Method Article

استراتيجية من خطوتين تجمع بين التعديل اللاجيني والإشارات الميكانيكية الحيوية لتوليد خلايا الثدييات متعددة القدرات

DOI:

10.3791/61655

⸱

August 29th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Department of Health, Animal Science and Food Safety and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano, 2Department of Veterinary Medicine, University of Sassari, 3Department of Agricultural and Environmental Sciences - Production, Landscape, Agroenergy and Center for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا طريقة تجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات بكفاءة ، دون الحاجة إلى نقل الجينات أو ناقلات الفيروسات القهقرية. وبالتالي ، فإن هذه الاستراتيجية واعدة للطب الانتقالي وتمثل تقدما ملحوظا في تكنولوجيا الخلايا العضوية الجذعية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن عكس النمط الظاهري للخلية أو تعديله بطرق مختلفة ، مع مزايا وقيود خاصة بكل تقنية. هنا نصف استراتيجية جديدة تجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات. هناك خطوتان رئيسيتان مطلوبتان. في الخطوة الأولى ، تتعرض الخلايا البالغة الناضجة (المتمايزة نهائيا) للممحاة اللاجينية 5-aza-cytidine لدفعها إلى حالة متعددة القدرات. تم تطوير هذا الجزء من البروتوكول ، استنادا إلى الفهم المتزايد للآليات اللاجينية التي تتحكم في مصير الخلية والتمايز ، ويتضمن استخدام المعدل اللاجيني لمحو الحالة المتمايزة للخلية ثم القيادة إلى نافذة عابرة عالية اللدونة.

في الخطوة الثانية ، يتم تغليف الخلايا المحذوفة في مفاعلات حيوية دقيقة متعددة التترافلورو إيثيلين (PTFE) ، والمعروفة أيضا باسم الرخام السائل ، لتعزيز إعادة ترتيب الخلايا 3D لتوسيع والحفاظ على اللدونة العالية المكتسبة والحفاظ عليها بشكل ثابت. PTFE هو مركب اصطناعي غير تفاعلي مسعور ويسمح استخدامه بإنشاء بيئة دقيقة خلوية ، والتي لا يمكن تحقيقها في أنظمة الثقافة التقليدية 2D. يشجع هذا النظام ويعزز الحفاظ على تعدد القدرات من خلال الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي الحيوي.

الإجراءات التقنية الموضحة هنا هي استراتيجيات بسيطة للسماح بتحريض وصيانة حالة عالية اللدونة في الخلايا الجسدية البالغة. سمح البروتوكول باشتقاق خلايا عالية اللدونة في جميع أنواع الثدييات التي تم اختبارها. وبما أنه لا ينطوي على استخدام نقل الجينات وخال من النواقل الفيروسية، فقد يمثل تقدما تكنولوجيا ملحوظا لتطبيقات الطب الانتقالي. علاوة على ذلك ، يوفر نظام المفاعل الحيوي الدقيق تقدما ملحوظا في تكنولوجيا الخلايا العضوية للخلايا الجذعية من خلال إعادة إنشاء بيئة دقيقة محددة في المختبر تسمح بزراعة طويلة الأجل للخلايا عالية اللدونة ، أي مثل ESCs و iPSCs والخلايا التي تم محوها فوق جيني و MSCs.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال العقود الماضية ، تم تنقيح المفهوم المقبول على نطاق واسع للتقدم أحادي الاتجاه نحو التزام الخلايا والتمايز بالكامل. وقد ثبت أنه يمكن عكس مواصفات الخلية ، ويمكن دفع خلية متمايزة نهائيا نحو حالة أقل التزاما وأعلى تساهلا ، باستخدام طرق مختلفة.

من بين الطرق العديدة المقترحة ، تتضمن إحدى الطرق الواعدة استخدام المركبات الكيميائية لحث الخلايا على ما يسمى بتعدد القدرات المستحث كيميائيا. الجزيئات الصغيرة المستخدمة في هذا النهج قادرة على التفاعل وتعديل التوقيع اللاجيني لخلية ناضجة بالغة ، وتجنب الحاجة إلى أي ناقل معدل وراثيا و / أو فيروسي1،2،3،4،5،6،7،8،9،10 . أظهرت العديد من الدراسات مؤخرا أنه من الممكن تحويل الخلايا من نمط ظاهري إلى آخر من خلال توفير محفزات كيميائية حيوية وبيولوجية محددة تحفز على إعادة تنشيط الجينات مفرطة الميثيل 11،12،13،14،15. تسمح أحداث إزالة الميثيل هذه بتحويل الخلايا المتمايزة نهائيا إلى سلف بدائي أو خلية متعددة القدرات أو عالية اللدونة / متعددة القدرات 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

في موازاة ذلك ، ركزت العديد من الدراسات مؤخرا على فهم الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، وبشكل أكثر تحديدا ، على إمكانية استخدام القوى الميكانيكية للتأثير بشكل مباشر على مرونة الخلايا و / أو التمايز16،17،18،19. في الواقع ، لقد ثبت بوضوح أن المصفوفة خارج الخلية (ECM) تلعب دورا رئيسيا في التحكم في مصير الخلية. على وجه الخصوص ، فإن الإشارات الميكانيكية الحيوية والفيزيائية الحيوية التي تنتجها ECM تنظم مباشرة الآليات الجزيئية ومسارات الإشارات ، مما يؤثر على سلوك الخلية ووظائفها20,21. وقد مهدت هذه البيانات الحديثة الطريق لتطوير أنظمة جديدة للثقافة ثلاثية الأبعاد تحاكي بشكل أوثق البيئة الدقيقة للخلايا في الجسم الحي ، وتكرر المحفزات الميكانيكية والفيزيائية التي تقود سلوك الخلية.

نحن هنا نصف بروتوكولا من خطوتين يجمع بين استخدام المحو الكيميائي اللاجيني مع الإشارات المتعلقة بالاستشعار الميكانيكي ، لتوليد خلايا متعددة القدرات للثدييات. في الخطوة الأولى ، يتم احتضان الخلايا بجزيء إزالة الميثيل 5-aza-cytidine (5-aza-CR). هذا العامل قادر على الحث على إزالة ميثيل الحمض النووي العالمية الهامة من خلال التأثير المشترك للنقل المباشر من عشرة إلى أحد عشر (TET2) بوساطةالإجراء 8,10 والتثبيط غير المباشر لميثيل ترانسفيراز الحمض النووي (DNMT)22,23. تحفز هذه الخطوة على إزالة الكتل اللاجينية مع إعادة تنشيط لاحقة للتعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات ، وبالتالي توليد خلايا عالية اللدونة1،2،3،8،10 ، يشار إليها فيما يلي باسم "الخلايا التي تم محوها فوق وراثيا". في الخطوة الثانية ، يتم تغليف الخلايا في نظام ثقافة 3D. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم استخدام المركب الاصطناعي غير التفاعلي الكارهة للماء polytetrafluoroethylene (PTFE ؛ مع حجم الجسيمات 1 ميكرومتر) كمفاعل حيوي دقيق ، والذي يسمح بإنشاء بيئة دقيقة خلوية لا يمكن تحقيقها من خلال استخدام أنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد التقليدية10. تلتصق جزيئات مسحوق PTFE بسطح قطرة السائل التي يتم فيها إعادة تعليق الخلايا وتعزل قلب السائل عن السطح الداعم ، مع السماح بتبادل الغاز بين السائل الداخلي والبيئة المحيطة24. يشجع "المفاعل الحيوي الدقيق PTFE" الذي تم الحصول عليه ، والمعروف أيضا باسم "الرخام السائل" ، الخلايا على التفاعل بحرية مع بعضها البعض ، مما يعزز إعادة ترتيب الخلايا ثلاثية الأبعاد25،26،27 ، ويمتد ويحافظ بثبات على حالة اللدونة العالية المكتسبة من خلال الإشارات المتعلقة بالميكانيكا الحيوية10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الدراسات والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة ميلانو. تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر ، الذي نشرته المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH). تمت الموافقة على عزل الخلايا البشرية عن الأفراد البالغين الأصحاء من قبل اللجنة الأخلاقية في Ospedale Maggiore Policlinico ، ميلانو. تم تنفيذ جميع الطرق في دراستنا وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة.

1. عزل الخلايا الليفية الجلدية

ملاحظة: يمكن تطبيق جميع الإجراءات الموضحة أدناه على الخلايا الليفية المعزولة من أنواع الثدييات المختلفة ، بما في ذلك الفأر والخنزير والإنسان. تم عزل خلايا المورين من الفئران الذكور البالغة من العمر 7 أسابيع وتم جمع أنسجة جلد الخنزير في المسلخ المحلي. تم عزل الخلايا البشرية عن المرضى البالغين ، بعد موافقة خطية مستنيرة.

  1. تحضير 0.1 ٪ محلول الجيلاتين الخنزير.
    1. يزن 0.1 غرام من الجيلاتين الخنزير ويذوبه في 100 مل من الماء. تعقيم محلول الجيلاتين عن طريق التعقيم قبل الاستخدام.
    2. غطي طبق بتري 35 مم بجيلاتين بورسين بنسبة 0.1٪ بإضافة 1.5 مل من المحلول المحضر. حضانة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. قطع خزعات جلد الثدييات (الفأر والخنزير والإنسان) التي يبلغ طولها حوالي 2-5 سم وضعها في محلول دولبيكو الملحي المخزن مؤقتا بالفوسفات (PBS) الذي يحتوي على محلول مضاد للفطريات مضاد للمضادات الحيوية بنسبة 2٪. يحفظ في + 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: يجب إجراء عمليات جمع الخزعات بالاتفاق وبعد موافقة اللجنة الأخلاقية، وفقا للمبادئ التوجيهية المعمول بها.
  3. اغسل الخزعات التي تم جمعها على نطاق واسع ثلاث مرات في PBS معقمة طازجة تحتوي على محلول مضاد للفطريات مضاد حيوي بنسبة 2٪.
  4. جمع الخزعات من الغسيل الأخير ووضعها في طبق بتري معقم 100 ملم. استخدم مشرطا معقما لتقطيعها إلى قطع بحجم 2 مم3 تقريبا.
  5. في نهاية الحضانة لمدة 2 ساعة ، قم بإزالة الفائض من محلول الجيلاتين من طبق بتري 35 مم (الموصوف في الخطوة 1.1.2) ، وباستخدام ملقط جراحي معقم ، ضع على الفور 5-6 شظايا جلدية في كل طبق ثقافة مغلف مسبقا.
  6. بلل الشظايا بإضافة قطرات 100 ميكرولتر من وسط عزل الخلايا الليفية (الجدول 1) فوق كل منها. الثقافة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    ملاحظة: لمنع الوسط من التبخر، ضع طبق بتري 35 مم داخل طبق بتري 100 مم أو أكبر يحتوي على ماء معقم. تأكد من تغطية كل من أطباق بتري.
  7. بعد 24 ساعة من الثقافة، تحقق من كمية الوسط في طبق بتري المستنبت 35 ملم. إذا لزم الأمر ، أضف 500 ميكرولتر من وسط عزل الخلايا الليفية للحفاظ على الشظايا رطبة.
  8. قم بإزالة الوسط بعناية وتحديثه على الأقل كل 2 أيام من الثقافة باستخدام ماصة.
  9. عندما تبدأ الخلايا الليفية في النمو من شظايا الجلد الموضوعة في طبق بتري 35 مم (الموصوف في الخطوة 1.5) وتبدأ في تكوين طبقة أحادية الخلية (عادة 6 أيام). قم بإزالة قطع الجلد باستخدام ملاقط جراحية معقمة وزرع في 2 مل من وسط عزل الخلايا الليفية.
  10. استمر في زراعة الطبقة الأحادية الخلية عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ حتى التقاء 80٪ وتحديث الوسط كل يومين.

2. زراعة خط الخلايا الأولية الليفية

  1. عندما تصل الخلايا الليفية إلى التقاء بنسبة 80٪ ، قم بإزالة وسط عزل الخلايا الليفية بعناية وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 3 مل من PBS يحتوي على محلول مضاد للفطريات مضاد حيوي بنسبة 1٪.
  2. لفصل الخلايا ، أضف 600 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ في طبق الاستزراع واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
  3. أضف 5.4 مل من وسط زراعة الخلايا الليفية لتحييد التربسين عندما تبدأ الخلايا في الانفصال عن طبق الاستزراع (الجدول 1).
  4. إزاحة الخلايا عن طريق السحب المتكرر واللطيف. خلايا الطبق في أطباق الثقافة الجديدة (بدون الجيلاتين) ، مع الحفاظ على نسبة المرور بين 1: 2 و 1: 4 (اعتمادا على معدل النمو).
    ملاحظة: الطرد المركزي ليس ضروريا.
  5. الحفاظ على الخلايا في الثقافة وتغيير الوسط كل 2 أيام ، حتى تصل إلى 80 ٪ من الالتقاء ومرورها.
    ملاحظة: نشر الخلايا الليفية مرتين في الأسبوع للحفاظ على نمو قوي.

3. التعرض للخلايا الليفية ل 5-aza-CR

  1. تحضير محلول مخزون 1 mM 5-aza-CR الطازج.
    1. يزن 2.44 ملغ من 5-aza-CR ويذوب في 10 مل من الجلوكوز العالي DMEM. أعد تعليق المسحوق عن طريق الدوامة. تعقيم الحل مع مرشح 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: يجب تحضير محلول مخزون 5-aza-CR مباشرة قبل الاستخدام.
    2. قم بإعداد حل عمل 5-aza-CR عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من محلول مخزون 5-aza-CR (3.1.1) في 1 مل من وسط زراعة الخلايا الليفية.
      ملاحظة: تركيز حل العمل 5-aza-CR هو 1 ميكرومتر 1,2,3,8,9.
  2. التريبسين الخلايا كما هو موضح سابقا (2.1.-2.3) وإزاحة الخلايا عن طريق السحب المتكرر وبلطف.
  3. جمع تعليق الخلية ونقله إلى أنبوب مخروطي.
  4. عد الخلايا باستخدام غرفة عد تحت المجهر الضوئي في درجة حرارة الغرفة. احسب حجم الوسط اللازم لإعادة تعليق الخلايا للحصول على 4 × 104 خلايا في 30 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الليفية المكمل ب 1 ميكرومتر 5-aza-CR (انظر الخطوة 3.1.2).
    ملاحظة: تعتمد الصيغة المراد استخدامها على نوع الغرفة المحدد.
    figure-protocol-1
  5. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 150 × g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الحبيبة الفائقة وأعد تعليق الكريات باستخدام وسط زراعة الخلايا الليفية المكمل ب 1 ميكرومتر 5-aza-CR (انظر الخطوة 3.1.2). للحصول على حجم وسط زراعة الخلايا الليفية الذي سيتم استخدامه ، انظر الخطوة 3.4.
    ملاحظة: كعنصر تحكم سلبي ، أعد تعليق الخلايا بنفس التركيز في وسط زراعة الخلايا الليفية بدون 5-aza-CR واستمر في تغليف الخلايا في مسحوق PTFE (الخطوة 4.1.-4.13).

4. تغليف الخلايا الليفية في المفاعلات الحيوية الدقيقة PTFE

  1. املأ طبق بتري 35 مم بمسحوق البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) لإنتاج سرير (الشكل 1A).
    ملاحظة: استخدم أطباق بتري البكتريولوجيا مقاس 35 مم لتجنب التصاق الرخام السائل. من أجل الحصول على قشرة رقيقة مسعورة ومسامية ، استخدم مسحوق PTFE بمتوسط حجم جسيم يبلغ 1 ميكرومتر ويتم إنتاجه بحد أقصى طحن يبلغ 2.0 NPIRI. هذا يسمح بإنشاء رخام سائل قابل للنفاذ للغاز. علاوة على ذلك ، يسهل الطلاء الشفاف مراقبة عمليات تجميع الخلايا في الوقت الفعلي يؤدي حجم الجسيمات الأكبر إلى تعدد التشتت العالي الذي يمكن أن يسبب التبخر المرتفع والتشوه وفقدان الشكل الكروي ، والذوبان المبكر للمفاعلات الحيوية الدقيقة.
  2. قم بتوزيع 30 ميكرولتر قطرة واحدة تحتوي على 4 × 10 4 خلايا (انظر الخطوات3.4 .- 3.5.) على سرير المسحوق (الشكل 1B).
  3. قم بتدوير طبق بتري 35 مم برفق في حركة دائرية للتأكد من أن مسحوق PFTE يغطي بالكامل سطح قطرة السائل لتشكيل مفاعل حيوي دقيق رخامي سائل (الشكل 1C).
  4. التقط المفاعل الحيوي الدقيق الرخامي السائل باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر ، مقطوع عند الحافة ، لاستيعاب قطر الرخام (الشكل 1D ، E). قم بصب المفاعل الحيوي الدقيق الرخامي السائل على طبق بتري نظيف من البكتريولوجيا لتحقيق الاستقرار فيه (الشكل 1F).
    ملاحظة: لإنشاء احتكاك للإمساك بالرخام داخل الطرف ، قم بقطع أطراف الماصة بقطر أقل قليلا تقريبا من قطر الرخام السائل.
  5. انقل المفاعل الحيوي الدقيق الرخامي السائل من طبق بتري إلى طبق بئر 96 (رخام / بئر واحد) (الشكل 1G).
  6. أضف ببطء 100 ميكرولتر من الوسائط من هامش البئر. يبدأ المفاعل الحيوي الدقيق في الطفو فوق الوسائط (الشكل 1H).
    ملاحظة: ينكسر المفاعل الحيوي الدقيق في اتصال سائل مباشر ، بسبب اضطراب كره الماء PTFE. وكنهج بديل، يمكن وضع المفاعلات الحيوية الدقيقة الرخامية السائلة بشكل فردي في طبق استزراع البكتريولوجيا عيار 35 ملم. في هذه الحالة ، من أجل منع تبخر الرخام السائل ، يجب إدخال طبق بتري 35 مم الذي يحتوي على المفاعل الحيوي الدقيق في طبق بتري 100 مم ، تم اقتباسه سابقا بالماء المعقم.
  7. احتضان المفاعل الحيوي الدقيق الرخامي السائل لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO 21،2،3،8،9.
    ملاحظة: يمكن أن يضمن حجم جسيمات PTFE البالغ 1 ميكرومتر تبادلا مثاليا للغازات بين السائل الداخلي والبيئة المحيطة.
  8. بعد حضانة 5-aza-CR لمدة 18 ساعة ، اجمع المفاعل الحيوي الدقيق الرخامي السائل باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر مقطوع عند الحافة (انظر الخطوة 4.5).
  9. ضع المفاعل الحيوي الدقيق في طبق بتري جديد من البكتريولوجيا مقاس 35 مم (الشكل 1D-F).
  10. استخدم إبرة لثقب الرخام السائل وكسره.
  11. استعادة الكرويات المشكلة مع طرف ماصة 200 ميكرولتر ، مقطوعة عند الحافة ، تحت مجهر مجسم (الشكل 1I ، J).
    ملاحظة: تشكل الخلايا التي تم محوها فوق وراثيا والمغلفة في PTFE بنية كروية 3D (مجموع واحد في كل رخام سائل).
  12. لتقييم اكتساب حالة متعددة القدرات استجابة ل 5-aza-CR ، تحقق من بداية التعبير الجيني المرتبط بتعدد القدرات ، OCT4 ، NANOG ، REX1 ، و SOX2 ، بواسطة PCR النوعي (الجدول 2).
  13. تابع الخطوة الثانية من البروتوكول كما هو موضح أدناه.

5. الثقافة في المفاعلات الحيوية الدقيقة PTFE للخلايا التي تم محوها وراثيا

  1. إعداد وسط ثقافة ESC طازج (الجدول 1).
  2. انقل المواد العضوية في طبق بتري يحتوي على وسيط ESC لغسل بقايا 5-aza-CR (انظر الخطوات 5.1.-5.2).
  3. قم بإعداد طبق بتري جديد 35 مم يحتوي على سرير مسحوق PTFE (انظر أيضا الخطوة 4.1).
  4. قم بتوزيع عضوي واحد في قطرة من 30 ميكرولتر من وسط ثقافة ESC على سرير المسحوق باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر ، مقطوع عند الحافة (انظر الخطوات 4.9.; 5.3.).
  5. قم بتدوير طبق بتري 35 مم برفق في حركة دائرية لتشكيل مفاعل حيوي دقيق رخامي سائل جديد ، والتقطه باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر ، وقطع عند الحافة ، ووضع المفاعل الحيوي الدقيق المشكل حديثا في بئر من 96 بئرا (رخام / بئر واحد) (انظر الخطوات 4.3.-4.6).
  6. ولتعويم المفاعلات الحيوية الدقيقة، يضاف 100 ميكرولتر من الوسائط من حافة البئر ليستحم الرخام ببطء (انظر الحاشية 4-7).
  7. استزراع المفاعلات الحيوية الدقيقة الرخامية السائلة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ طالما كان ذلك مطلوبا. تغيير الوسط كل يومين، باتباع الإجراء الموضح في 5.3.-5.7.
    ملاحظة: في هذه المخطوطة ، يتم توفير النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام ثقافة المواد العضوية لمدة 28 يوما. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن إجراء فترة ثقافة أطول.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول جميع الخطوات التي يتعين القيام بها لتوليد خلايا الثدييات متعددة القدرات والحفاظ عليها بشكل مستقر من الخلايا الجسدية البالغة. وقد نجحت هذه الطريقة مع الخلايا الليفية المعزولة من أنواع الثدييات المختلفة ، وهي الفأر والخنزير والإنسان. يتم الحصول على النتائج التمثيلية المبلغ عنها هنا من جميع خطوط الخلايا ، على التوالي من الأنواع الأصلية.

تظهر التحليلات المورفولوجية أنه بعد حضانة 18 ساعة باستخدام عامل إزالة الميثيل 5-aza-CR ، يتم تغليف الخلايا الليفية في مفاعلات PTFE الحيوية الدق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال العقود الماضية ، ركزت العديد من الدراسات على تطوير استراتيجيات لإعادة خلية متمايزة بشكل نهائي نحو حالة أقل التزاما وأعلى تساهلا. يسمح البروتوكول الموصوف هنا بتوليد الخلايا متعددة القدرات وصيانتها على المدى الطويل بدءا من الخلايا البالغة الناضجة المتمايزة نهائيا. تجمع هذه الطريقة بين خطوتين مستقلتين تتضمنان تحريض حالة عالية التساهل يتم تحقيقها من خلال المحو الكيميائي اللاجيني وصيانتها اللاحقة التي يتم ضمانها باستخدام نظام ثقافة 3D.

يتوافق تكوين الهياكل الكروية ثلاثية الأبعاد التي لوحظت في ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة كاراريسي و MiND FoodS Hub ID: 1176436. جميع المؤلفين هم أعضاء في COST Action CA16119 في المختبر 3-D إجمالي توجيه الخلايا واللياقة البدنية (CellFit).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM7522مكون من ESC medium
5-AzacytidineSigma-AldrichA23855-aza-CR ، لمحو الخلايا الليفية اللاجينية
AdenosineSigma-AldrichA4036مكون مزيج النيوكليوزيد
لمحلول مضاد للفطريات بالمضادات الحيوية المتوسطة ESC (100 مرة)Sigma-AldrichA5955مكون من الخلايا الليفية ووسائط ESC
CFX96مختبرات PCR Bio-RadThermal cycler ل PCR الكمي
CytidineSigma-AldrichC4654مكون من مزيج النيوكليوزيد ل ESC المتوسطة
DMEM ، الجلوكوز العالي ، البيروفاتThermo FisherScientific 41966052لعزل الخلايا الليفية ووسط الثقافة
DMEM ، منخفض الجلوكوز ، 31885023 علمي بيروفاتثيرمو فيشرل ESC متوسط
Dulbecco s الفوسفات المخزن الملحيSigma-AldrichD5652PBS ؛ للخزعة وغسل الخلايا ولتحضير المحلول
Dynabeads mRNA DIRECT Micro Purification KitThermo Fisher Scientific61021mRNA estraction
ESGRO Recombinant Mouse LIF ProteinSigma-AldrichESG1106الجنيني المتوسط ESC
، مؤهل ، معطل بالحرارةThermo Fisher Scientificمكون 10500064من الخلايا الليفية ووسائط ESC
FGF-Basic (AA10-155) البروتين البشري المؤتلفالحراري فيشرPHG0024المكون العلمي من الجيلاتين المتوسط ESC
من جلد الخنازيرSigma-AldrichG1890لطلاء الأطباق
نظام GeneAmp PCR 2700الأنظمة الحيويةالتطبيقية NAThermal cycler ل PCR النوعي
مثيلة الحمض النووي العالمية ELISA KitCELL BIOLABSSTA-380دراسة المثيلة
GoTaq G2 Flexi DNA PolymerasePromegaM7801Qualitative PCR
GuanosineSigma-AldrichG6264مكون من مزيج النيوكليوزيد ل ESC
متوسط Ham's F-10 Nutrient MixThermo Fisher Scientific31550031ل ESC متوسط
خروج المغلوب بديل المصلThermo Fisher 10828028للشريحة
الزجاجية ESC المتوسطة KOVA 10 مع شبكاتHycor Biomedical87144لعد الخلايا
Leica MZ APO مجهر ستيريوLeicaNAللمراقبة العضوية
محلول L-GlutamineSigma-AldrichG7513مكون من الخلايا الليفية ووسائط
ESC MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100X)مكون 11140035 العلمي Thermo Fisherمن ESC medium
Millex-GS 0.22 & micro ؛ مرشحات المسام mMilliporeSLGS033SBلتعقيم المحلول
M-MLV Reverse Transcriptase ، RNase H ناقص ، نقطة متحولةPromegaM3681mRNA النسخ العكسي
Multiskan FC MicroplatePhotometer Thermo Fisher Scientific51119000لقراءة لوحة ELISA
Nikon Eclipse TE300 مجهر تباين الطورالمقلوب نيكونNAللخلية الملاحظة
Perkin Elmer Thermal Cycler 480Perkin ElmerNAThermal Cycler للنسخ العكسي
Poly (رباعي فلورو إيثيلين) 1 & mu ؛ حجم الجسيماتm Sigma-Aldrich430935لتوليد المفاعل الحيوي الصغير
PureLink الحمض النووي الجينومي Mini KitThermo Fisher ScientificK182001Genomic DNA Estration
TaqMan Gene Expression Cells to-CTKit Thermo Fisher ScientificAM1728Quantitative PCR
ThymidineSigma-AldrichT1895مكون مزيج النيوكليوزيد لوسط ESC
طبق زراعة الأنسجة 100 × 20 مم ،833902Sarstedtالقياسي لعزل الخلايا الليفية
طبق زراعة الأنسجة 35 × 10 مم ، Sarstedt القياسي833900لعزل الخلايا الليفية
طبق زراعة الأنسجة 35 × 10 مم ، طبق بتري معلقSarstedt833900500علم الجراثيم لثقافة الرخام السائل
لوحة زراعة الأنسجة 96 بئر ، قياسي ، FSarstedt833924005لثقافة الرخام السائل
محلول التربسين-EDTASigma-AldrichT3924لأنبوب تفكك الخلايا الليفية
15 مل ، 120 × 17 مم ، PSSarstedt62553041للطرد المركزي لتعليق الخلية
UridineSigma-AldrichU3003مكون مزيج النيوكليوزيد لوسط ESC
في الوقت الحقيقي NA مكون من مصل الأبقار مكون العلمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  2. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of pig dermal fibroblast into insulin secreting cells by a brief exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (1), 31-43 (2014).
  3. Brevini, T. A. L., et al. Morphological and molecular changes of human granulosa cells exposed to 5-azacytidine and addressed toward muscular differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (5), 633-642 (2014).
  4. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell Journal. 17 (1), 153-158 (2015).
  5. Tan, S. J., et al. Muscle tissue engineering and regeneration through epigenetic reprogramming and scaffold manipulation. Scientific Reports. 5, 16333(2015).
  6. Brevini, T. A. L., Pennarossa, G., Acocella, F., Brizzola, S., Zenobi, A., Gandolfi, F. Epigenetic conversion of adult dog skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Veterinary Journal. 211, 52-56 (2016).
  7. Chandrakanthan, V., et al. PDGF-AB and 5-Azacytidine induce conversion of somatic cells into tissue-regenerative multipotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 2306-2315 (2016).
  8. Manzoni, E. F. M., et al. 5-azacytidine affects TET2 and histone transcription and reshapes morphology of human skin fibroblasts. Scientific Reports. 6, 37017(2016).
  9. Pennarossa, G., et al. Epigenetic erasing and pancreatic differentiation of dermal fibroblasts into insulin-producing cells are boosted by the use of low-stiffness substrate. Stem Cell reviews and reports. 14 (3), 398-411 (2018).
  10. Pennarossa, G., et al. Use of a PTFE micro-bioreactor to promote 3D cell rearrangement and maintain high plasticity in epigenetically erased fibroblasts. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (1), 82-92 (2019).
  11. Constantinides, P. G., Jones, P. A., Gevers, W. Functional striated muscle cells from non-myoblast precursors following 5-azacytidine treatment. Nature. 267 (5609), 364-366 (1977).
  12. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  13. Taylor, S. M., Constantinides, P. A., Jones, P. A. 5-Azacytidine, DNA methylation, and differentiation. Current Topics in Microbiology and Immunology. 108, 115-127 (1984).
  14. Jones, P. A. Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacology & Therapeutics. 28 (1), 17-27 (1985).
  15. Palii, S. S., Van Emburgh, B. O., Sankpal, U. T., Brown, K. D., Robertson, K. D. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B. Molecular and Cellular Biology. 28 (2), 752-771 (2008).
  16. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728(2017).
  17. Matamoro-Vidal, A., Levayer, R. Multiple influences of mechanical forces on cell competition. Current Biology. 29 (15), 762-774 (2019).
  18. Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Research & Therapy. 3 (5), 41(2012).
  19. Kumar, A., Placone, J. K., Engler, A. J. Understanding the extracellular forces that determine cell fate and maintenance. Development. 144 (23), Cambridge, England. 4261-4270 (2017).
  20. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Current Opinion in Cell Biology. 15 (6), 753-762 (2003).
  21. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. The Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  22. Christman, J. K. 5-Azacytidine and 5-aza-2[prime]-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy. Oncogene. 21, 5483-5495 (2002).
  23. Stresemann, C., Lyko, F. Modes of action of the DNA methyltransferase inhibitors azacytidine and decitabine. International Journal of Cancer. 123 (1), 8-13 (2008).
  24. Ledda, S., Idda, A., Kelly, J., Ariu, F., Bogliolo, L., Bebbere, D. A novel technique for in vitro maturation of sheep oocytes in a liquid marble microbioreactor. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (4), 513-518 (2016).
  25. Vadivelu, R. K., et al. Generation of three-dimensional multiple spheroid model of olfactory ensheathing cells using floating liquid marbles. Scientific Reports. 5, 15083(2015).
  26. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marble as bioreactor for engineering three-dimensional toroid tissues. Scientific Reports. 7 (1), 12388(2017).
  27. Vadivelu, R. K., Kamble, H., Munaz, A., Nguyen, N. T. Liquid Marbles as bioreactors for the study of three-dimensional cell interactions. Biomedical Microdevices. 19 (2), 31(2017).
  28. Varelas, X., et al. TAZ controls Smad nucleocytoplasmic shuttling and regulates human embryonic stem-cell self-renewal. Nature Cell Biology. 10 (7), 837-848 (2008).
  29. Panciera, T., et al. Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ. Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).
  30. Pennarossa, G., Paffoni, A., Ragni, G., Gandolfi, F., Brevini, T. A. L. Rho signaling-directed YAP/TAZ regulation encourages 3D spheroid colony formation and boosts plasticity of parthenogenetic stem cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1237, 49-60 (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epigenetic ModificationBiomechanical CuesPluripotent Cells5 Aza CytidinePTFE Micro BioreactorsLiquid MarblesCell RearrangementPluripotency MaintenanceDNA Methylation AnalysisMorphological Analysis

Related Articles