلة للكشف حتى جميع الفلوروفوريس المترافق photobleach.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد البروتوكول الموصوف يتيح التصوير من التفاعلات الأجسام المضادة الفردية مع الوليدة N-الطرفية الموسومة polypeptides مع قرار جزيء واحد خلال ترجمة نشطة خالية من الخلايا من 3 'نهاية المربوطة مراسل مرنا (الشكل 1). يتم الإبلاغ عن تجربة مظاهرة الحد الأدنى مع استخدام ثلاثة mRNAs الاصطناعية: LUC (ترميز لوسيفيراز غير الموسومة), LUCFLAG (ترميز 3xFLAG الموسومة لوسيفراز), وHP-LUCFLAG (LUCFLAG مع مستق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالمقارنة مع التجارب النموذجية في المختبر TIRF جزيء واحد، والتصوير جزيء واحد مع المقايسة الموصوفة هنا معقدة بالإضافة إلى ذلك بسبب استخدام استخراج الخلية وتركيز عال من الأجسام المضادة المسمى فلوريا. بالمقارنة مع الممارسة الأكثر شيوعا لجولة واحدة من PEGylation السطح، جولة ثانية من PEGylation (الخطوة 2) يقلل إلى حد كبير ملزمة الأجسام المضادة غير محددة للكشف عن السطح15. التركيز العالي لنشر الأجسام المضادة الفلورية يسبب خلفية فلورية عالية للغاية تخفي الكشف عن جزيء واحد من ربط الأجسام المضادة. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة [R01GM121847]؛ مركز سلون كيترينج التذكاري للسرطان (MSKCC) منحة الدعم / المنحة الأساسية (P30 CA008748); ومبادرة MSKCC لعلم الجينوم الوظيفي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هدف الزيت 100X ، NA 1.49OlympusUAPON 100XOTIRF
Acryamide / bis (40٪ ، 19: 1)Bio-Rad161-0144
منظف سائل قلويDecon5332
Aminosilane (N- (2-Aminoethyl) -3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCTSpecialties، LLCA0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCDAndorDU-897U-CSO-#BV
Andor Solis برنامجAndorللتحكم في مرشح Andor EMCCD
Band-passChroma532/640/25
مرشح تمرير النطاقChromaNF03-405 / 488/532 / 635E-25
Biotin-PEG-SVALaysan Bio IncBiotin-PEG-SVA
أنزيم حمض خالمن البرولوم309-250
برنامجللتحكم في مضخة الحقنة
كمبيوتر مكتبيDellللتحكم في المجهر والكاميرا والمسرح والمضخة.
مرآة ثنائية اللونSemrockR405 / 488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNXFisher ScientificNC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
EpoxyDevcon14250
Firefly luciferin D-Luciferin Free acidProlume306-250
حمض الخليك الجليديBP1185500
الهيدروجين بيروكسيدسيجما ألدريتش216763-500 مل
زيت الغمرأوليمبوسZ-81226Aمنخفض التألق التلقائي
PromegaE1500
MEGASCRIPT T7 طقم النسخثيرمو فيشرAM1334
ميثانولفيشر مجهر MMX04751
أوليمبوسIX83
شريحة مجهرحراري علمي3048
أحادي النسيلة مضاد ل FLAG M2-Cy3سيجما-ألدريتشA9594
mPEG-SVALaysan Bio IncmPEG-SVA-5000
MS (PEG) 4Thermo Scientific22341
كلوريد الصوديوم (5 أم)AM9760Gحراري علمي
رقم 1.5 مجهر غطاء زجاجيFisherband12-544-C
Olympus Laser ، 532nm 100mMOlympus Digital LaserSystem CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl softwareOlympusللتحكم في شدة الليزر وزاوية الحادث
الجدول البصريTMC التحكم في الاهتزاز63-563مع عزل الاهتزاز
مزيج الكحول الفينول كلوروفورم الأيزواميلسيجما ألدريتش77617-100 مل
بيرس RNA 3 'مجموعة البيوتينيل النهائيThermo Scientific20160
كريات هيدروكسيد البوتاسيومSigma-AldrichP1767-500G
مرحلة الترجمة الآلية السابقة XYالسابقةPS3J100
السابقة برنامج PriorTestالسابقللتحكم في المرحلة الآلية السابقة
المؤتلف RNasin RNase مثبطPromegaN2515
المرحلة العلوية حاضنةفي الجسم الحي العلمي (أدوات الدقة العالمية)98710-1مع قفص أكريليك مصمم خصيصا
جرة تلطيخفيشر Scientific08-817
StreptavidinThermo Scientific43-4301
حامض الكبريتيكفيشر ScientificA300212
SYBR الأخضر IIفيشر ScientificS7564
حقنةهاميلتون1725RN
مضخة حقنةهارفارد جهاز هارفارد55-3333
تريس (1 م) ، الرقم الهيدروجيني = 7.0الحرارة العلميةAM9850G
حمام بالموجات فوق الصوتيةبرانسونCPX1800H
اليورياسيجما ألدريتشU5378-500G
نظام السد للقاحاتنيو إنجلاند بيولابسM2080S
Zymo-Spin IC أعمدةZymo ResearchC1004
Coolterm فيشر نظام فحص لوسيفيراز العلمي المرحلة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6(2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24(2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357(2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

mRNA

مقالات ذات صلة