مقالة منهجية

إزالة الخلايا من البنكرياس البشري بدون منظفات لإنتاج المصفوفة خارج الخلية القابلة للذوبان (ECM)

DOI:

10.3791/61663

⸱

سبتمبر 4, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome, 5Wake Forest University College of Arts and Science, 6Wake Forest University School of Medicine, 7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشرح البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة خطوات تصنيع مصفوفة قابلة للذوبان خارج الخلية (ECM) من البنكرياس البشري. يمكن استخدام مسحوق ECM القابل للذوبان الذي تم الحصول عليه من خلال هذا البروتوكول لتلخيص البيئة الدقيقة لجزر البنكرياس في المختبر ، وربما في الجسم الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تصبح زراعة الجزر (ITx) معيار الرعاية في طب استبدال خلايا بيتا ، لكن نتائجها تظل أدنى من تلك التي تم الحصول عليها من خلال زراعة البنكرياس الكامل. تخضع البروتوكولات المستخدمة حاليا لعزل الجزر البشرية للتدقيق لأنها تستند إلى الهضم الأنزيمي للعضو ، حيث يتم هدم البنكرياس وفقدان اتصالاته بالجسم وتتلف الجزر بشكل لا رجعة فيه. يتميز تلف الجزيرة بعوامل حاسمة مثل تدمير المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والتي تمثل الإطار ثلاثي الأبعاد لمكانة الجزيرة والتي لا تتوافق فقدانها مع فيزيولوجيا الجزر. يقترح الباحثون استخدام السقالات القائمة على ECM المشتقة من بنكرياس الثدييات لمعالجة هذه المشكلة وتحسين بقاء الجزيرة ووظيفتها وعمرها في النهاية. الطرق المتاحة حاليا للحصول على مثل هذه السقالات قاسية لأنها تعتمد إلى حد كبير على المنظفات. وبالتالي ، نقترح طريقة جديدة خالية من المنظفات تخلق ضررا أقل في ECM ويمكن أن تحافظ على المكونات الهامة ل ECM للبنكرياس. تظهر النتائج أن بروتوكول إزالة الخلايا المطور حديثا سمح بتحقيق إزالة كاملة من الحمض النووي بينما تم الاحتفاظ بمكونات ECM. تم اختبار ECM الذي تم الحصول عليه من أجل السمية الخلوية وتغليفه بجزر البنكرياس البشرية التي أظهرت سلوكا خلويا إيجابيا مع إفراز الأنسولين عند تحفيزها بتحدي الجلوكوز. بشكل جماعي ، نقترح طريقة جديدة لإزالة الخلايا من البنكرياس البشري دون استخدام المنظفات الكيميائية الأيونية وغير الأيونية التقليدية. يمكن أن يكون هذا البروتوكول ووحدة التحكم في المحتوى التي تم الحصول عليها معه مفيدين لكل من التطبيقات المختبرية وفي الجسم الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل جزر البنكرياس هو عملية دقيقة يتم إجراؤها من خلال الهضم الأنزيمي للوصلات بين الجزر والبنية الداعمة المحيطة بها خارج الخلية. يعد هذا التدمير للمصفوفة خارج الخلية (ECM) أحد العوامل الحاسمة في توصيف تلف الجزر التي تحدث أثناء عمليات العزل1،2،3،4. ECM المحيط بالجزائر هو مكون أساسي لا خلوي في البنكرياس الغدد الصماء. يتكون من البروتينات والسكريات ، التي تتفاعل وتتتقاطع لتشكيل شبكة ثلاثية الأبعاد تدعم التوازن الفسيولوجي هيكليا وكيميائيا حيويا ، وتساعد في استجمام هذه البيئة الدقيقة في المختبر2،5،6. يتم التعرف على فقدان عمليات الإشارات الأساسية بين الجزر الصغيرة و ECM كأحد العوامل المساهمة ، مما يحد من بقاء الجزر في المختبر وفي الجسم الحي2،7،8،9،10.

تم استخدام ECM المشتقة من والإنسان على نطاق واسع لتلخيص البيئة الدقيقة لجزر البنكرياس11،12،13،14،15،16،17،18،19. نظرا لأن قدرة ECM على تعزيز ارتباط خلايا جزر الفئران ، والتكاثر ، والحفاظ على الثقافة على المدى الطويل تم الإبلاغ عنها لأول مرة في المرجع 20 ، فقد قدمت العديد من الدراسات الأخرى دليلا قويا على أن استعادة تفاعل ECM الأصلي مع الجزر البشرية يعزز وظيفة الجزيرة21،22. على سبيل المثال ، أظهرت البيانات الحديثة أن الجزر المغلفة ب ECM حسنت بشكل كبير التحكم في نسبة السكر في الدم في الفئران المصابة بالسكري ، مما يعزز ويسهل توصيل الأنسولين في منصة توصيل الأنسولين القائمة على الخلاياالجديدة 23. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات أن دمج المكونات الهامة ل ECM للبنكرياس يمكن أن يحسن بشكل كبير وظيفة الغدد الصماء للخلاياβ 24،25،26،27.

تعتمد بروتوكولات تصنيع ECM الموجودة في الأدبيات على تطبيق المنظفات الكيميائية ، على سبيل المثال ، Triton X-100 أو كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). على الرغم من توفير تصفية ممتازة للحمض النووي ، إلا أن المواد الكيميائية المستخدمة في عمليات إزالة الخلايا سامة للخلايا ومكلفة ، والبقايا الموجودة على الأنسجة منزوعة الخلايا تثير مخاوف في ضوء التطبيق السريري المحتمل.

بناء على هذه الملاحظات ، كانت أهداف هذه الدراسة ثلاثية الأبعاد: أولا ، تطوير طريقة إزالة الخلايا للبنكرياس البشري مع الحد الأدنى من استخدام المنظفات الكيميائية الأيونية أو غير الأيونية. ثانيا ، لإنتاج سقالة ECM قابلة للذوبان لزراعة الأنسجة. ثالثا ، لتوصيف ECM للبنكرياس من أجل تقييم سميتها الخلوية وتأثيرها على وظيفة الخلايا الجزرية. يعد التوصيف ضروريا لجميع التطبيقات القائمة على زراعة الخلايا ، لأنه يوضح أن ECM البنكرياس المذاب يمكن أن يكون مفيدا في تلخيص البيئة المكروية للبنكرياس للجزر المعزولة. موصوفة هنا هي طريقة فعالة وخالية من المنظفات لإزالة الخلايا للبنكرياس البشري ، وتوصيف ECM ، وتأثير ECM على بقاء ووظيفة جزر البنكرياس البشرية المعزولة المغلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على هذه الدراسة البحثية من قبل لجنة البحوث البشرية في مركز ويك فورست المعمداني الطبي. تم الحصول على البنكرياس البشري أخلاقيا من المتبرعين بالأعضاء من خلال خدمات مانحي كارولينا. تم فحص المتبرعين بالأعضاء بحثا عن الأمراض المعدية ذات الصلة بالبشر ، وفقا للوائح مكتب الأمم المتحدة في المكتب. تم استلام الأعضاء في محلول حفظ معقم حيث تم الاحتفاظ بها حتى الاستخدام. عند تسليمها إلى المختبر ، تم فحص جميع الأعضاء ، وتم جمع عينات من البنكرياس الأصلي لأغراض نسيجية. ثم تم تجميد الأعضاء وتخزينها في ظروف معقمة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.

1. التحضير الجراحي للبنكرياس البشري

ملاحظة: تم إذابة البنكرياس المجمد طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

  1. قبل البدء في التشريح الجراحي للبنكرياس البشري ، قم بإعداد 1 لتر من محلول الغسيل ، الذي يتكون من 950 مل من الماء منزوع الأيونات (dH2O) ، و 50 مل من الكاشف القائم على اليود و 1٪ محلول Pen / Strep.
  2. ارتد قفازات معقمة ومعطف مختبر أثناء التشريح الجراحي. قم بإجراء جميع العمليات الجراحية تحت غطاء بدرجة زراعة الخلايا لتجنب التلوث المحتمل.
  3. انقل البنكرياس من كيس النقل المعقم إلى حوض المشيمة المعقمة. تأكد من توجيه البنكرياس مع رأس العضو إلى اليسار والذيل إلى اليمين.
  4. قم بتشريح الاثني عشر بعناية من رأس البنكرياس باستخدام مقص معقم وملقط غير مسنن. احرص على عدم إحداث ثقب في الاثني عشر ، لأن هذا يزيد من فرص التلوث.
    ملاحظة: إذا تم عمل ثقب في الجهاز الهضمي ، فقم بتثبيت الفتحة بسرعة ، واستمر في التشريح.
  5. بمجرد اكتمال تشريح رأس البنكرياس ، تخلص من الاثني عشر في كيس مناسب للمخاطر البيولوجية واتبع الإرشادات المؤسسية للتخلص منه.
  6. قم بتشريح والتخلص من جميع الأنسجة خارج البنكرياس المتبقية حول رأس البنكرياس ، بما في ذلك الأوعية الدموية الرئيسية والقناة الصفراوية المشتركة ، والتي عادة ما يتم تمييزها في وقت شراء الأعضاء بخيوط غير قابلة للامتصاص. تخلص من المناديل باتباع الإرشادات المؤسسية.
  7. تشريح وتجاهل جميع الأنسجة خارج البنكرياس والأنسجة الدهنية المحيطة بذيل البنكرياس ، مما يؤدي إلى تعريض الأوعية الدموية الطحالية.
  8. بمجرد انكشاف العنقيق الوعائي للطحال ، قم بإزالة الطحال ، وتشريح الأوعية الدموية الطحالية بالكامل ، بما في ذلك تلك المرتبطة بالسطح الخلفي للبنكرياس (الشريان الطحال والوريد). تخلص من الطحال وقم بإزالة الأنسجة باتباع الإرشادات المؤسسية.
  9. قم بتشريح أي دهون خارج البنكرياس والتخلص منها بشكل مناسب ، وخاصة الدهون المحيطة بالبنكرياس.
    ملاحظة: على مستوى ذيل البنكرياس ، قد يكون خلف الصفاق مرئيا. يجب رفعها باستخدام ملقط غير مسنن ، وإزالتها وفقا لذلك باستخدام ملقط جراحي ، والتخلص منها بشكل صحيح. يجب أن يكون البنكرياس الآن خاليا من أي أنسجة خارج البنكرياس.
  10. قم بتشريح البنكرياس للحصول على مكعبات 1 سم3 من أنسجة البنكرياس باستخدام مقص جراحي أو شفرات نسيجية معقمة أو مشارط جراحية. ستخضع مكعبات أنسجة البنكرياس التي تم الحصول عليها بعد هذا التشريح لعملية إزالة الخلايا. يعتمد متوسط عدد مكعبات البنكرياس التي تخضع لإزالة الخلايا على الخصائص الجوهرية للعضو. في المتوسط ، خضع ما بين 40-60 مكعبا من البنكرياس لإزالة الخلايا في الدراسة المقدمة.
  11. انتقل إلى الخطوة 2.1

2. نزع الخلايا من أنسجة البنكرياس

ملاحظة: تم استخدام هذا البروتوكول مع البنكرياس بمتوسط وزن 100 غرام. لذلك ، لا ينصح بتجاوز هذا الوزن عند استخدام تقنية إزالة الخلايا هذه.

  1. ضع كل أنسجة البنكرياس التي تم تشريحها مسبقا في الخطوة 1.10 في وعاء بلاستيكي معقم (انظر جدول المواد) مع محلول الغسيل واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. قم بإزالة أنسجة البنكرياس بمساعدة ملقط معقم وضعه في وعاء معقم جديد يحتوي على ماء معقم منزوع الأيونات خال من السموم الداخلية. أغلق غطاء الحاوية بإحكام وضعه على شاكر مداري مبرد بدرجة حرارة محددة تبلغ 4 درجات مئوية وسرعة اهتزاز تتراوح بين 180-200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
  3. قم بإزالة الحاوية بأنسجة البنكرياس ونظف الجزء الخارجي بشكل مناسب قبل وضعها في الغطاء لمتابعة العملية.
  4. قم بإزالة أنسجة البنكرياس باستخدام ملقط جراحي وضعها في وعاء معقم جديد ، جنبا إلى جنب مع 1 لتر من الماء منزوع الأيونات ، و 50 مجم من DNase I ، و 0.0025٪ كلوريد المغنيسيوم. أغلق غطاء الحاوية بإحكام وضعه في شاكر مداري ، بدرجة حرارة محددة مسبقا تبلغ 37 درجة مئوية وسرعة اهتزاز تبلغ 100 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات.
  5. تحضير محلول EDTA-Trizma
    1. اجمع حاوية جديدة معقمة سعة 1 لتر ونظفها بشكل مناسب قبل إدخالها في الغطاء. لتحضير 1 لتر من محلول EDTA-Trizma ، أضف ما يلي: 985 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات ، و 7.5 مل من محلول Tris-HCl Buffer ، و 7.5 مل من محلول EDTA. قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  6. قم بإزالة الحاوية التي تحيط بأنسجة البنكرياس ونظف الجزء الخارجي بشكل مناسب قبل إدخاله في الغطاء لاستمرار العملية.
  7. قم بإزالة أنسجة البنكرياس بمساعدة ملقط جراحي وضعها في وعاء معقم جديد مع 1 لتر من محلول EDTA-Trizma. أغلق غطاء الحاوية بإحكام وضعه في شاكر مداري ، بدرجة حرارة محددة مسبقا تبلغ 4 درجات مئوية وسرعة اهتزاز تتراوح بين 180-200 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة.
  8. قم بإزالة الحاوية التي تحتوي على أنسجة البنكرياس ونظف الجزء الخارجي بشكل مناسب قبل إدخالها في الغطاء لهذه العملية.
  9. قم بإزالة أنسجة البنكرياس بمساعدة ملقط معقم وضعه في وعاء معقم جديد به ماء معقم منزوع الأيونات خال من السموم الداخلية. أغلق غطاء الحاوية بإحكام وضعه على شاكر مداري مبرد ، بدرجة حرارة محددة تبلغ 4 درجات مئوية وسرعة اهتزاز تتراوح بين 180 و 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: خلال فترة المعالجة هذه ، سيكون هناك تغيير ملحوظ في اللون ، حيث ستظهر الأنسجة أكثر إشراقا.
  10. اجمع أنسجة البنكرياس وقم بتخزينها في أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل ، لتصل إلى 25 مل كحد أقصى لكل أنبوب للتجميد والتجميد اللاحق. يختلف عدد أنابيب الطرد المركزي حسب حجم البنكرياس. تخزين العينات في -80 درجة مئوية.

3. إنتاج مسحوق ECM للبنكرياس - التجميد والطحن بالتبريد

  1. بعد ما لا يقل عن 24-40 ساعة من تخزين المواد منزوعة الخلايا عند -80 درجة مئوية ، انقل ECM البنكرياس إلى مجفف التجميد.
  2. انقل المواد المجمدة إلى مجفف تجميد ، مما يمنع المواد من الذوبان.
    ملاحظة: تستغرق خطوة التجميد حوالي 3-5 أيام اعتمادا على عدة عوامل ، مثل كمية المواد في كل أنبوب يخضع للعملية والسطح المعرض للتجميد بالتجميد يوصى بألا يتجاوز النسيج منزوع الخلايا مستوى 25 مل في كل أنبوب وأن يتم تجميد الأنابيب بزاوية 45 درجة ، مما يسمح بتعرض المزيد من السطح بسهولة بمجرد بدء التجميد بالتجميد. قم بإزالة الأغطية من الأنابيب.
  3. بعد التجميد ، انقل المواد إلى غطاء من فئة زراعة الخلايا.
  4. قطع كل قطعة من ECM المجفف إلى نصف حجمها باستخدام مقص معقم. ستخضع قطع ECM المجففة هذه لعملية طحن آلية لإنتاج مسحوق ECM. استخدم معالجا أوتوماتيكيا مطحنا بالتبريد لتجنب ارتفاع درجة الحرارة والتمسخ اللاحق للخصائص البيولوجية ل ECM. تأكد من ضبط إعداد آلة الطحن بالتبريد للحصول على مسحوق ناعم بعد عملية الطحن.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام البنكرياس من المتبرعين الذين لديهم مؤشر كتلة الجسم < 30. أظهر البنكرياس من المتبرعين الذين لديهم مؤشر كتلة الجسم > 30 ميلا لاحتواء المزيد من الدهون داخل المتني. لا تعتبر عملية التجميد مثالية وقد يتم تثبيطها بمحتوى الدهون. إذا كانت الأنسجة بعد التجفيد بالتجميد واضحة ، فيجب التخلص منها لأنها لن تكون مثالية لتصنيع مسحوق ECM.

4. إذابة ECM البنكرياس

ملاحظة: في هذه المرحلة ، من متوسط حجم البنكرياس (100 جم) ، يكون محصول مسحوق البنكرياس منزوع الخلايا 1-2 جم.

  1. تزن 1 جم من مسحوق ECM بمساعدة ملعقة بلاستيكية معقمة.
  2. تحقيق الذوبان باتباع البروتوكولات الموضحة سابقا: قم بإذابة 1 جم من ECM في 100 مل من 0.01 M HCl و 100 مجم من البيبسين لمدة 48 ساعة في RT مع التحريك المستمر28.
  3. بعد 48 ساعة ، استخدم هيدروكسيد الصوديوم لتحييد الرقم الهيدروجيني (الرقم الهيدروجيني = 7) ل ECM الحمضي مع الحفاظ على الدورق الذي يحتوي على ECM الحمضي على الجليد لتجنب الهلام.
    ملاحظة: تختلف حركية الهلام وفقا لدرجة الحرارة ومحتوى الكولاجين ودرجة الحموضة ومحلول التحييد. في هذه الدراسة البحثية ، تم استخدام 0.01 م من هيدروكسيد الصوديوم. كان حجم هيدروكسيد الصوديوم المضاف لتحييد الأس الهيدروجيني حوالي 100 مل. ضع في اعتبارك قياس الأس الهيدروجيني عدة مرات أثناء تحييد محلول ECM الحمضي.
  4. انقل محلول ECM المحايد إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل. أغلق الأنابيب وضعها في جهاز طرد مركزي. جهاز الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي على ECM القابل للذوبان بأقصى سرعة (12,000 × جم) لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، انقل الأنابيب إلى غطاء مزرعة الخلايا.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي للعينة ، سيتم ترسيب المكون غير القابل للذوبان في ECM في الجزء السفلي من الأنبوب ، بينما سيتم العثور على محلول ECM القابل للذوبان في الجزء العلوي في المادة الطافية.
  5. باستخدام تقنيات معقمة ، اجمع المادة الطافية للأنبوب الذي يحتوي على محلول ECM القابل للذوبان وقم بنقله إلى أنابيب جديدة سعة 50 مل ، بحد أقصى 25 مل لكل أنبوب.
  6. قم بتخزين أنابيب محلول ECM عند -80 درجة مئوية.

5. إنتاج مسحوق ECM للبنكرياس - التجميد والتخزين

  1. بعد 24-40 ساعة على الأقل من تخزين محلول ECM القابل للذوبان عند -80 درجة مئوية ، انقل الأنابيب إلى مجفف التجميد.
  2. انقل المواد المجمدة إلى مجفف تجميد ، مع التأكد من عدم ذوبان المادة.
    ملاحظة: تستغرق خطوة التجميد حوالي 3-5 أيام اعتمادا على عدة عوامل ، مثل كمية المواد في كل أنبوب يخضع للعملية والسطح المعرض للتجميد بالتجميد يوصى بألا يتجاوز محلول ECM المذاب مستوى 25 مل في كل أنبوب وأن يتم تجميد الأنابيب بزاوية 45 درجة للسماح بتعرض المزيد من الأسطح بسهولة بمجرد بدء التجميد بالتجميد. قم بإزالة الأغطية من أنبوب الصقر قبل التجميد بالتجميد.
  3. بعد التجفيد بالتجميد لمحلول ECM القابل للذوبان ، انقل المادة إلى غطاء من فئة زراعة الخلايا. بعد التجميد الكامل ، سيظهر مسحوق ECM ناعم.
    ملاحظة: العائد الذي تم الحصول عليه هو 700 مجم من 1 غرام من الأنسجة منزوعة الخلايا.
  4. قم بتخزين مسحوق ECM القابل للذوبان أو استخدمه لأغراض زراعة الخلايا.
    ملاحظة: ينصح بتخزين وحدة التحكم في المحرك عند 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري، وعند -20 درجة مئوية للاستخدام اللاحق، وعند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

6. توصيف ECM البنكرياس مع تلطيخ نسيجي

  1. اجمع قطعة من البنكرياس الأصلي بعد وقت قصير من تسليم العضو وقبل إزالة الخلايا. إصلاح هذا لمدة 24 ساعة في 10٪ فورمالين. اغسل العينات بالماء منزوع الأيونات. قم بتجفيفه في كحول متدرج قبل تضمينه في البارافين وتقطيعه إلى أقسام 5 مم.
  2. في نهاية عملية إزالة الخلايا ، اجمع عينة من المادة منزوعة الخلايا وقم بإصلاحها لمدة 24 ساعة في 10٪ فورمالين. اغسل العينة بالماء منزوع الأيونات. قم بتجفيفه في كحول متدرج قبل تضمينه في البارافين وتقطيعه إلى أقسام 5 مم.
  3. للتحقق من إزالة الخلايا بنجاح ، قم بإجراء تلطيخ H & E و DAPI على كل من البنكرياس الأصلي والنظير منزوع الخلايا.
  4. للتوصيف النسيجي ، قم بإجراء تلطيخ Masson's Trichrome (MT) و Alcian Blue (AB) ، والتي ستسلط الضوء على هياكل الكولاجين و GAGs ، على التوالي.

7. توصيف مسحوق ECM القابل للذوبان

  1. قم بإجراء محتوى الحمض النووي وتحليل الكولاجين الكلي لأنسجة البنكرياس الأصلية ومسحوق ECM القابل للذوبان كما هو موضحسابقا 29.
  2. تحديد كمية الجليكوزامينوجليكان الكبريتات (sGAG) بناء على البروتوكول الذي توفره مجموعة متوفرة تجاريا (انظر جدول المواد). استخدم مقياس الطيف الضوئي المجهري لقياس محتوى sGAG الكبريتات في ECM للبنكرياس بطول موجي 595 نانومتر30.
    ملاحظة: أبلغ عن محتوى الحمض النووي على أنه نانوغرام / ملغ من الأنسجة الجافة ومحتوى الكولاجين و GAGs على أنه ميكروغرام / مجم من الأنسجة الجافة.

8. تغليف الجزر البشرية مع ECM والثقافة

ملاحظة: تم الحصول على جزر البنكرياس البشرية تجاريا (انظر جدول المواد).

  1. عند الوصول ، يتم استزراع جزر البنكرياس البشرية في صفائح معالجة غير مزرعة الأنسجة لمدة 24 ساعة في حالة قياسية بكثافة تقريبية تبلغ 2,000 IEQ في كل صفيحة 10 سم.
  2. التلاعب بالجزر البشرية لاختبار تأثير ECM على وظائف الجزر وقابليتها للحياة باستخدام المجموعات التجريبية التالية: الجزر الحرة ، والجزر المغلفة في الجينات ، والجزر المغلفة في الألجينات ECM.
    ملاحظة: تم استزراع مجموعات الجزر المذكورة أعلاه في المختبر في ظروف قياسية لمدة تصل إلى 8 أيام لتقييم تأثير ECM على وظائف الجزر وقابليتها للبقاء.
  3. قم بوزن الجينات على ميزان وقم بتعليقه باستخدام HBSS في أنبوب الطرد المركزي من أجل الحصول على نسبة 1.5٪ (وزن / حجم). ضع أنبوب الطرد المركزي على دوار طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تم الإبلاغ عن وزن جزيئي بين 75-200 كيلو دالتون ونسبة جم / م تبلغ ≤ 1 من قبل الشركة المصنعة للجينات.
  4. قم بوزن 0.1 مجم من ECM وقم بتعليقه في 1 مل من الألجينات المحضر مسبقا من أجل الحصول على تركيز ECM 0.1 مجم / مل.
  5. تغليف جزر البنكرياس البشرية في الألجينات والألجينات ECM وفقا للبروتوكولالموصوف سابقا 31. ويرد وصف للإجراء باختصار أدناه.
    1. اجمع واخلط برفق 3,000 IEQ في 1 مل من الألجينات و 3,000 IEQ في 1 مل من الألجينات ECM بتركيز ECM يبلغ 0.1 مجم / مل تم إعداده مسبقا في الخطوة 8.4.
    2. قم بضخ المعلقات التي تم الحصول عليها من خلال جهاز تغليف الموائع الدقيقة المضبوطة على 0.2 مل / دقيقة ومعدل التدفق وضغط الهواء 2.0 باسكال ، على التوالي.
    3. عند الإنتاج ، اجمع الكبسولات الدقيقة في 100 ملي مولار من حمام CaCl2 مع 10 ملي مولار من HEPES. اسمح للجينات بالارتباط المتقاطع لمدة 10 دقائق.
    4. قبل الاستزراع ، اغسل الجزر المغلفة باستخدام HBSS في حالة قياسية ، لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    5. أضف وسائط الثقافة (انظر جدول المواد) وقم بتغيير ثلثي الوسائط كل يومين حتى نهاية التجربة.
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه لكل من الجزر في الجينات والجزر في الألجينات-ECM.
  6. في اليوم الثامن ، بعد التغليف ، قم بإجراء إفراز الأنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) وتحليل الحمض النووي لتقييم صلاحية إنتاج الأنسولين والجزر ، على التوالي.
  7. احصل على صور الحقل الساطع والتلوين الحي / الميت للجزر الحرة والمغلفة لتقييم مورفولوجيا الخلية وقابليتها للحياة.
    ملاحظة: تم إجراء تقييم نوعي للصور لتقييم صحة الجزر. تشمل المعلمات التي تؤخذ في الاعتبار شكل الجزر وحدودها وسلامتها وقطرها ، بالإضافة إلى وجود خلايا مفردة في الثقافة.

9. إطلاق الأنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) وقياس الحمض النووي

ملاحظة: في اليوم الثامن ، بعد التغليف ، تم جمع جزر البنكرياس البشرية واحتضانها باستخدام مخزن كرب المؤقت ، الذي يحتوي على تركيزات منخفضة (2.8 ملليمتر) وعالية (16.8 مليمتر) من الجلوكوز ، متبوعا بمحلول إزالة الاستقطاب KCl (25 ملليمتر). تم إجراء تحدي الجلوكوز من خلال تعديل بروتوكول موصوف سابقا32.

  1. أدخل راتنج ترشيح الهلام في أعمدة البولي بروبلين.
  2. أدخل مجموعات المعالجة (الجزر الحرة أو الجزر المغلفة) في الجزء الأوسط من راتنج ترشيح الهلام داخل أعمدة البولي بروبلين.
  3. ماصة الجلوكوز ومحاليل إزالة الاستقطاب في أعمدة البولي بروبلين الموضحة أعلاه واحتضانها لمدة 1 ساعة ، بالترتيب التالي: قم بإجراء فترة ما قبل الحضانة بمحلول جلوكوز منخفض المولارية ، ثم تابع سلسلة من الحضانات بمحلول جلوكوز منخفض ومرتفع ومنخفض ومزيل الاستقطاب كما هو مذكور في الملاحظة في بداية القسم 9.
  4. اجمع الوسط من كل مرحلة حضانة وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية لتحليله لاحقا.
  5. بعد حضانة وجمع محلول إزالة الاستقطاب ، احتضان جزر البنكرياس البشرية ب 1 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي وتخزينها حتى مزيد من التحليل.
  6. قم بقياس محتوى الأنسولين من حضانات الجلوكوز ومحلول إزالة الاستقطاب باستخدام مقايسة الأنسولين ELISA ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  7. قم بقياس محتوى الحمض النووي من المخزن المؤقت للاستخراج الذي تم جمعه في الخطوة 9.5 باستخدام مجموعة مقايسة الحمض النووي باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
  8. تطبيع قياسات الأنسولين وفقا لمحتوى الحمض النووي.

10. التحليل الإحصائي

ملاحظة: تشير مقارنات المجموعة إلى نفس الدفعة من الجزر البشرية مع n = 3 تقييم مستقل تم إجراؤه لكل اختبار موصوف في هذه المخطوطة. يتم التعبير عن القيم ب Mean ± SD.

  1. استخدم برنامجا إحصائيا لإجراء اختبار مان ويتني لتقييم تحليلات إزالة الخلايا وبقايا الحمض النووي ، ومقارنة البنكرياس الأصلي ، والبنكرياس منزوع الخلايا ، وECM الذوبان.
  2. قم بإجراء اختبار t غير متزاوج لتقييم الجليكوزامينوجليكان والكولاجين بين البنكرياس الأصلي والبنكرياس منزوع الخلايا وECM القابل للذوبان.
  3. قم بإجراء ANOVA ثنائي الاتجاه مع المقارنات المتعددة اللاحقة لتركيا لاختبار تحفيز الجلوكوز في تقييم تحفيز الجزر في اليوم 8.
  4. ضع في اعتبارك الدلالة الإحصائية عند < 0.05 مع تعيين * p < 0.05 و ** p<0.01 و ***p < 0.001 و **** p < 0.0001.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت معالجة عينات البنكرياس الأصلية وغير الخلوية من أجل تلوين نسيجي باستخدام H&E و MT و AB. أظهر تلطيخ H & E غياب تام للمواد والخلايا النووية ، مما يؤكد نجاح إزالة الخلايا. أظهرت صبغات MT و AB إطار ECM ، مع تسليط الضوء على المكونات الكولاجينية واللحمية نوعيا ، على التوالي (الشكل 1).

مكنت هذه الطريقة من التوليد المتسق لمسحوق ECM من البنكرياس البشري. أكدت اختبارات القياس الكمي للحمض النووي إزالة الخلاياالمرضية 33. تم توصيف ECM البنكريا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان الهدف من هذا العمل هو تطوير بروتوكول إزالة الخلايا اللطيف والخالي من المنظفات لإنتاج ECM للبنكرياس. تم إيلاء الاهتمام للحفاظ على مكونات ECM في حمة البنكرياس وتجنب التعرض الطويل للأنسجة للمنظفات الكيميائية الأيونية أو غير الأيونية التقليدية أثناء عملية إزالة الخلايا.

الجانب الأكثر ابتكارا في طريقة إزالة الخلايا المطورة هو تجنب المنظفات الكيميائية الأيونية وغير الأيونية الكلاسيكية. حددت تجربتنا السابقة مع إنتاج ECM للبنكرياسالبشري 11<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا توجد مصالح مالية متنافسة للإعلان عنها من قبل أي من المؤلفين المشاركين.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج Horizon 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 646272. تم الحصول على جزر البنكرياس البشرية من مختبرات برودو ، أليسو فيجو ، كاليفورنيا 92656.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
زجاجات تخزين البوليسترين من Corning سعة 1 لتر مع أغطية 45 مماستخدام حاوية ThermoFisher430518لإزالة الخلايا
مطحنة مبردةSPEX Certiprep6870-230
Deoxyribonuclease I من بنكرياس البقرSigma AldrichDN25
الماء المقطرThermoFisher15230147
Falcon 50 مل مخروطي أنابيب الطرد المركزيCorning352070
البنكرياس البشري
إليساميركوديا10-1113-01
كلوريد المغنيسيوم ، 1 متر ، معقمBio-World41320004-1
البيبسين من الغشاء المخاطي للمعدة الخنازيرSigma AldrichP7012-5G
حوض المشيمة بدون غطاء ،معقم DeRoyal32-881
أنابيب كروماتوغرافيا بوليبريBio-rad731-1500أعمدة البولي بروبلين
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitInvitrogenP7589DNA
Kit عينةPrep ملحق فريزر / مطحنة كبيرة السعةSPEX6801مجموعة قارورة طحن كبيرة
Sephadex G-10 حباتCytiva17001001هلام الترشيح الراتنج
طقم جراحيفي
UltraPur 0.5M EDTA ، درجة الحموضة 8.0ThermoFisher15575020
UltraPur 1 M Tris-HCI Buffer ، درجة الحموضة 7.5ThermoFisher15567027< / em>
UltraPure THERMOFisher الماء المقطر الخالي من DNase / RNase10977023
والأنسولين

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korpos, E., et al. The peri-islet basement membrane, a barrier to infiltrating leukocytes in type 1 diabetes in mouse and human. Diabetes. 62 (2), 531-542 (2013).
  2. Daoud, J., Petropavlovskaia, M., Rosenberg, L., Tabrizian, M. The effect of extracellular matrix components on the preservation of human islet function in vitro. Biomaterials. 31 (7), 1676-1682 (2010).
  3. Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S., Maysinger, D. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
  4. Paraskevas, S., Maysinger, D., Wang, R., Duguid, T. P., Rosenberg, L. Cell loss in isolated human islets occurs by apoptosis. Pancreas. 20 (3), 270-276 (2000).
  5. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  6. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  7. Kuehn, C., Vermette, P., Fulop, T. Cross talk between the extracellular matrix and the immune system in the context of endocrine pancreatic islet transplantation. A review article. Pathologie Biologie (Paris). 62 (2), 67-78 (2014).
  8. Irving-Rodgers, H. F., et al. Pancreatic islet basement membrane loss and remodeling after mouse islet isolation and transplantation: impact for allograft rejection. Cell Transplant. 23 (1), 59-72 (2014).
  9. Tomei, A. A., et al. Device design and materials optimization of conformal coating for islets of Langerhans. Proceedings of the National Academy Science U. S. A. 111 (29), 10514-10519 (2014).
  10. Miao, G., et al. Basement membrane extract preserves islet viability and activity in vitro by up-regulating alpha3 integrin and its signal. Pancreas. 42 (6), 971-976 (2013).
  11. Peloso, A., et al. The human pancreas as a source of protolerogenic extracellular matrix scaffold for a new-generation bioartificial endocrine pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
  12. Salvatori, M., et al. Extracellular Matrix Scaffold Technology for Bioartificial Pancreas Engineering: State of the Art and Future Challenges. Journal of Diabetes Science and Technology. 8 (1), 159-169 (2014).
  13. Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
  14. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2017).
  15. Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Science Reports. 8 (1), 10452(2018).
  16. Jiang, K., et al. 3-D physiomimetic extracellular matrix hydrogels provide a supportive microenvironment for rodent and human islet culture. Biomaterials. 198, 37-48 (2019).
  17. Citro, A., et al. Biofabrication of a vascularized islet organ for type 1 diabetes. Biomaterials. 199, 40-51 (2019).
  18. Hashemi, J., et al. Application of a novel bioreactor for in vivo engineering of pancreas tissue. Journal of Cell Physiology. 233 (5), 3805-3816 (2018).
  19. Guruswamy Damodaran, R., Vermette, P. Decellularized pancreas as a native extracellular matrix scaffold for pancreatic islet seeding and culture. Journal of Tissue Engineering and Regeneration Medicine. 12 (5), 1230-1237 (2018).
  20. Thivolet, C. H., Chatelain, P., Nicoloso, H., Durand, A., Bertrand, J. Morphological and functional effects of extracellular matrix on pancreatic islet cell cultures. Experimental Cell Research. 159 (2), 313-322 (1985).
  21. Llacua, L. A., Faas, M. M., de Vos, P. Extracellular matrix molecules and their potential contribution to the function of transplanted pancreatic islets. Diabetologia. 61 (6), 1261-1272 (2018).
  22. Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
  23. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2016).
  24. Hadavi, E., et al. Microwell Scaffolds Using Collagen-IV and Laminin-111 Lead to Improved Insulin Secretion of Human Islets. Tissue Engineering Part C Methods. 25 (2), 71-81 (2019).
  25. Crisostomo, J., et al. ECM-enriched alginate hydrogels for bioartificial pancreas: an ideal niche to improve insulin secretion and diabetic glucose profile. Journal of Applied Biomaterial and Functional Mater. 17 (4), 2280800019848923(2019).
  26. Davis, N. E., et al. Enhanced function of pancreatic islets co-encapsulated with ECM proteins and mesenchymal stromal cells in a silk hydrogel. Biomaterials. 33 (28), 6691-6697 (2012).
  27. Carlo, D. Pancreatic acellular matrix supports islet survival and function in a synthetic tubular device: In vitro and in vivo studies. International Journal of Molecular Medicine. 25 (2), (2009).
  28. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  29. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
  30. Afara, I. O., Prasadam, I., Arabshahi, Z., Xiao, Y., Oloyede, A. Monitoring osteoarthritis progression using near infrared (NIR) spectroscopy. Science Reports. 7 (1), 11463(2017).
  31. Tendulkar, S., et al. A scalable microfluidic device for the mass production of microencapsulated islets. Transplantation Protocol. 43 (9), 3184-3187 (2011).
  32. Fraker, C. A. The Role of Oxygen During In Vitro Culture and Immunoisolation of Islets of Langerhans. University of Miami. , PhD Thesis (2011).
  33. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  34. Edgar, L., et al. Utility of extracellular matrix powders in tissue engineering. Organogenesis. , 1-15 (2018).
  35. Katari, R., et al. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 325-347 (2017).
  36. Peloso, A., Katari, R., Tamburrini, R., Duisit, J., Orlando, G. Glycosaminoglycans as a measure of outcome of cell-on-scaffold seeding (decellularization) technology. Expert Reviews on Medical Devices. 13 (12), 1067-1068 (2016).
  37. Pineda Molina, C., Lee, Y. C., Badylak, S. F. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , 527-536 (2020).
  38. Thomas, F. T., et al. Anoikis, extracellular matrix, and apoptosis factors in isolated cell transplantation. Surgery. 126 (2), 299-304 (1999).
  39. Kenmochi, T., et al. Improved quality and yield of islets isolated from human pancreata using a two-step digestion method. Pancreas. 20 (2), 184-190 (2000).
  40. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  41. Stendahl, J. C., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Extracellular matrix in pancreatic islets: relevance to scaffold design and transplantation. Cell Transplant. 18 (1), 1-12 (2009).
  42. de Vos, P., et al. Enzymes for Pancreatic Islet Isolation Impact Chemokine-Production and Polarization of Insulin-Producing beta-Cells with Reduced Functional Survival of Immunoisolated Rat Islet-Allografts as a Consequence. PLoS One. 11 (1), 0147992(2016).
  43. Smink, A. M., de Vos, P. Therapeutic Strategies for Modulating the Extracellular Matrix to Improve Pancreatic Islet Function and Survival After Transplantation. Current Diabetes Report. 18 (7), 39(2018).
  44. Orlando, G., Soker, S., Stratta, R. J. Organ bioengineering and regeneration as the new Holy Grail for organ transplantation. Annals of Surgery. 258 (2), 221-232 (2013).
  45. Orlando, G., et al. Rethinking Regenerative Medicine From a Transplant Perspective (and Vice Versa). Transplantation. 103 (2), 237-249 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production
Posted by JoVE Editors on 12/10/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

الوسوم

DNA
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة