مقالة منهجية

التحليل النسيلي لقلب الفأر حديثي الولادة باستخدام نمذجة أقرب جار

DOI:

10.3791/61656

⸱

أغسطس 22, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Duke University, 2Center for Genomic and Computational Biology, Duke University, 3Department of Statistical Science, Duke University, 4Regeneration Next, Duke University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول لاستخدام تتبع النسب متعدد الألوان ونمذجة أقرب جار لتحديد خلايا عضلة القلب المشتقة مستنسخة أثناء النمو والتجدد في الفئران. هذا النهج موضوعي ، ويعمل عبر ظروف وضع العلامات المختلفة ، ويمكن تكييفه لدمج مجموعة متنوعة من خطوط أنابيب تحليل الصور.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من خلال استبدال عضلة القلب المفقودة أو المختلة ، يعد تجديد الأنسجة نهجا واعدا لعلاج قصور القلب. ومع ذلك ، فإن التحدي المتمثل في اكتشاف تجديد القلب بحسن نية يحد من التحقق من صحة عوامل التجدد المحتملة. تتمثل إحدى طرق الكشف عن خلايا عضلة القلب الجديدة في تتبع النسب متعدد الألوان مع التحليل النسيلي. قد يكون من الصعب إجراء تجارب التحليل النسيلي ، لأن ظروف وضع العلامات المتناثرة جدا تفتقر إلى الحساسية للأحداث النادرة مثل تكاثر خلايا عضلة القلب ، كما أن وضع العلامات المنتشرة يحد من القدرة على حل المستنسخة. يتم تقديم بروتوكول لإجراء تحليل نسيلي لقلب الفأر حديثي الولادة باستخدام النمذجة الإحصائية لأقرب توزيعات مجاورة لحل استنساخ خلايا عضلة القلب. يتيح هذا النهج حل المستنسخة عبر مجموعة من ظروف وضع العلامات ويوفر نهجا تحليليا قويا لقياس تكاثر خلايا عضلة القلب وتجديدها. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع الأنسجة الأخرى ويمكن استخدامه على نطاق واسع لدراسة تجديد الأنسجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السمة المميزة النسيجية لفشل القلب هي فقدان خلايا عضلة القلب (CMs) ، إما بعد الإصابة أو الشيخوخة أو موت الخلايا المبرمج1. يمثل تجديد عضلة القلب المفقودة أو المختلة من خلال تجديد الأنسجة استراتيجية علاجية محتملة لعلاج مرضى قصور القلب. على مدى العقود العديدة الماضية ، كشفت التطورات الأساسية في علم الأحياء التنموي والتجديدي عن قدرة محدودة لقلب الثدييات على تجديد CMsالمفقودة 2،3،4،5. أثار هذا العمل المثير إمكانية نشر آليات النمو الفطري للتجديد. نظرا لأن الاستجابات التجديدية الفطرية غائبة وظيفيا في قلب الثدييات البالغة ، فإن هناك حاجة إلى طرق لتحسين متانة الإصلاح الداخلي لتحقيق تجديد القلب العلاجي.

يبدو أن آليات تجديد القلب الفطري محفوظة عبر الأنواع. بعد الإصابة ، تتكاثر CMs الموجودة مسبقا لتوليد CMs جديدة في أسماك الزرد 6,7 ، والنيوت 8,9 ، والفئران 4,10 ، والجرذان11 ، والخنازير12,13. وفقا لذلك ، تسعى العديد من المجموعات إلى تحديد الميتوجينات القادرة على تعزيز تكوين عضلة القلب. ومع ذلك ، فإن هذا العمل يمثل تحديا. ليست مهمة جعل CMs الثدييات البالغة تتكاثر شاقة فحسب ، بل إن القدرة على تحديد الأحداث التكاثرية النادرة أمر صعب1،14. يتفاقم التحدي المتمثل في تحديد CMs النادرة لركوب الدراجات بسبب ميل CMs للثدييات البالغة إلى الخضوع بشكل تفضيلي لالتهاب البطانة. على سبيل المثال ، بعد إصابة قلب الفأر ، يدخل ما يقرب من 25٪ من CMs في المنطقة الحدودية إلى دورة الخلية ، لكن 3.2٪ فقط من CMs تقسم4. نظرا لأن معظم CMs التي تكرر الجينوم الخاص بها ولكنها تفشل في الخضوع للحركية الخلوية ، فإن مجرد فحص زيادة عدد CMs لركوب الدراجات أمر غامض لتكوين عضلة القلب حسن النية. وبالتالي ، فإن فحوصات دمج النيوكليوزيد بواسطة CMs أو لوجود علامات تكاثرية على CMs قد لا تشير تماما إلى التجديد. مع ظهور المزيد من العوامل المرشحة لتجديد القلب ، هناك حاجة إلى فحوصات لتحديد تضخم CM بشكل أفضل.

يعد التحليل النسيلي عن طريق تتبع النسب نهجا قيما لفحص تكوين عضلة القلب لأنه يسمح بالتصور المباشر للخلايا وذريتها. تتضمن الأساليب التقليدية للتحليل النسيلي وضع علامات نادرة للخلايا المفردة بجين مراسل. ومع ذلك ، قد يكون تتبع النسب أحادي اللون للخلايا النادرة ذا قيمة محدودة للأحداث النادرة مثل انتشار CM لأن فرص تسمية CM المنتشر منخفضة15. بدلا من ذلك ، يمكن أن يؤدي تتبع النسب متعدد الألوان إلى زيادة حساسية التحليل النسيلي16. باختصار ، يتم تصنيف الخلايا الفردية وراثيا بواحد من العديد من البروتينات الفلورية بشكل عشوائي ، بحيث تولد الخلايا المتكاثرة مجموعات ملونة متجانسة من الخلايا التي يمكن حلها من الخلايا الفلورية المجاورة. تم استخدام هذه الطريقة لتتبع النمو عبر مجموعة متنوعة من الأعضاء ، وتم تطبيقها مؤخرا على دراسات تجديد قلب الثدييات17،18. في حين أن تتبع النسب متعدد الألوان يمكن أن يكتشف التمدد النسيلي ل CMs في المراحل الجنينية وحديثي الولادة ، إلا أنه لا يمكن اكتشاف الاستجابات التجديدية الفطرية بسهولة في قلب الفأر البالغ بعد إصابة القلب17،19. تتمثل إحدى طرق تعزيز حساسية تتبع النسب متعدد الألوان في زيادة مستوى وضع العلامات وزيادة احتمالية تصور الأحداث النادرة. ومع ذلك ، فإن وضع العلامات الأوسع يأتي على حساب عدم القدرة على التمييز بين الخلايا ذات العلامات المماثلة على أنها تنبثق من سلف مشترك مقابل الخلايا التي تم تصنيفها بشكل مستقل بنفس الفلوروفور. يتم تقديم بروتوكول يستخدم نمذجة أقرب جار لتحديد CMs المرتبطة نسليا في قلب الفأر حديثي الولادة. هذه الطريقة غير متحيزة وكمية وتعمل على مجموعة من شروط وضع العلامات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتطلب جميع إجراءات التعامل مع الفئران وإجراء جراحات البقاء على قيد الحياة وحصاد القلوب موافقة لجنة استخدام المؤسسية المحلية.

1. الفئران للتحليل النسيلي ل CMs

  1. عبر فئران Myh6-MerCreMer 20 مع GT (ROSA) 26Sortm1 (CAG-EGFP ، -mCerulean ، -mOrange ، -mCherry) فئران Ilw 21 لتوليد Myh6-MerCreMer ؛ R26R-قوس قزح الفئران ثنائية المعدلة وراثيا.
    1. حافظ على مخزون الفئران متماثلة الزيجوت لأليل R26R-Rainbow وعبر مع الفئران متغايرة الزيجوت لأليل Myh6-MerCreMer ، بحيث يتم إجراء جميع التجارب في الفئران متغايرة الزيجوت لأليل R26R-Rainbow. بدلا من ذلك ، استخدم الفئران متماثلة اللواقح لأليل R26R-Rainbow لزيادة تنوع الألوان ، ولكن هذا سيتطلب نظام تصوير يمكنه التمييز بأمانة بين EGFP و mCerulean و mOrange و mCherry fluorophores.
  2. إجراء التنميط الجيني في وقت جمع القلب.
    ملاحظة: تعبر الفئران Myh6-MerCreMer عن إعادة تركيب Cre المحفز للتاموكسيفين في CMs ويمكن تنميطها جينيا باستخدام بادئات PCR CGTACTGGGGTGGGAGAAT (Cre-F) و GTGGCAGATGGCGCGGCAACA (Cre-R) لتوليد منتج 200 زوج أساسي (bp). تعبر فئران R26R-Rainbow بشكل أساسي عن EGFP ولكنها ستعبر بشكل عشوائي عن mCerulean أو mOrange أو mCherry بعد إعادة التركيب بوساطة Cre. يمكن تنميط R26R-Rainbow باستخدام بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل CTCTGCTGCCTCTCTCGGCTTCT (R26-F) و CGAGGCGGATCACACAATA (R26-R) و TCAATGGGCGGGGGTCGTT (Rainbow-R). يعطي الأليل من النوع البري منتجا بقوة 350 نقطة أساس ويعطي أليل قوس قزح منتجا بقوة 250 نقطة أساس.

2. إصابة التبريد ووضع العلامات على خلايا عضلة القلب

  1. قم بإجراء إصابات التبريد كما هو موضح سابقا مع تعديلات طفيفة22،23. ضع الفئران البالغة من العمر يوما واحدا (P1) بحذر على سرير من الثلج المجروش لمدة 3 دقائق للحث على السكتة القلبية. تأكد من التخدير الكافي عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم دون انسحاب انعكاسي.
    ملاحظة: توقيت التخدير أمر بالغ الأهمية. يمكن أن يضعف البقاء على قيد الحياة إذا تم تبريد الفئران لفترة طويلة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عمر الفئران أمر بالغ الأهمية. تتضاءل القدرة على التجدد بشكل حاد خلال الأسبوع الأول من العمر10.
  2. ضع الجرو المخدر على كمادة باردة وتحت هدف مجهر تشريح جراحي. استخدم مقص دقيق مقاس 6 مم لإجراء بضع الصدر بين الضلع الرابع والخامس لكشف السطح الأمامي للقلب.
  3. باستخدام مسبار التبريد المبرد بالنيتروجين السائل ، ضع المسبار على البطين الأيسر لمدة 1-2 ثانية. بالنسبة للإصابات الزائفة ، قم بإجراء بضع الصدر دون إصابة بالتبريد.
    ملاحظة: تحدد مدة الإصابة بالتبريد مدى الإصابة. ستقلل الإصابات المطولة من معدلات البقاء على قيد الحياة.
  4. أغلق الشق بخياطة 6-0 من مادة البولي بروبيلين متصلة بإبرة قطرها 0.15 مم.
  5. قم بتسخين الجرو بسرعة وتحفز يدويا لاستئناف تدفق الدم. بمجرد أن يتحرك الجرو تلقائيا ، ضعه على وسادة تدفئة.
  6. حقن الجراء المستردة ب 20 ميكروغرام من تاموكسيفين داخل الصفاق. في هذه المرحلة ، قم بحقن المسكنات ، مثل 0.25٪ بوبيفاكائين على طول خط الخياطة ، إذا لزم الأمر. إعادة الجراء إلى السد.
    ملاحظة: يتم استرداد الجراء من القمامة الواحدة معا وإعادتها إلى السد معا. يعمل سير العمل هذا على تحسين البقاء على قيد الحياة وإعادة قبول القمامة بواسطة السد.

3. حصاد القلوب ومعالجتها للتحليل النسيجي

  1. احصد القلوب بعد 20 يوما من الإصابة (نقطة في البوصة) ، أو يوم ما بعد الولادة (P21) ، حيث يمكن ملاحظة الاستجابات التجديدية بحلول هذه النقطةالزمنية 10. أولا قتل الفئران في غرفة استنشاق ثاني أكسيد الكربون2 ثم نقلها إلى المجهر الجراحي.
    ملاحظة: يجب إجراء القتل الرحيم وفقا للإرشادات المؤسسية لاستخدام.
  2. بمجرد التأكد من التخدير الكافي ، قم بإجراء بضع الصدر المزدوج باستخدام مقص جراحي لكشف القلب. بعد ذلك ، قم بنقف القلب ب 1 مل من 1 M KCl ، و 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد ، و 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    ملاحظة: هناك حاجة إلى الغسيل الكافي للحد من الجلطات الدموية داخل البطينين التي يمكن أن تسبب التألق الذاتي أثناء التقاط الصورة.
  3. بعد التروية ، قم بتشريح القلب وضعه في أنبوب يحتوي على 1 مل على الأقل من PBS.
  4. استخدم مجهر تشريح لتقليم القلوب من أجل تحسين التضمين. توفر الشريحة الأفقية أسفل الردهة سطحا جيدا لتضمين القلوب للأقسام ذات المحور القصير.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أن يقطع القلب بشكل عرضي إذا كانت هناك حاجة إلى أقسام المحور الطويل.
  5. ضع القلوب المشذبة في 1 مل من 30٪ (بالوزن / حجم) السكروز عند 4 درجات مئوية لمدة 12-18 ساعة. قم بإزالة العينات من محلول السكروز. قم بتضمين الأنسجة المشذبة في كتل باستخدام وسائط تجميد الأنسجة.
  6. قم بتجميد الأنسجة المضمنة بسرعة على الثلج الجاف وتخزين الكتل عند -80 درجة مئوية.
  7. قم بتقسيم كتل القلب الكامل المجمدة إلى أقسام 10 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد ، وقم بتثبيتها على شرائح مشحونة ، وقم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية. قلوب القسم المتسلسل عبر 10 شرائح. يتم ذلك عن طريق تركيب قسم على كل شريحة من الشرائح العشر قبل العودة إلى الشريحة الأولى لإضافة قسم آخر. تحد هذه الإستراتيجية من فرصة التقاط نفس CMs في أقسام متعددة في شريحة معينة.
    ملاحظة: احرص على الحد من التعرض للضوء لمنع فقدان التألق.
  8. عندما تكون جاهزا للتصوير ، قم بإذابة الشرائح وإعادة الترطيب في PBS. أضف وسيط تركيب مضاد للبهتان قبل تطبيق غطاء زجاجي # 1.5. قم بتخزين الشرائح المنزلقة في وعاء مغطى عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بالنسبة للنتائج المتوقعة للإصابة بالتبريد ، يتم توجيه القارئ نحو العمل السابق حول هذا الموضوع23. تحتوي أقسام القلب على مستويات عالية من التألق الذاتي. يمكن أن يساعد استخدام عوامل التبريد ، مثل سودان بلاك ، قبل تطبيق غطاء الغطاء في التخفيف من التألق الذاتي. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر لتجنب إخماد الفلوروفورات ذات الأهمية.

4. التصوير

ملاحظة: تنطبق الخطوات أدناه على استخدام مجهر تجاري (انظر جدول المواد) يحتوي على نظام مضان عريض المجال مع مكعبات ترشيح مجهزة للتمييز بين الفلوروفورات mCerulean و EGFP و mOrange و mCherry والبرامج المرتبطة بهذا الإعداد (انظر جدول المواد). ستختلف الخطوات الإضافية اعتمادا على نظام التصوير الدقيق المستخدم.

  1. قم بتصوير الشريحة بأكملها بتكبير 5x باستخدام مرشح GFP فقط لإنشاء خريطة شرائح.
  2. حدد الأقسام الفردية على خريطة الشرائح السليمة وذات التألق الذاتي المحدود للتصوير. نظرا للتقسيم التسلسلي في مجموعات من 10 شرائح ، ستكون الأقسام المجاورة على بعد 100 ميكرومتر على الأقل ، مما يمنع تصوير نفس CMs.
  3. قم بإجراء تصوير مسح ضوئي للإطارات المتجانبة للأقسام الفردية باستخدام هدف 20x باستخدام مرشحات mCerulean و mOrange و mCherry و EGFP. تظهر الصور التمثيلية في الشكل 1.
  4. احفظ الصور بتنسيق يسمح باسترداد معلومات القناة الفردية. احرص على تسمية الملفات بتنسيق يسمح بتحديد القلب والفلوروفور وموضع القسم داخل القلب. مطلوب نهج تسمية منهجي للخطوات الحسابية أدناه.

5. تحليل الصور لتحديد CMs المصنفة

  1. حدد الأقسام المصورة السليمة من كل مجموعة ووزعها بشكل عشوائي على جميع الشاشات. تأكد من التزام أجهزة الفحص بالخطوات التالية لكل صورة.
  2. لكل قناة (mCerulean و mOrange و mCherry) ، استخدم أداة "Color Balance" على ImageJ24 لضبط سطوع الصورة وتباينها لمساعدة المستخدم على تحديد الخلايا المصنفة.
    ملاحظة: ImageJ هي أداة مجانية لتحليل الصور يمكن تنزيلها من https://imagej.net. استخدم هذا البروتوكول الإصدار 2.0.0-rc-69 / 1.52i.
  3. في ImageJ ، حدد "تعيين القياسات" من القائمة المنسدلة "تحليل". في النافذة التي تفتح، حدد "المنطقة | مركز الكتلة | مستطيل محيط | الحد إلى العتبة".
    ملاحظة: يمكن أحيانا استخدام وحدة طرح الصورة لتحسين إشارة الفلوروفور بالنسبة للتألق الذاتي في الخلفية. ومع ذلك ، إذا تم إجراؤه ، فيجب أن يتم الطرح بشكل منهجي لجميع الصور في مجموعة البيانات.
  4. مع فتح صورة الاهتمام ، حدد "أدوات" ثم حدد "مدير عائد الاستثمار" من القائمة المنسدلة "تحليل". سيتم فتح هذا ، نافذة "مدير العائد على الاستثمار".
  5. حدد أداة "التحديدات اليدوية" من شريط أدوات ImageJ وتتبع الخلية محل الاهتمام (الشكل 2 أ). بمجرد التتبع ، اضغط على "t" أو استخدم الزر "إضافة [t]" في نافذة "مدير العائد على الاستثمار" (الشكل 2 ب). كرر ذلك لجميع خلايا قناة واحدة.
    ملاحظة: يجب أن يتم التجزئة وعائد الاستثمار لكل قناة على حدة.
  6. بمجرد تحديد جميع الخلايا لقناة معينة ، احفظ عائد الاستثمار كملف .zip. افعل ذلك عن طريق تحديد "إلغاء التحديد" أولا في نافذة "مدير عائد الاستثمار" للتأكد من عدم تمييز عائد استثمار واحد. ثم انقر فوق علامة التبويب "المزيد" في نافذة "مدير عائد الاستثمار" وحدد خيار "حفظ". سيؤدي هذا إلى فتح متصفح سطح المكتب ، حيث يتم حفظ عائد الاستثمار كملف .zip.
  7. تصدير القياسات لكل من عائد الاستثمار كملف .csv. للقيام بذلك ، تأكد من عدم تمييز عائد استثمار واحد ، مرة أخرى عن طريق تحديد "إلغاء التحديد" ، ثم حدد "قياس" في نافذة "مدير عائد الاستثمار". سيؤدي هذا إلى فتح نافذة "نتائج" جديدة مع جميع القياسات المحددة مسبقا.
  8. في نافذة "النتائج" ، حدد "ملف" ، ثم حدد "حفظ باسم" من القائمة المنسدلة (الشكل 2 ج). سيؤدي هذا مرة أخرى إلى فتح متصفح سطح المكتب ، بحيث يمكن حفظ الملف بتنسيق .csv.
    ملاحظة: تأكد من حفظ عائد الاستثمار والقياسات قبل الانتقال إلى تقسيم القناة التالية.
  9. احرص على تسمية الملفات بتنسيق يسمح بتحديد القلب والقناة وموضع القسم داخل القلب. على سبيل المثال، "HeartType#_Set#_Section#_Channel" (على سبيل المثال، "CI-1_Set4_S3_mOrange.zip" لعائد الاستثمار و"CI-1_Set4_S3_mOrange.csv" للقياسات المقابلة).
    ملاحظة: يفترض الكود أدناه اصطلاح التسمية أعلاه. سيتطلب اصطلاح تسمية مختلف تعديلا على الكود.

6. التحليل الإحصائي

ملاحظة: الخلايا التي تحمل نفس الفلوروفور هي مزيج من الخلايا المشتقة من النسيل (الأقارب) والخلايا غير ذات الصلة التي خضعت لحدث إعادة تركيب عشوائي للتعبير عن نفس الفلوروفور (غير الأقارب). بناء على البيانات السابقة17 ، يفترض أن تكون خلايا الأقارب أقرب إلى الخلايا غير القريبة التي تعبر عن نفس الفلوروفور. وبالتالي ، يمكن تمييز الخلايا القريبة وغير الأقارب بناء على عتبة المسافة. ومع ذلك ، من أجل تحديد العتبة ، يجب فك التوزيعات القريبة للخلايا القريبة وغير الأقارب. لحسن الحظ ، يمكن تقدير توزيعات أقرب جار للخلايا غير القريبة من خلال تقييم أقرب قيم مجاورة من كل خلية إلى أقرب خلية تحمل فلوروفور مختلف. هنا ، يتم تقديم منهجية لتحديد مسافة العتبة إحصائيا لتحديد الاستنساخ وتعيين احتمال القرابة بين الخلايا.

  1. باستخدام ملفات .csv التي تم الحصول عليها من القسم 5 ، احسب أقرب مسافات مجاورة لكل خلية داخل شريحة قلب. قم بتجميع هذه النتائج في مسافات داخل القناة (mCerulean-mCerulean و mOrange-mOrange و mCherry-mCherry) وبين القنوات (mCerulean-mOrange و mOrange-mCherry و mCherry-mCerulean). احفظ النتائج في ملفين .csv: أحدهما داخل القناة والآخر للمسافات بين القنوات.
    1. قم بتثبيت كود Python25 الذي يتطلب مكتبات numpy و pandas.
      > نقطة تثبيت numpy ؛ نقطة تثبيت الباندا
    2. احسب المسافات وتصدير ملفات .csv للمسافات داخل القناة والمسافات بين القنوات باستخدام snippet_6_1.py python.
  2. اقرأ المسافات داخل القناة وبين القنوات في إطار بيانات R26 ، وتحويل معرفات القلب إلى متغير فئوي. قم بتطبيق عتبة مختارة مخصصة من خلال النظر إلى أقرب رسوم بيانية للجار (الشكل 3أ ، ج) لتقليل القيم المتطرفة. تأكد من اختيار عتبة تغطي أكثر من 90٪ من المسافات بين القناة وداخل القناة ، مع استبعاد الذيل الطويل لتجنب الإفراط في الملاءمة للضوضاء عند المسافات الكبيرة الأقرب للجار. يستخدم هذا البروتوكول عتبة 400 ميكرومتر (الشكل 3). استخدم Rscript snippet_6_2.R لتنفيذ هذه الخطوة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن للمرء نمذجة شرائح متعددة كمتغيرات فردية. يحد هذا البروتوكول من تعقيد النموذج إلى مستوى القلب لسهولة النمذجة والتقدير.
  3. الحصول على اللوغاريتمات الطبيعية للمسافات داخل القناة وبين القنوات. نظرا لأن الخلايا تشغل مساحة ، وكيانات غير نقطية ، فإن الحد الأدنى لتوزيع مسافة الجار الأقرب يتمحور حول قيمة غير صفرية وله ذيول غير متماثلة نظرا لأن المسافة القصوى بين أزواج الخلايا يمكن أن تكون أعلى بكثير من القيم المتوسطة (الشكل 3أ ، ج). استخدم التوزيع اللوغاريتمي العادي لنمذجة هذه التوزيعات (الشكل 3ب ، د). قم بذلك باستخدام Rscript snippet_6_3.R.
  4. استخدم نموذج بايز التالي لتقدير وسائل وفروق الأقارب (α2 ، σ22) وغير الأقارب (α1 ، σ21) التوزيعات الأقرب المجاورة ، واحتمال المسافات داخل القناة الناشئة عن توزيع الأقارب (π = eβ / (1 + eβ)):
    bw.disti ~ N (α1 ، σ21 | L.LIM iwi.disti ~ N (α1 ، σ21 | L.Lim i2 ، σ2 2 | L.LIM < wi.distiσ1 ~ T1 (0،1 | σ1>0)
    σ2 ~ T1 (0،1 | σ2>0)
    α1 ~ يونيف(2،6)
    α2 ~ يونيف(1،5)
    β ~ يونيف(-5,0)
    حيث Unif(a,b) هو التوزيع المنتظم على الفاصل الزمني [a,b], N(μ,σ2|l2 مقيدا بالفاصل الزمني (l,u) ، T1 (0,1 | x>0) هو توزيع كوشي القياسي (T مع درجة واحدة من الحرية) مقيد بنصف الخط الموجب ، bw.disti هي المسافةالمسجلة بين القنوات الزوجية و wi.disti هي مسافةزوج مسجلة داخل القناة. لاحظ أن المسافات المسجلة داخل القناة لها توزيع خليط مكون من عنصرين يعكس خليط أزواج الخلايا الأقارب وغير الأقارب.
    1. قم بتزويد النموذج بمقدمات إعلامية إن أمكن. على سبيل المثال ، يتوقع هذا البروتوكول أن تكون خلايا الأقارب أقرب إلى بعضها البعض من الخلايا غير القريبة ، لذلك يتم توفير هذا كسابق لمتوسط توزيع المسافات. بعد ذلك ، استخدم حزم runjags27 و coda28 R وبرنامج JAGS29 لتقدير المعلمات (Rscript snippet_6_4.R).
  5. قم بتنفيذ نموذج JAGS بعدد السلاسل المقابلة لعدد وحدات المعالجة المركزية المتاحة. استخدم Rscript snippet_6_5.R لتنفيذ هذه الخطوة. اسمح للبرنامج بالعمل حتى التقارب.
  6. استخدم المقاييس لاختبار تقارب الخوارزمية ، مثل حجم العينة الفعال (المتوفر مع runjags) ، وتشخيص تقارب Gelman-Rubin (متوفر مع runjags) ، والارتباط التلقائي (autocorr / autocorr.diag متوفر في الكودا). تحقق من جودة ملاءمة النموذج المقدر لأقرب مسافات مجاورة عن طريق فحص مخطط Q-Q ، والذي يرسم مقارنة على المستوى الكمي للقيم الفعلية والمقدرة لأقرب مسافات مجاور باستخدام Rscript snippet_6_6.R (الشكل 4C ، F). يتطلب هذا البرنامج النصي من المستخدم تحرير القيم في الأسطر 25-29 من snippet_6_6.R استنادا إلى الإخراج من الأمر 6.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، ينبغي الحصول على حجم عينة فعال (SSeff) أكبر من 000 10 لكل معلمةمن المعلمات 30. ومع ذلك ، قد يكون SSeff أكبر من 2,500 مناسبا لبعض الطرز المعقدة. تشخيص جيلمان روبن هو 1.00 للتقارب المثالي ويجب أن يكون أقل من 1.05 للتقارب المرضي. يشير الارتباط الذاتي العالي إلى الاختلاط البطيء داخل السلاسل وهو مؤشر على التقارب البطيء. يجب أن تتبع مخطط الارتباط التلقائي اضمحلال أسي في حالة وجود نموذج جيد. يجب أن يتبع مخطط Q-Q للتوزيعات الفعلية والنموذجية لأقرب جار (الشكل 4C ، F) القطر بأكبر قدر ممكن.
  7. بعد التحقق من دقة النماذج ، احصل على احتمال أن يكون زوج من الخلايا قريبا كدالة لمسافة بينهما. لتحديد مسافة العتبة لتحديد ما إذا كان من المحتمل أن تكون الخلايا داخل القناة قريبة ، حدد المسافة التي ينخفض عندها احتمال أن تكون قريبا إلى أقل من 0.5. يمكن القيام بذلك باستخدام Rscript snippet_6_7.R.
    ملاحظة: يمكن اختيار العتبات البديلة بناء على الأهداف التجريبية. بالنسبة لبعض التطبيقات ، قد لا تكون العتبات ذات صلة ويمكن استخدام احتمال أن يكون زوجا من الأقارب مباشرة لوزن أزواج الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن ينتج عن اتباع بروتوكول الإصابات البردية لحديثي الولادة قلوب P21 مع وبدون إصابة. القلوب المصابة بالتبريد لها إصابة محدودة جيدا بينما سطح القلوب الزائفة أملس ومتجانس. في القلوب المصابة بالتبريد ، يجب أن تكون منطقة الإصابة متسقة من القلب إلى القلب. بعد الفحص المجهري ، يجب الحصول على صور مشابهة للشكل 1 . لاحظ أن دقة الصورة تسمح بتحديد CMs الفردية وأن ظروف التصوير تسمح بحل كل فلوروفور. بالإضافة إلى ذلك ، لاحظ أن الإصابات ليست انتقالية حيث يمكن أن تتضاءل الاستجابات التجديدية مع إصابات أكبر<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تتبع النسب متعدد الألوان نهجا قويا لتحديد أنماط نمو الأعضاء بدقة الخلية الواحدة. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية على تتبع النسب متعدد الألوان هو الحاجة إلى وضع العلامات المتناثرة للخلايا ، والتي يمكن أن تقلل من حساسية تحديد الأحداث النادرة. بالنسبة لأعضاء مثل القلب ذات المستويات المنخفضة الشهيرة من دوران الخلايا المتني ، يمكن أن يؤدي ذلك إلى التقليل من استجابات النمو. يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء تحليل نسيلي لتمدد CM أثناء النمو والتجدد في فأر حديثي الولادة. الأهم من ذلك ، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل R03 HL144812 (RK) ، وجائزة عالم الأطباء بجامعة ديوك (RK) ، ومنحة مؤسسة ماندل للبذور (RK) ، ومنحة تدريب T32 HL007101 (DCC). نود أيضا أن نتوجه بالشكر إلى إيفلين ماكولو للمساعدة في تربية الفئران والدكتور دوغلاس مارشوك وماثيو ديتر للتعليقات والمناقشات المفيدة. أخيرا ، نود أن نشكر Purushothama Rao Tata على التفضل بتقديم فئران R26R-Rainbow .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 1.5 غطاء زجاجيFisherScientific12-544E
6-O proleneEthicon8706H
وسيط تركيب مضاد للبهتانFisherScientific00-4958-02
استنشاق CO2
حزمة
CryomoldsVWR15160-215
تصفية CryoprobeWorld Precision Instruments501313
GT (ROSA) 26Sortm1 (CAG-EGFP ، -mCerulean ، -mOrange ، -mCherry) Ilw < / sup> الفئران
برنامجhttps://imagej.net
KCl 1MFisherScientificLC187951
Leica CM3050 cryostat
النيتروجين
، 6 ممأدوات الدقة العالمية14003
< م > < / م > CreERT2 الفئرانمختبر جاكسونحامل
أدوات الدقة العالمية14109
بارافورمالدهايد 4٪فيشر ساينتيكAC416785000
فوسفات مخزن محلول ملحي
Pythonhttps://www.python.org/
Rhttps://cran.r-project.org/
دوار شاكر
مجسم
سكروز 30٪ (بالوزن / الحجم)FisherScientificBP220
مقص تشريح جراحيالدقة العالمية14393
حقنة لتاموكسيفينVWRBD328438
تاموكسيفين ، 20 مو ؛ زSigmaT5648
وسائط تجميد الأنسجةVWR15148-031
شرائح بيضاء بلوري / PlusGlobe Scientific1358W
Zeiss Axio Imager M1 نظام مضان
برنامج Zen 2.5 Blue
غرفة باردةمكعبات ImageJ مقص السائل إبرة 005657 أدوات واسع النطاق يستقيم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).
  2. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
  3. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  4. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  5. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  6. Kikuchi, K., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  7. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  8. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. Journal of Experimental Zoology. 187 (2), 249-253 (1974).
  9. Oberpriller, J., Oberpriller, J. C. Mitosis in adult newt ventricle. Journal of Cell Biology. 49 (2), 560-563 (1971).
  10. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  11. Wang, H., et al. Natural Heart Regeneration in a Neonatal Rat Myocardial Infarction Model. Cells. 9 (1), (2020).
  12. Ye, L., et al. Early Regenerative Capacity in the Porcine Heart. Circulation. 138 (24), 2798-2808 (2018).
  13. Zhu, W., et al. Regenerative Potential of Neonatal Porcine Hearts. Circulation. 138 (24), 2809-2816 (2018).
  14. Kadow, Z. A., Martin, J. F. Distinguishing Cardiomyocyte Division From Binucleation. Circulation Research. 123 (9), 1012-1014 (2018).
  15. Roy, E., Neufeld, Z., Livet, J., Khosrotehrani, K. Concise review: understanding clonal dynamics in homeostasis and injury through multicolor lineage tracing. Stem Cells. 32 (12), 3046-3054 (2014).
  16. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  17. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nature Communications. 9 (1), 1-13 (2018).
  18. Xiao, Q., et al. A p53-based genetic tracing system to follow postnatal cardiomyocyte expansion in heart regeneration. Development. 144 (4), 580-589 (2017).
  19. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  20. Sohal, D. S., et al. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circulation Research. 89 (1), 20-25 (2001).
  21. Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
  22. Polizzotti, B. D., et al. Neuregulin stimulation of cardiomyocyte regeneration in mice and human myocardium reveals a therapeutic window. Science Translational Medicine. 7 (281), 245(2015).
  23. Polizzotti, B. D., Ganapathy, B., Haubner, B. J., Penninger, J. M., Kuhn, B. A cryoinjury model in neonatal mice for cardiac translational and regeneration research. Nature Protocols. 11 (3), 542-552 (2016).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. van Rossum, G. Python tutorial, Technical Report CS-R9526. Centrum voor Wiskunde en Informatica (CWI). , Amsterdam. (1995).
  26. Team, R. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2013).
  27. Denwood, M. J. runjags: An R package providing interface utilities, model templates, parallel computing methods and additional distributions for MCMC models in JAGS. Journal of Statistical Software. 71 (9), 1-25 (2016).
  28. Plummer, M., Best, N., Cowles, K., Vines, K. CODA: convergence diagnosis and output analysis for MCMC. R News. 6 (1), 7-11 (2006).
  29. Plummer, M. Proceedings of the 3rd international workshop on distributed statistical computing. , Vienna, Austria. 1-10 (2003).
  30. Kruschke, J. Doing Bayesian data analysis: A tutorial with R, JAGS, and Stan. , Academic Press. (2014).
  31. Darehzereshki, A., et al. Differential regenerative capacity of neonatal mouse hearts after cryoinjury. Developmental Biology. 399 (1), 91-99 (2015).
  32. Kimura, W., et al. Hypoxia fate mapping identifies cycling cardiomyocytes in the adult heart. Nature. 523 (7559), 226-230 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Multicolor Lineage TracingCardiomyocyte ProliferationTissue RegenerationStatistical ModelingCardiomyocyte ClonesHeart FailureTissue Regeneration
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة