مقالة منهجية

فائق السرعة الغربية لطخة باستخدام تقنية تحسين رد المناعة

DOI:

10.3791/61657

⸱

سبتمبر 26, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2United Graduate School of Drug Discovery and Medical Information Sciences, Gifu University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تطوير تقنية النشاف الغربية فائقة السرعة من خلال تحسين حركية الأجسام المضادة المضادة المضادة الملزمة من خلال تقنية تجفيف الدوريات وتجديدها (CDR) بالاقتران مع عامل تعزيز رد المناعة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البقعة الغربية (المعروفة أيضا باسم مناعي) هي طريقة متعارف عليها لأبحاث الطب الحيوي. ويستخدم عادة لتحديد الحجم النسبي ووفرة بروتينات محددة، فضلا عن تعديلات البروتين بعد الترجمة. هذه التقنية لها تاريخ غني وتبقى في الاستخدام على نطاق واسع بسبب بساطتها. ومع ذلك ، فإن إجراء النشاف الغربي يستغرق ساعات ، حتى أيام ، لإكمال ، مع اختناق حرج هو أوقات الحضانة الطويلة التي تحد من الإنتاجية. هذه الخطوات الحضانة مطلوبة بسبب الانتشار البطيء للأجسام المضادة من المحلل السائبة إلى المستضدات المُشلّة على الغشاء: تركيز الأجسام المضادة بالقرب من الغشاء أقل بكثير من التركيز الأكبر. هنا، نقدم ابتكاراً يقلل بشكل كبير من فترات الحضانة هذه من خلال تحسين الربط المستضدي عن طريق استنزاف دوري وتجديد (CDR) من محلول الأجسام المضادة. كما استخدمنا تقنية تعزيز رد الفعل المناعي للحفاظ على حساسية الفحص. عزز مزيج من طريقة CDR مع عامل تحسين المناعة التجارية إشارة الإخراج وخفض بشكل كبير وقت حضانة الأجسام المضادة. يمكن إنجاز البقعة الغربية فائقة السرعة الناتجة في 20 دقيقة دون أي خسارة في الحساسية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على البقع الغربية باستخدام كل من chemiluminescent والكشف الفلورسنت. يسمح هذا البروتوكول البسيط للباحثين باستكشاف تحليل تعبير البروتين بشكل أفضل في العديد من العينات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البقعة الغربية (المعروفة أيضا باسم مناعي) هي تقنية قوية وأساسية عبر مجموعة واسعة من التخصصات العلمية والسريرية. وتستخدم هذه التقنية لدراسة وجود, وفرة النسبية, كتلة جزيئية نسبية, والتعديلات بعد تحويل البروتينات1. جنبا إلى جنب مع تحليل الصور الرقمية، يمكن لهذه الطريقة تحليل موثوق وفرة من البروتينات والتعديلات البروتين2. على الرغم من أن يتم تنفيذ لطخة الغربية بشكل روتيني، بل هو وسيلة تستغرق وقتا طويلا والعمل المكثف. يتطلب حضانة طويلة من الأجسام المضادة مع الأغشية. هنا، نحن وصف تعديل طريقة الحضانة التي تتغلب على هذا القيد دون التضحية الحساسية.

أثناء حضانة الغشاء ، تطفو الأجسام المضادة في محلول بينما يتم تثبيت المستضدات على الغشاء. بسبب تقاربها عالية، ومعدل للجسم المضاد ملزمة المستضد هو أسرع من انتشار الأجسام المضادة من المحلل السائبة إلى الغشاء. وهذا يخلق تركيز منخفض "طبقة استنزاف"(الشكل 1). قد يستغرق ساعات للأجسام المضادة أكثر بعدا للوصول إلى الغشاء عن طريق الانتشار السلبي، الذي هو العامل الرئيسي المسؤول عن أوقات الحضانة الطويلة في هذه التقنية. هذا التأثير يسمى قيود النقل الجماعي (MTL)3. وقد اقترح أن استنزاف المتكررة وتجديد حل الأجسام المضادة التي تحتوي على قد تعطل طبقة الاستنفاد والتغلب على MTL4. هنا ، قمنا بتصميم تقنية فريدة من نوعها تنفذ هذا المفهوم استنزاف وتجديد دوري (CDR) لتقليل تأثير MTL في بروتوكول النشاف الغربي التقليدي وتقصير فترة الحضانة المطلوبة بشكل ملاحظ.

من أجل الحفاظ على حساسية الكشف مع فترة حضانة قصيرة ، قمنا باستخدام تقنية تعزيز رد المناعة التي تسرع تفاعل مستضد الأجسام ، وبالتالي تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء5. العديد من العوامل المتاحة تجاريا تعزيز رد الفعل المناعي (IRE) تتكون من 2 مكونات (الحل 1 و 2، انظر جدول المواد). لم يتم الكشف عن تكوين الملكية أو آلية عمل IRE ، ولكننا وجدنا سابقا أن IRE انخفض ثابت الانفصام بين المستضد والأجسام المضادة في مرحلة صلبة ملزمة المستويات ، مما يدل على زيادة تقارب ، على الأقل جزئيا ، مسؤولة عن تعزيز تأثير IRE6. مزيج من CDR مع IRE ينتج بروتوكول النشاف الغربية فائقة السرعة التي تقلل من الوقت الإجراء بأكمله دون التضحية الحساسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SDS-PAGE ونقلها إلى غشاء PVDF

  1. قم بإجراء SDS-PAGE لفصل البروتينات بناءً على الحجم النسبي.
    ملاحظة: أي نظام هلام التجاري أو منزلي الصنع على ما يرام. الرجاء اتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. نقل البروتينات المنفصلة من هلام على غشاء PVDF.
    ملاحظة: طرق النقل الشائعة (شبه الجافة أو نقل الرطب) هي مناسبة. الرجاء اتباع بروتوكول الشركة المصنعة.

2. حجب أغشية PVDF

  1. احتضان الأغشية في مخازن منع مناسبة لمدة 1 ساعة مع التحريض في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: استناداً إلى الأجسام المضادة الأولية ونظام الكشف، يجب تحديد مخزن حظر مناسب. على سبيل المثال، فإن حاصرات الأكثر نموذجية هي BSA، والحليب الجاف غير الدهني، والكاسين، والبوليمرات الاصطناعية التجارية. برنامج تلفزيوني و / أو TBS مع 0.1٪ Tween20 هي المخازن الأكثر استخداما. قد يتم هذا الحظر خطوة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.

3. حضانة مع الأجسام المضادة الأولية

  1. إعداد 10٪ من العلاج المناعي تعزيز وكيل-1 حل (IRE-1) مع الماء المقطر. دوامة جيدا.
  2. إعداد الأجسام المضادة الأولية المخففة مع 10٪ IRE-1. امزجه بلطف ودقة.
  3. إذا كان استخدام غشاء أكبر (4 سم × 8 سم – 8 سم × 8 سم)، أضف 8 مل من محلول الأجسام المضادة إلى أنابيب أجهزة طرد مركزي مخروطية 50 مل. إذا كان استخدام غشاء أصغر (2 سم × 8 سم – 4 سم × 8 سم)، أضف 3 مل من محلول الأجسام المضادة إلى أنبوب البولي بروبلين دائري القاع 14 مل(جدول المواد).
  4. التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف محلول الحجب لفترة وجيزة. أدخل غشاء PVDF في هذا الأنبوب بأصابع قفازة وتأكد من أن الغشاء بأكمله يتمسك بجدار الأنبوب. عندما يتم إدخال غشاء PVDF في أنبوب، وجه "الجانب البروتين" من الغشاء الذي كان في الأصل في اتصال مع هلام الداخل. أغلق الغطاء بإحكام.
  5. أدخل أنبوب 50 مل في زجاجة فرن التهجين.
    ملاحظة: عندما يتم استخدام 14 مل أنابيب لهذه الحضانة، أدخل أنبوب 14 مل في أنبوب 50 مل، وذلك باستخدام زوج من أصحاب حلقة بلاستيكية للحفاظ على أنبوب الداخلية في وسط أنبوب 50 مل.
  6. بدوره على فرن التهجين.
  7. احتضان الغشاء مع دوران 6 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل.
    ملاحظة: تأكد من أن الغشاء يتمسك بالجدران في جميع الأوقات وأن الأنبوب (الداخلي) أفقي لتغطية الغشاء بمحلول الأجسام المضادة بالتساوي. معايرة تخفيف الأجسام المضادة ووقت الحضانة قبل التجربة الفعلية.

4. غسل الأغشية

  1. أوقفوا الدوران
  2. إزالة بعناية غشاء PVDF من الأنبوب مع ملاقط، ووضع الغشاء في وعاء مع 50 مل من برنامج تلفزيوني-T.
  3. شطف الغشاء لفترة وجيزة مع برنامج تلفزيوني-T.
  4. شطف الغشاء في الحاوية بالماء المقطر حتى لا تظهر فقاعات. هذا هو لإزالة غالبية الأجسام المضادة.
  5. نقل غشاء PVDF من الحاوية إلى سلطة الدوار التي تحتوي على 250 مل من برنامج تلفزيوني-T.
  6. ضع سلة المصفاة في الدوار. تأكد من أن الغطاء قد تم وضعه بشكل آمن.
  7. تفعيل الدوار وتشغيله لحوالي 20-30 s.
  8. تجاهل الحل وشطف لفترة وجيزة داخل الدوار مع الماء المقطر.
  9. إضافة 250 مل من برنامج تلفزيوني-T في الدوار مرة أخرى.
  10. كرر الخطوات 4.6 و 4.7.

5. حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية

  1. إعداد 10٪ من العلاج المناعي تعزيز وكيل-2 حل (IRE-2) مع الماء المقطر. دوامة جيدا.
  2. إعداد الأجسام المضادة الثانوية المخففة مع 10٪ IRE-2. امزجه بلطف ودقة.
  3. حدد حجم محلول الأجسام المضادة وأنبوب كما هو مذكور في الخطوة 3.3.
  4. التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف المحلول لفترة وجيزة. أدخل غشاء PVDF في الأنبوب كما هو مذكور في الخطوة 3.4.
  5. أدخل أنبوب 50 مل في زجاجة فرن التهجين.
  6. بدوره على فرن التهجين.
  7. احتضان الغشاء مع دوران 6 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق على الأقل. تأكد من أن الغشاء يتمسك الجدار في جميع الأوقات وأن الأنبوب (الداخلي) أفقي لتغطية الغشاء بالتساوي مع حل الأجسام المضادة.
    ملاحظة: معايرة وقت الحضانة قبل التجربة الفعلية. عندما يكون الجسم المضاد الثانوي مترافقاً بالفلورسنت، قم بإجراء الحضانة في الظلام.

6. غسل الأغشية

  1. اتبع الخطوات 4.1 إلى 4.10.

7. الحصول على صورة

  1. الكشف Chemiluminescent
    1. ضع قطعة من فيلم مرن شبه زراعة (10 سم × 15 سم) على سطح مستو.
    2. مزيج 2 مكونات الركيزة chemiluminescent في أنبوب 5 مل.
    3. نقل على الفور 1.5 مل من الركيزة المختلطة إلى فيلم مرن شبه زرع ووضع غشاء PVDF على ذلك. ثم، نقل بقية محلول الركيزة إلى الغشاء.
    4. احتضان غشاء PVDF مع الركيزة المختلطة على فيلم مرنة شبه شفافة لمدة 1 دقيقة.
    5. التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف محلول الركيزة لفترة وجيزة.
    6. شطيرة الغشاء بين زوج من أفلام الشفافية.
    7. الحصول على الصورة تحت وضع chemiluminescent.
  2. الكشف عن الفلورسنت
    1. التقط غشاء PVDF مع ملاقط واستنزاف المحلول لفترة وجيزة.
    2. شطيرة الغشاء بين زوج من أفلام الشفافية.
    3. الحصول على الصورة تحت وضع الفلورسنت.
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 7.1 و 7.2 على مقربة من آلة التصوير لضمان أقصى حساسية.
    4. عندما تكون إشارة الخلفية عالية، قم بإجراء خطوة غسيل في حاوية مع 80-100 مل من PBS-T: 10 دقيقة شطف 3 مرات للجسم المضاد الأساسي و 5 دقائق شطف 6 مرات للجسم المضاد الثانوي.
      ملاحظة: يمكن استخدام كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية المخففة مع حلول IRE 10٪ ما يصل إلى 8-10 مرات دون فقدان الحساسية6. يجب أن يبقى الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا المثال فعالية طريقة CDR مع تقنية المناعة على البقع الغربية. تم إجراء حضانة ثابتة على فيلم مرن شبه شفاف حيث تم احتضان أغشية PVDF مع محلول الأجسام المضادة ، في حين أن حضانة CDR كانت في فرن التهجين عن طريق تدوير الأنابيب التي تحتوي على الأغشية وحل الأجسام المضادة (Movie). ويبين الشكل 2 كميات من المستضد والأجسام المضادة، على التوالي، اللازمة للكشف عن الاجسام الكيميائية على البقع الغربية. في كل من حضانات ثابتة وCR، زاد استخدام حل IRE من الحساسية: خفض IRE أقل كمية من الخلايا (المستضد) الل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لطخة الغربية هي تقنية تحليلية تستخدم على نطاق واسع للكشف عن بروتينات محددة التي تم تطويرها ~ قبل 40 عاما7،8. ومنذ ذلك الحين، استمرت هذه التقنية في التطور، مع الابتكارات اللاحقة تحسين حساسية وسرعة، وكمية من تقنية2،9،10،11،12،13. تعزيز فائقة السرعة الغربية بروتوكول النش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أعلن أصحاب البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة ذات صلة مباشرة بمحتويات هذه المادة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل شعبة البحوث داخل الأمعاء، والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم، والمعاهد الوطنية للصحة. وقد تم دعم S.H. من قبل اليابان الشراكة بين القطاعين العام والخاص طالب دراسة في الخارج، وH.N. وK.Y. كانت من قبل منحة التدريب ما وراء البحار والمخدرات V.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
14 مل أنبوب اختبار PP ذو الوضوح العالي القاع المستدير ، متخرج ، مع Snap CapFalcon352059
Apollo Transparency Film لطابعات الليزرN / AN / Aأي نوع من أفلام شفافية طابعة الليزر على ما يرام.
Azure Imaging System 600Azure BiosystemsAzure 600أي نوع من أنظمة الحصول على الصور مناسب للكشف عن التلألؤ الكيميائي و/أو الفلورسنت.
يمكن الحصول على حل محسن التفاعل المناعي للإشارةTOYOBONKB-101
قرنفل الحليب الجاف الفوري الخالي من الدسمقرنفلN / A
ECL مضاد للفأر IgG ، بيروكسيداز الفجل مرتبط F (ab')2 جزء من الأغنامGE HealthcareNA9310V
ECL المضاد للأرانب IgG ، بيروكسيداز الفجل المرتبط F (ab')2 جزء من الحمارGE HealthcareNA9340V
HYBAID Micro-4N / AN / A أيفرن تهجين جيد طالما يتم تدوير الأنابيب بالتساوي في وضع أفقي.
غشاء Immobilon-P PVDF ، 0.45 وميكرو ؛ م حجم المسامMillipore SigmaIPVH304F0
IRDye 680RD الماعز المضاد للفأر IgG الأجسام المضادة الثانويةLICOR926-68070
IRDye 800CW الماعز المضاد للأرانب IgG الأجسام المضادة الثانويةLICOR926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent الركيزةseracare5430-0049
الفأر المضاد للأكتين المضادMillipore SigmaA5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS)LICOR927-40100Blocking Buffer للكشف عن الفلورسنت
OXO Salad SpinnerOXO32480V2Bأي دوار سلطة جيد طالما يتم شطف أغشية PVDF بقوة دون تمزق.
فيلم مانع التسرب ParafilmBemisParafilm M PM996فيلم مرن شبه شفاف
أغطية لولبية مسطحة من البولي إيثيلين ل 50 مل أنابيب الطرد المركزي السفلية المخروطيةFalcon352070
حلقات لعقد أنبوب 14 مل في وسط أنبوب 50 ملN / AN / Aأعدت في متجر ماكينات
أرنب مضاد 6X جسمه المضادAbcamab9108
Tween20ميليبور سيجماP2287

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
  2. Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
  3. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
  4. Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
  5. Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
  6. Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  8. Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
  9. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  10. Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
  11. Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852(2016).
  12. Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
  13. Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
  14. Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PVDF

مقالات ذات صلة